ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA
HOÀNG LIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------


Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA
HOÀNG LIÊN

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC



CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

3

1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens

3

1.1.2. Lịch sử phát hiện

4

1.1.3. Phân loại

5

1.1.4. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên

5

1.2. ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

5



13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15

2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG

15

2.2. NGUYÊN LIỆU

15

2.2.1. Chủng vi sinh vật

15

2.2.2. Môi trường

15

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

16

2.3.1. Nuôi cấy giống khởi động

16


28
28

3.1.1. Tuyển chọn chủng

28

3.1.2. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA

28

3.1.3. Cây phân loại dựa trên trình tự đa gen

29


3.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901

30

3.2.1. Đặc điểm hình thái

30

3.2.2. Đặc điểm sinh học của chủng SP 1901

31

3.3. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME NGOẠI BÀO



3.4.3. pH tối ưu

48

3.4.4. Khả năng bền axít

49

3.4.5. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất

50

3.4.6. Sắc ký lớp mỏng

51

KẾT LUẬN

53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

54

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của chủng SP 1901 ở các nhiệt độ khác nhau.

33



Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide………

13


Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn theo thang BSA……………………………….

21

Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose……………………………..

22

Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose…………………………….

23

Hình 2.4. Đồ thị đường chuẩn theo thang L-tyrosine…………………………

24

Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập tại
rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn B. subtilis dựa trên
phân tích trình tự 16S rDNA………………………………….…………..
28
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm B.
subtilis………………………………….……………………………………..
30
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào khi nhuộm

Hình 3.12. Hoạt tính amylase và protease của chủng SP 1901 trên môi trường
có bổ sung CMC và glucose và môi trường NA dịch thể……………………
40


Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….……………
41
Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel DEAE Sepharose………………………………….…………
42
Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….……………
42
Hình 3.16. Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

43

Hình 3.17. Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

44

Hình 3.18. Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

44

Hình 3.19. Điện di SDS-PAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36……………………

45


DNA

Deoxyribonucleic axít

DNS

Dinitrosalicylic

IAA

Indole-3-acetic axít

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic axít

SDS

Sodium dodecyl sulfate


ĐẶT VẤN ĐỀ

(ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng
vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dưới loài.


(iii)
Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn được lựa
chọn.
(iv)
Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của
chủng vi khuẩn nghiên cứu.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.

VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

1.

Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis
[45]. B. subtilis được Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835, tên
của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Năm 1872, nhà sinh học
người Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis.
Trong thế chiến thứ hai, tổ chức y học Nazi (Đức) đã dùng B. subtilis để phòng
bệnh lị cho các binh lính chiến đấu ở Bắc Phi. Từ đó đến nay, B. subtilis đã được
nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên Thế giới. Thuật ngữ “Subtilis therapy” (điều trị
bằng subtilis) ra đời từ đó và B. subtilis ngày càng được sử dụng rộng rãi để phòng
ngừa và điều trị các loại bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột,

nhóm này đã được phân tách thành các loài phụ như B. subtilis được phân thành B.
subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp.
inaquosorum; B. amyloliquefaciens được phân thành B. amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [42].
Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens
nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phương pháp phân loại hiện đại. Hiện
nay ở Việt Nam hầu như chưa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính xác một
loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dưới loài dựa trên việc
phân tích trình tự đa gen.
2.

Lịch sử phát hiện

B. amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng
sinh α-amylase và protease. Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chưa được xếp loại
trong bảng Danh pháp Vi khuẩn. Cho đến năm 1975, theo điều 24a và 28a trong Bộ
luật Quốc tế về Danh pháp Vi khuẩn thì cái tên B. amyloliquefaciens mới được công
bố [43].
Thời gian đầu, loài vi khuẩn này được xem là dòng khác của B. subtilis hay
loài phụ B. subtilis subsp. amyoliquefaciens. B. amyloliquefaciens mang rất nhiều
đặc điểm tương đồng với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus. Bằng
các phương pháp phân loại thông thường rất khó để phân biệt giữa chúng. Đến năm
1987, B. amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả
lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5% so với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B.
pumilus [43].
Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh
thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã được công bố. Năm 2010, Borriss và
cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen bằng
kỹ thuật microarray, tính tương đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt



Bacillaceae

Chi:

Bacillus

Nhóm:

Bacillus subtilis

Loài:

Bacillus amyloliquefaciens

Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên

B. amyloliquefaciens thường có mặt trong các mẫu đất tự nhiên. Đây là loài
vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dương, sinh nội bào tử, có khả năng di động và
kích thước tế bào 3,0-4,0 × 0,7-1,5 µm. Đặc biệt, có một số chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23].
2.

ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

5.

Sản xuất enzyme công nghiệp

Loài vi khuẩn này được biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các loại

Bacylicin là chất dipeptide được tạo nên từ L-analine và một amino axít hiếm Lanticapsin. Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia amylovora gây bệnh
cháy lá trên táo và lê. Surfactin hoạt động như chất tẩy rửa trên màng tế bào. Chất
này có tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng viêm. Iturin, fengycin và
bacillomycin là các lipopeptide vòng có tính kháng nấm gây bệnh cây. Nghiên cứu
gần đây cho thấy, một số chất peptide giống iturin từ B. amyloliquefaciens có khả
năng diệt Paenibacillus larvae gây bệnh trên ong mật [22]. Difficin là chất kháng
sinh phổ rộng, chất này ức chế quá trình tổng hợp protein và có khả năng ức chế
Erwinia amylovora. Bacillaene cũng là một chất ức chế tổng hợp protein ở tế bào
prokaryotes. Macrolactin là một chất kháng khuẩn Gram dương.
7.

Sản xuất phân bón vi sinh

Một số chủng B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh trên rễ cây thực vật
có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng Indole-3-acetic axít (IAA). Chất này sẽ
tác động tích cực đến những quá trình sinh lý của thực vật như quang hướng động,
địa hướng động, ưu thế chồi ngọn và sự tượng rễ. Yao và cộng sự (2012) đã thử
nghiệm bổ sung chế phẩm chứa vi khuẩn B. amyloliquefaciens FZB24 lên cây bông.


Kết quả cho thấy, sản lượng bông thu hoạch được tăng 30% so với đối chứng bổ
sung đạm NPK [56]. Trong nghiên cứu Idris và cộng sự (2007), tác giả đã thử khả
năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic axít của chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens FZB42 lên bèo tấm. Kết quả cho thấy, trọng lượng tươi của bèo
tấm khi thu hoạch có sự gia tăng đáng kể so với đối chứng. Loài vi khuẩn B.
amyloliquefaciens đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân
bón vi sinh nhờ khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kích thích sinh trưởng
thực vật [31].
8.


kết β-1,4, trong khi tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác gồm các
monomer D-xylose nối với nhau bằng liên kết β-1,3. Thông thường, xylan chiếm
khoảng 15-30% trọng lượng khô của cây hạt kín và khoảng 7-15% của cây hạt trần.
Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lượng khô của chúng
[35].
Do xylan có cấu trúc không đồng nhất, để thủy phân cấu trúc này cần phải có
hệ thống enzyme xylanolytic. Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động tương
hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đường [34].
1.3.1.2. Nguồn sản sinh xylanase
Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật
nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi
khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57].
Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ưa kiềm có khả năng
chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn
trong công nghiệp [39].
1.3.1.3. Đặc tính hoạt động của xylanase
Axít glutamic là axít amin quyết định sự hoạt động của xylanase [10]. Sự
thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống
enzyme xylanolytic (hình 1.1.).

Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể như


sau:
• β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase
Enzyme β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase là hai enzyme có vai trò
chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan. Trong đó, β -1,4-endoxylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic axít esterase tấn
công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các xylooligosaccharide. Hai
enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật sinh
ra, chẳng hạn như các loài thuộc Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum,

giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [11].
Xylan là chất xơ khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong thức
ăn chăn nuôi. Vì thế việc bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn của gia súc và gia cầm
sẽ giúp chúng dễ tiêu hóa và dễ hấp thụ thức ăn, đồng thời góp phần làm giảm ô
nhiễm môi trường.
10.

α-amylase

1.3.2.1. Cấu tạo tinh bột và glycogen
Cơ chất tác dụng của amylase và tinh bột và glycogen. Tinh bột là nhóm
carbohydrate ở thực vật. Chúng có chủ yếu ở trong các loại củ và hạt như khoai
lang, khoai tây, sắn, củ mì và các loại hạt ngũ cốc. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau
đều có cấu tạo từ 20-30% amylose và 70-80% amylopectin.
Amylose được cấu tạo từ 200-1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên
kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch dài không phân nhánh. Amylopectin được
cấu tạo từ 600-6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và
α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh.


Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin [14].
Glycogen được ví như tinh bột của động vật. Glycogen có cấu tạo giống với
tinh bột nhưng mức độ phân nhánh mạnh hơn. Cấu tạo của chúng gồm các phân tử
glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside. Ở các vị trí phân nhánh glucose
nối với nhau băng liên kết α-1,4-glucoside. Glycogen có ở động vật và người,
chúng tập trung chủ yếu ở gan.
1.3.2.2. Nguồn sản sinh α-amylase
Amylase là hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Vi khuẩn và nấm sợi là
những nhóm sinh amylase chính. Amylase của vi khuẩn có ưu điểm chịu nhiệt tốt
hơn của nấm sợi, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ 85-95oC [34].

1.3.2.4. Ứng dụng của α-amylase
Với khả năng thủy phân tinh bột nên α-amylase đã được con người sử dụng
từ rất sớm. Trong công nghiệp thực phẩm, người ta thường bổ sung α-amylase vào
bột chế biến trong quá trình sản xuất bánh kẹo. Hoạt động của α-amylase sẽ làm
tăng lượng đường khử, lượng đường khử này sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa
khử. Kết quả của quá trình đó sẽ tạo cho bánh kẹo có mùi vị và màu hấp dẫn [2].
Cả α-amylase và β-amylase đều được sử dụng trong sản xuất bánh mì. Các
loại enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đường, nhờ đó nấm men
Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn và CO 2, làm
tăng thể tích, tạo ra màu sắc và mùi vị tốt cho bánh [2].
Trong sản xuất bia, các nhà sản xuất thường sử dụng α-amylase có trong
mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có sẵn trong đó. Cồn công nghiệp được sản


xuất bằng phương pháp lên men. Cồn được lên men từ nguyên liệu chứa đường
hoặc từ nguyên liệu chứa carbohydrate. Trong đó, α-amylase đóng vai trò chuyển
hóa tinh bột để tạo thành dextrin [15].
11.
Protease
Protease là nhóm các enzyme có khả năng phân giải các liên kết peptide
trong phân tử protein tạo thành các đơn vị nhỏ như các đoạn peptide hay các phân
tử amino axít [5].

Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide [34].
1.3.3.1. Nguồn sản sinh protease
Protease được sản xuất chủ yếu từ 3 nguồn chính là động vật, thực vật và vi
sinh vật. Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất và là nguồn
nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp [16]. Ngày
nay, hướng sản xuất enzyme từ vi sinh vật đang dần thay thế enzyme từ động vật và
thực vật bởi: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, enzyme được tách chiết từ vi

collagen. Quá trình đó đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm
dẻo nhất định.
Ngoài ra, protease còn được phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme
được bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng khả năng tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn
trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG
Các thiết bị và máy móc của bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Viện Vi
Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
• Máy đọc trình tự ADN 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied
Biosystem, Mỹ).
• Máy khuếch đại gen Gene Amp PCR System 9700 (Eppendorf,
Mỹ).
• Máy ly tâm lạnh Centrifuge C30P (Satorius Group, Đức).
• Máy đo quang phổ UV 1600(Thermo, Mỹ).
• Máy lắc ổn nhiệt (B.Braun, Mỹ).
• Kính hiển vi (Olympus, Nhật).
• Máy ly tâm 6K15 (Sigma, Đức).
• Máy ly tâm Centrifuge 5417R (Eppendorf, Đức).
• Bộ chạy điện di đứng cho protein (Biorad, Mỹ).
• Máy lọc tiếp tuyến 17525-001 (Sartorius Stedim, Mỹ).
2.

NGUYÊN LIỆU

1.

Chủng vi sinh vật


đêm trên môi trường NA dịch thể ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
4.

Phân tích trình tự đa gen

2.3.2.1. Tách chiết DNA của vi khuẩn
Phương pháp tách chiết DNA của vi khuẩn được thực hiện theo Sakiyama và
cộng sự (2009) [46]. Vi khuẩn đuợc nuôi trên môi trường dịch thể với thời gian
thích hợp. Sau đó hút 1,5 ml dịch vào ống eppendorf và ly tâm ở 15.000 v/p trong
15 phút để lấy sinh khối tế bào. Hòa sinh khối tế bào trong 100 µl TAE. Thêm 0,4
mg lysozyme rồi trộn đều, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Thêm 100 µl SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút, ủ ở 37oC trong 30 phút.
Thêm một thể tích tương đương phenol : chloroform : isoamyl alcohol, trộn đều. Ly
tâm 15.000 v/p trong 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendorf khác.
Bổ sung 8 µl RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút. Thêm 12 µl
proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ ở 56 oC trong 15 phút. Tiếp tục thêm 1/10 thể
tích natri acetate 3M và 1 ml ethanol 100% rồi trộn đều. Đặt hỗn hợp trong đá 30
phút.
Ly tâm hỗn hợp 15.000 v/p trong 15 phút. Hút bỏ lớp dịch trên, rửa phần tủa
bằng ethanol 70%. Làm khô phần tủa bằng máy cô quay chân không. Hoà tan tủa
trong 50-100 µl nước MQ hoặc đệm TAE.
2.3.2.2. Phản ứng khuếch đại DNA
Thành phần phản ứng khuếch đại DNA bao gồm 10 µl đệm PCR 10x, 10 µl
dNTP 2 mM, 2 µl mồi xuôi, 2 µl mồi ngược, 2 µl tag polymerase, 1-2 µl DNA
khuôn và bổ sung H2O đến thể tích tổng là 25 µl.
Trình tự cặp mồi đã sử dụng (xem phụ lục B).
Chu trình nhiệt của của phản ứng này bao gồm 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3
bước: (i) gây biến tính DNA bằng cách đun hỗn hợp ở 95 oC trong 30 giây, (ii) sau