Số hóa bởi trung tâm học liệu
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
VI THỂ CỦA HẠT TOPHI-GÚT TRONG MỐI LIÊN QUAN
VỚI CÁC CHỈ SỐ HÓA SINH CỦA BỆNH NHÂN GÚT LÀ
NGƯỜI VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
Thái Nguyên - 2013
Số hóa bởi trung tâm học liệu
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bệnh Gút đƣợc biết đến khá sớm trong lịch sử y học của con ngƣời. Bệnh
thƣờng phổ biến ở những ngƣời lớn tuổi [16][20]. Tuy nhiên tỷ lệ mắc bệnh Gút
ở nam thƣờng cao hơn ở nữ, nồng độ oestrogens sinh lý là yếu tố giúp thải urat
qua nƣớc tiểu vì thế nó làm thấp nguy cơ mắc bệnh Gút ở nữ [16]. Gút là một
hội chứng, nhiều khi là bệnh cụ thể liên quan đến rối loạn quá trình chuyển hóa
axit uric trong cơ thể. Có thể nói nguyên nhân trực tiếp gây bệnh Gút là sự tăng
quá mức và kéo dài nồng độ axit uric trong máu. Axit uric đƣợc thải ra ngoài
chủ yếu theo đƣờng thận qua nƣớc tiểu và một phần qua phân [22].
Vì một lý do nào đó, hàm lƣợng purin trong cơ thể tăng và quá trình
chuyển hóa chúng thành axit uric cũng tăng. Khi cơ thể có lƣợng axit uric vƣợt
quá mức bình thƣờng hoặc sự thải axit này ra nƣớc tiểu quá ít thì nồng độ axit
- Thực hiện nghiên cứu thành phần vi thể của hạt tophi Gút bằng phƣơng pháp
lát cắt cho hiển vi quang học.
- Thực hiện nghiên cứu thành phần hoá học của các hạt tophi-Gút bằng
phƣơng pháp phân tích hoá học - sinh học trong phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Sử dụng đặc điểm về thành phần hóa sinh học, mô học của hạt tophi làm
căn cứ khoa học tìm ra các phƣơng pháp phòng, chẩn đoán và điều trị bệnh Gút
hiệu quả.
Số hóa bởi trung tâm học liệu
3
Chƣơng1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về bệnh Gút
1.1.1. Khái niệm về bệnh Gút
Gút là một trong những bệnh lý đƣợc phát hiện rất sớm. Đến những năm
60 của thế kỷ XX, các nhà khoa học đã nghiên cứu sâu hơn về sinh học tế bào,
cơ chế sinh lý bệnh của tình trạng tăng axit uric máu và khẳng định Gút là một
bệnh lý do rối loạn chuyển hóa gây ra bởi tình trạng lắng đọng các tinh thể urat
ở các mô của cơ thể do tăng axit uric trong máu [10], [22].
1.1.2. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh
* Nguyên nhân gây bệnh:
Ở ngƣời bình thƣờng, lƣợng axit uric trong máu đƣợc duy trì ở mức ổn
định khoảng từ 180 - 420 µmol/l theo tiêu chuẩn của Bennet - Wood năm 1968
tại Mỹ. Vì một lý do nào đó, hàm lƣợng purin trong cơ thể tăng, quá trình
chuyển hóa chúng thành axit uric tăng. Khi cơ thể tạo ra quá nhiều axit uric hoặc
thải axit này ra nƣớc tiểu quá ít thì nồng độ axit uric trong máu tăng lên, sự
chuyển hóa axit uric thành muối urat tăng theo dẫn tới sự lắng đọng những tinh
thể bệnh Gút. Thể bệnh Gút cấp tính, quá trình viêm diễn biến trong một thời
gian ngắn rồi chấm dứt, hay tái phát. Thể bệnh Gút mạn tính quá trình lắng đọng
urat nhiều và kéo dài, biểu hiện viêm sẽ liên tục không ngừng [7], [10], [15].
1.1.3. Một số triệu chứng lâm sàng của bệnh
1.1.3.1. Triệu chứng của bệnh Gút cấp tính
Gút cấp tính biểu hiện điển hình bằng những đợt viêm cấp tính. Cơn viêm
cấp của bệnh thƣờng xuất hiện sau một số hoàn cảnh thuận lợi nhƣ: sau một bữa
ăn nhiều rƣợu thịt; sau chấn thƣơng hoặc phẫu thuật; sau lao động nặng, đi lại
nhiều, đi giầy quá chật; sau những sang chấn về tinh thần nhƣ quá xúc động,
Số hóa bởi trung tâm học liệu
5
cảm động, quá căng thẳng, lo lắng…; nhiễm khuẩn cấp; sau khi dùng một số
thuốc nhƣ lợi tiểu nhóm chlorothiazid, tinh chất gan, vitamin B12, steroid [7],
[10], [22].
* Triệu chứng lâm sàng cơn Gút cấp tính:
- Khoảng 60-70% cơn Gút cấp biểu hiện ở khớp bàn ngón chân cái.
- Đang đêm bệnh nhân thức dậy vì đau ở khớp bàn chân cái (một bên), đau
dữ dội ngày càng tăng, đau không thể chịu nổi, chỉ một va chạm nhẹ cũng gây
đau tăng.
- Ngón chân sƣng to, phù nề, căng bóng, nóng đỏ, xung huyết, trong khi
các khớp khác bình thƣờng.
- Toàn thân: sốt nhẹ, mệt mỏi, lo lắng, mắt nổi tia đỏ, khát nƣớc nhiều, táo
bón, tiểu tiện ít và đỏ.
- Đợt viêm kéo dài từ vài ngày đến hai tuần (trung bình là 5 ngày), đêm đau
nhiều hơn ngày, viêm nhẹ dần, đau giảm, phù bớt, da tím dần, hơi ƣớt; ngứa nhẹ
rồi bong vẩy và khỏi hẳn, không để lại dấu vết gì ở chân. Bệnh có thể tái phát
vài lần trong một năm, thƣờng hay gặp vào mùa xuân hoặc mùa thu [7], [10],
[22].
* Xét nghiệm và X quang:
- Nổi cục u (tophi): là hiện tƣợng lắng đọng urat ở xung quanh khớp, ở
màng hoạt dịch, đầu xƣơng, sụn
+ Vị trí: tophi thấy ở trên các khớp bàn ngón chân cái, các ngón
khác, cổ chân, gối, khuỷu, cổ tay, bàn ngón tay và đốt ngón gần, có một vị trí rất
đặc biệt là trên sụn vành tai. Chƣa thấy ở háng, vai và cột sống.
Số hóa bởi trung tâm học liệu
7
+ Tính chất: kích thƣớc to nhỏ không đồng đều, từ vài milimet đến
nhiều centimet đƣờng kính, lồi lõm, hơi chắc hoặc mềm, không di động do dính
vào nền ở dƣới, không đối xứng 2 bên và không cân đối, ấn vào không đau,
đƣợc bọc bởi một lớp da mỏng, phía dƣới thấy cặn trắng nhƣ phấn, đôi khi da bị
loét và dễ chảy nƣớc vàng và chất trắng nhƣ phấn.
- Viêm đa khớp: Các khớp nhỏ và nhỡ bị viêm là bàn ngón chân và tay, đốt
ngón gần, cổ tay, gối, khuỷu, viêm có tính chất đối xứng, biểu hiện viêm thƣờng
nhẹ, không đau nhiều, diễn biến khá chậm. Các khớp háng, vai và cột sống
không bị tổn thƣơng [2].
- Biểu hiện ngoài khớp:
+ Urat có thể lắng đọng ở thận dƣới hai hình thức:
Lắng đọng rải rác ở nhu mô thận: hoặc không thể hiện triệu chứng gì, chỉ
phát hiện qua giải phẫu bệnh, hoặc gây viêm thận, bể thận.
Gây sỏi đƣờng tiết niệu: sỏi axit uric ít cản quang, chụp thƣờng khó thấy,
phát hiện bằng siêu âm, chụp UIV. Sỏi thận dễ dẫn tới viêm nhiễm, suy
thận. Đây là một trong những yếu tố quan trọng quyết định tiên lƣợng của
bệnh.
+ Urat có thể lắng đọng ở một số cơ quan ngoài khớp nhƣ:
Lắng đọng ở gân, túi thanh dịch, có thể gây đứt hoặc chèn ép thần kinh
(hội chứng đƣờng hầm).
Lắng đọng ở ngoài da, móng tay, móng chân thành từng vùng và mảng,
thƣờng dễ nhầm với những bệnh ngoài da khác nhƣ vẩy nến, nấm…
dịch khớp hay trong các hạt tophi. Hoặc có từ tối thiểu từ 2 tiêu chuẩn sau đây
trở lên:
- Trong tiền sử hoặc trong hiện tại có tối thiểu hai đợt sƣng đau của một
khớp với tính chất ban đầu đột ngột, đau dữ dội và khỏi hoàn toàn trong vòng 2
tuần.
- Trong tiền sử hoặc hiện tại có sƣng đau khớp ngón bàn chân cái với các
tính chất nhƣ tiêu chuẩn trên.
- Tìm thấy các hạt tophi. Đáp ứng điều trị nhanh chóng với Colchicin
(trong vòng 48h) trong tiền sử hay hiện tại [7], [10], [22].
1.1.3.4. Bệnh Gút thứ phát
Bệnh Gút xuất hiện do tăng axit uric máu sau một số bệnh khác đƣợc gọi là
bệnh Gút thứ phát. Khi tìm thấy nguyên nhân gây tăng axit uric máu và loại trừ
đƣợc nguyên nhân thì bệnh khỏi. Tuy nhiên, Gút thứ phát rất hiếm gặp.
Gút thứ phát gặp ở nam giới tuổi trung niên, hay gặp thể viêm khớp cấp di
chuyển hơn là thể ngón chân cái và hầu nhƣ không thấy thể đa khớp có u cục,
thƣờng có kèm theo sỏi thận, hoặc lắng đọng urat ở nhu mô thận.
Nguyên nhân của Gút thứ phát thƣờng gặp sau các bệnh về máu nhƣ: bệnh
đa hồng cầu, một số bệnh thiếu máu do tan máu, lơxêmi cấp và kinh thể tủy,
bệnh hodgkin, sarcom hạch; sau khi mắc một số bệnh thận: viêm cầu thận mạn
tính, suy thận mạn do nhiều nguyên nhân. Gút thứ phát cũng có thể gặp sau khi
dùng nhiều và kéo dài một số thuốc nhƣ steroid, pyrazinnamid, lactat natri,
thuốc lợi tiểu nhóm chlorothiazid hoặc dùng các phƣơng pháp diệt nhiều tế bào
(hoá chất, phóng xạ,…) để điều trị các bệnh ác tính.
Số hóa bởi trung tâm học liệu
10
Một số nguyên nhân hiếm gặp khác cũng có thể gây nên bệnh Gút thứ phát:
bệnh thận do thai nghén, suy tuyến giáp, gan nhiễm glycogen, cƣờng cận giáp
[10], [22].
1.2. Một số điều cần biết về axit uric
Cơ chế chủ yếu là do tăng axit uric máu kéo dài, cơ thể có hàng loạt phản
ứng thích nghi nhằm giảm axit uric trong máu bằng cách: tăng bài tiết qua thận,
lắng đọng muối urat trong các tổ chức nhƣ: màng hoạt dịch, da, kẽ thận, gân
Dẫn đến sự biến đổi về hình thái học các tổ chức này. Tăng axit uric trong dịch
khớp dẫn đến kết tủa thành các tinh thể hình kim gây tổn thƣơng sụn, màng hoạt
dịch, bao khớp. Qua chỗ sụn bị tổn thƣơng các tinh thể xâm nhập xuống tận lớp
xƣơng dƣới sụn, hình thành các hạt tophi, gây phá huỷ xƣơng dƣới dạng ổ
khuyết xƣơng hình cầu. Viêm màng hoạt dịch, tăng sinh màng hoạt dịch, thâm
nhiễm các tế bào lympho là tổn thƣơng thứ phát. Sự lắng đọng các tinh thể ở tổ
chức tạo thành các hạt tophi kích thƣớc to nhỏ khác nhau. Lắng đọng tinh thể
urat ở kẽ thận dẫn đến tổn thƣơng thận nhƣ sỏi thận, viêm thận kẽ, xơ hóa cầu
thận. Tổn thƣơng lan rộng dẫn đến suy thận, tăng huyết áp. Đây là yếu tố tiên
lƣợng quan trọng [18], [19].
1.3. Những nghiên cứu về bệnh Gút ở Việt Nam và trên thế giới
Tuy bệnh Gút đã xuất hiện từ lâu nhƣng các nghiên cứu hầu nhƣ đều nhằm
vào mục đích điều trị và cơ chế gây bệnh cùng với các bệnh lý cũng nhƣ triệu
chứng liên quan đến bệnh Gút của các nhà chuyên môn. Có rất ít các nghiên cứu
Số hóa bởi trung tâm học liệu
12
về thành phần của hạt tophi Gút đƣợc công bố. Trên đây là một số nghiên cứu
cơ bản về bệnh Gút đã đƣợc công bố trên thế giới và Việt Nam.
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Bệnh gút là bệnh viêm khớp phổ biến nhất ở ngƣời cao tuổi. Tuy nhiên
nói chung bệnh xuất hiện là do cách quản lí kém và một phần do thiếu chiến
lƣợc điều trị và hƣớng dẫn đối với ngƣời dân đầy đủ [27], [28]. Do mức sống
ngày càng đƣợc nâng cao lên tuổi thọ trung bình của con ngƣời cũng đƣợc nâng
cao, tuy nhiên kèm theo việc nâng cao tuổi thọ là việc gia tăng các bệnh có liên
quan đến tuổi tác và các hiệu ứng tác dụng phụ của các thuốc điều trị (ví dụ nhƣ
thuốc lợi tiểu và scalicylates liều thấp) có thể làm tăng nguy cơ bệnh gút [28],
dịch, các tế bào sụn và tạo cốt bào gây viêm mạn tính màng họat dịch dẫn đến
mất sụn và hủy xƣơng. Tinh thể monosodium urate hoạt hóa các tế bào sụn giải
phóng interleukin 1 kích thích nitric oxide synthetase và metalloproteinase làm
tiêu hủy sụn. Đồng thời tinh thể monosodium urate hoạt hóa osteoblast giải
phóng cytokine làm giảm chức năng tạo cốt bào dẫn đến hủy xƣơng cạnh khớp
[33].
1.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Trong thời gian qua, nền kinh tế của Việt Nam nói chung đã có những
bƣớc phát triển nhanh chóng. Cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, cộng với
chế độ dinh dƣỡng thiếu hợp lý nên bệnh Gút cùng các bệnh rối loạn chuyển hóa
khác nhƣ tiểu đƣờng, rối loạn lipid máu, tăng huyết áp, thừa cân, béo phì, cũng
đang ngày càng phổ biến. Tuổi trung bình của các bệnh nhân mắc bệnh Gút theo
nhƣ nghiên cứu của Lƣu Văn Ái và cs năm 2010 tại bệnh viện Chợ Rẫy là 72 7
tuổi và trong đó bệnh nhân ít tuổi nhất là 60 tuổi và nhiều tuổi nhất là 92 tuổi
[1]. Vào năm 2012 theo nghiên cứu bổ sung của Lê Thị Anh Thƣ và cs thì tuổi
trung bình của các bệnh nhân mắc bệnh Gút là 49 tuổi [25]. Điều này chứng tỏ
bệnh nhân bị bệnh Gút ngày càng đƣợc trẻ hóa có thể một phần do lối sống cà
cách ăn uống.
Số hóa bởi trung tâm học liệu
14
Theo nhƣ nghiên cứu của Lê Thị Viên (2006) thì số bệnh nhân sống ở
thành thị chiếm tỷ lệ nhiều hơn (70 - 74%). Sự khác biệt này có thể là do ngày
nay đời sống ngƣời dân đƣợc nâng lên đáng kể. Điều kiện sống và mức sống của
ngƣời dân ở nông thôn và thành thị ngày nay không cách biệt nhiều. Do đó tỷ lệ
mắc bệnh ở thành thị và nông thôn không khác nhau nhiều [21].
Trong cơn Gút cấp đầu tiên hầu hết bệnh nhân có tổn thƣơng khớp ở cả
chi trên lẫn chi dƣới và xuất hiện ở cả 2 bên: Khớp bàn ngón chân cái (77,9%),
khớp cổ chân (69,4%), khớp khác ở bàn chân (56,7%), khớp gối (54,2%), Khớp
khuỷu (33,9%), khớp cổ tay (30,7%), khớp bàn ngón tay (20,3%). Theo nhƣ
khớp cũng khá phổ biến. Biến chứng ngoài khớp thƣờng gặp nhất của Gút là sỏi
thận chiếm 44,8% do lắng đọng tinh thể axit uric trong bể thận và đƣờng tiết
niệu. Các biến chứng nhƣ viêm thực quản, viêm kết mạc, viêm mạch ngoại vi,
viêm rễ thần kinh chiếm tỉ lệ từ 5- 20%. Một số biến chứng nhƣ viêm màng
ngoài tim, viêm màng não, viêm tinh hoàn, hội chứng thần kinh ngoại biên do
tophi chèn ép gặp với tỉ lệt thấp nhƣng đây lại là các biến chứng rất nặng của
bệnh [4].
1.4. Một số phƣơng pháp phân tích sinh hóa thƣờng dùng trong nghiên cứu
cơ thể sống
1.4.1. Một số phƣơng pháp thƣờng dùng trong phân tích định lƣợng
1.4.1.1. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu định lƣợng
protein
- Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry
Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử folin. Phƣơng pháp này
sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thủ folin tác dụng lên
gốc tyrozin, tryptophan, histidin, để tạo phức màu xanh đặc trƣng có độ hấp thu
cực đại ở bƣớc sóng 750nm và dựa vào đƣờng chuẩn protein để từ đó dịnh
lƣợng hàm lƣợng protein. Cƣờng độ màu tỉ lệ với nồng độ protein.
Số hóa bởi trung tâm học liệu
16
Phƣơng pháp Lowry có độ nhạy tƣơng đối cao cho phép xác định dung
dịch mẫu chứa vài chục µg protein thƣờng nhạy cảm trong khoảng từ 5 - 2,000
µg protein. Tuy nhiên phƣơng pháp này không dùng để định lƣợng các protein
không chứa axit amin vòng thơm nhƣ gelatin, đối với những hợp chất có chứa
ion kali thì tạo kết tủa ảnh hƣởng đến kết quả [3], [9].
- Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp quang phổ
Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bƣớc sóng 280 nm của protein. Các
protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bƣớc sóng 280 nm do các axitamin
tryptophan, tyrozin và một phần là phenylalanin. Sự hấp thu ở bƣớc sóng 280
thƣờng dùng ete etylic, vì nó có độ bay hơi cao và nhiệt độ sôi thấp. Tốc độ của
quá trình chiết xuất phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ của nguyên liệu. Ngoài
lipit ra còn có một số hợp chất hòa tan khác nhƣ: vitamin hòa tan trong lipit,
phosphatit, steroit, các sắc tố…cũng đƣợc chiết ra. Tuy nhiên, trong nhiều
trƣờng hợp hàm lƣợng các chất này rất ít nên phƣơng pháp này vẫn đƣợc chấp
nhận trong các thí nghiệm thông thƣờng. Vì vậy, các lipit xác định bằng 1 trong
2 phƣơng pháp trên đƣợc gọi là lipit thô. Quá trình chiết xuất lipit đƣợc thực
hiện trên máy Soxhlet [12].
1.4.1.3. Xác định hàm lƣợng một số thành phần khác bằng phƣơng pháp
quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
Phƣơng pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một
nguyên tố đƣợc gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS). Cơ sở lí
thuyết của phép đo này là sự hấp thụ năng lƣợng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử
tự do ở trong trạng thái hơi (khí) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của
nguyên tố ấy trong môi trƣờng hấp thụ. Vì thế muốn thực hiện đƣợc phép đo
phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố cần thực hiện các quá trình sau đây:
- Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích từ
trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự
Số hóa bởi trung tâm học liệu
18
do. Đó là quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu. Những trang bị để thực hiện
quá trình này đƣợc gọi là hệ thống nguyên tử hóa mẫu (dụng cụ để nguyên tử
hóa mẫu). Nhờ đó chúng ta có đƣợc đám hơi của các nguyên tử tự do của các
nguyên tố trong mẫu phân tích. Đám hơi chính là môi trƣờng hấp thụ bức xạ và
sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử.
- Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trƣng của nguyên tố cần phân tích qua đám
hơi nguyên tử vừa điều chế đƣợc ở trên. Các nguyên tử của nguyên tố cần xác
định trong đám hơi đó sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp
thụ của nó. Ở đây, phần cƣờng độ của chùm tia sáng đã bị một loại nguyên tử
cấu thành khác nhau của tế bào ở đúng vị trí của chúng. Để xác định đƣợc các
chất hoặc các nhóm chất khác nhau, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp đặc trƣng
cho từng chất.
Ngày nay, ngƣời ta đã dùng các phƣơng pháp khác nhau để làm xuất hiện
các hydratcarbon, các lipid, các protide, các enzyme, axit nucleic trong tế bào và
các cấu thành của tế bào đúng vị trí thật của chúng. Phƣơng pháp này chỉ cho kết
quả định tính [24].
1.4.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu tế bào sống
Có nhiều phƣơng pháp nghiên cứu tế bào sống nhƣ phƣơng pháp vi phẫu
thuật và phƣơng pháp nuôi cấy tế bào - mô italic.
Ngày nay, nhờ vào sự hoàn thiện của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào,
ngƣời ta không những nuôi cấy thành công các tế bào riêng biệt mà còn có thể
nuôi cấy ivitro các bào quan và thậm chí cả các phần tử sống nữa. Và đã đóng
góp đáng kể trong việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế phân hóa tế bào, cơ chế hoạt
động của gen [24]
Số hóa bởi trung tâm học liệu
20
1.4.2.4. Phƣơng pháp quang phổ
Ta biết rằng các cấu thành khác nhau trong tế bào hấp thu chọn lọc các
tia hồng ngoại, các tia tử ngoại và các tia sáng thƣờng. Nhờ vậy, ngƣời ta có thể
dùng quang phổ kế để đo lƣờng sự hấp thụ ánh sáng của các cấu thành tế bào.
Cƣờng độ hấp thụ ánh sáng của các chất phụ thuộc vào nồng độ của chất đó.
Nhƣ vậy, ta có thể dựa vào các dẫn liệu quang học để tính toán và đƣa ra thành
phần hóa học của tế bào và định hƣớng các chất đó.
Ngày nay, với phƣơng pháp này, ngƣời ta xác định đƣợc các chất trong
tế bào với lƣợng 10
-12
Số hóa bởi trung tâm học liệu
21
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các bệnh nhân Gút và các hạt tophi Gút của các bệnh nhân Gút đã đƣợc
phẫu thuật cắt bỏ tại các cơ sở điều trị bệnh Gút hay tại các bệnh viện (Viện Gút
Hải Dƣơng, Viện Gút Hà Nội, Viện Gút Tp.HCM)
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Hóa sinh - Phòng phân tích hóa học - Viện Khoa học Sự sống -
Đại học Thái Nguyên.
Bộ môn Mô phôi - Trƣờng Đại học Y-Dƣợc - Đại học Thái Nguyên.
Khoa xét nghiệm Sinh hóa - Viện Gút Hải Dƣơng.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 5/2012 đến tháng 5/2013
2.3. Thiết bị và hóa chất dùng trong nghiên cứu
2.3.1. Thiết bị
- Hệ thống chƣng cất đạm (Kjeldahl System for determining Nitrogen)
hãng sản xuất: Velp - Italy.
- Bộ chiết Soxhlet hãng sản xuất: Behr - Đức.
- Máy đo quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS Hãng sản xuất: Shimazdu
– Nhật Bản
- Tủ sấy hãng sản xuất Drying - Italia
- Cân điện tử AB-204 sản xuất tại Nhật Bản
- Bình hút ẩm.
- Một số thiết bị cơ bản khác.
2.3.2. Hóa chất
Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn
), Pb(CH
3
COO)
2
, Methyl đỏ,
(NH
4
)
6
Mo
7
O
2
.4H
2
O (amoni molipdat)
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Định lƣợng Protein trong hạt tophi Gút theot phƣơng pháp Kjeldahl
- Tất cả các dạng nito có trong cơ thể hay các mô đƣợc gọi là nito tổng số.
Nito có trong thành phần amino axit của protein là nito protein. Nito không có
trong thành phần protein nhƣ của các muối vơ cơ, axit nitric, các amino axit tự
do, các peptid, ure và các dẫn xuất ure, purin và pirimidin… là nito phi protein.
Nito tổng số = nito protein + nito phi protein
- Trƣớc tiên, mẫu đƣợc vô cơ hóa bằng H
2
SO
4
đặc ở nhiệt độ cao và có
chất xúc tác. Phản ứng xảy ra nhƣ sau:
H
4
)
2
SO
4
.
Tan trong dung dịch
2NH
3
+ H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4Số hóa bởi trung tâm học liệu
23
- Các nguyên tố P, K, Ca, Mg… chuyển thành dạng oxid: P
2
O
5
, K
2
O,
= (NH4)
2
B
4
O
7
+ H
2
O
* Tiến hành:
Vô cơ hóa mẫu:
Bƣớc 1. Cân 0,1g mẫu đã đƣợc nghiền nhỏ. Dùng một giấy cân cuộn tròn cho
cẩn thận mẫu vào tận đáy bình Kjeldahl dung tích 50ml.
Bƣớc 2. Cho thêm 5 - 10ml H
2
SO
4
đặc (d = 1,84). Trƣớc khi cho thêm axit cần
cho vài giọt nƣớc cất không có nito để thấm ƣớt bột. Khi cho vào bình, không
đƣợc để mẫu dính bám vào cổ bình.
Bƣớc 3. Đậy nút lỏng thủy tinh. Lắc nhẹ bình rồi đặt lên bếp cách cát đun nhẹ
khoảng 30 - 40 phút, sau đó nhấc bình ra để nguội.
Bƣớc 4. Cho vài giọt xúc tác axit percloric ( HClO
4
), chỉ cho ở giai đoạn cuối
dung dịch đã có màu vàng sẫm. Tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa . Dung
dịch sẽ chuyển từ màu đen sang màu cánh dán. Nhấc bình ra khỏi bếp, để nguội.
Bƣớc 5. Cho thêm chất xúc tác lần thứ hai (vài giọt axit percloric). Tiếp tục đốt
đến khi dịch trong bình không màu. Để nguội.
Bƣớc 6. Chuyển dịch sang bình định mức 100ml, tráng bình Kjeldahl vài lần
+ 4H
3
BO
3
Copyright: Tài liệu đại học ©