BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
***

TRỊNH MINH HỢP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP
CHUYỂN GEN ðỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM
HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA
ARMIGERA HÜBNER)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
2: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN
HÀ NỘI - 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và
chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị nào. Các tài liệu trích dẫn ñược chỉ
rõ nguồn gốc và mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cám ơn.

Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2012
Tác giả luận án Trịnh Minh Hợp Trịnh Minh Hợp
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
iii

MỤC LỤC
Trang

Lời cam ñoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Ký hiệu và chữ viết tắt trong luận án ix

Danh mục bảng trong luận án xi

Danh mục hình trong luận án xiv

MỞ ðẦU ……………………………………………………………….

1

1. Tính cấp thiết của ñề tài …………………………………………

1

2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài ………………………


4.2. Phạm vi nghiên cứu của ñề tài ……………………………

4

5. ðóng góp mới của luận án ………………………………

4

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
iv
Trang

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ………………

5

1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam

5

1.1.1. Sơ lược về cây bông ……………………………………

5

1.1.2. Tình hình sản xuất bông trên thế giới ………………… 5

1.1.3. Tình hình chọn tạo và sản xuất bông ở Việt Nam ………

6


16

1.6. Tái sinh cây bông

17

1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma ………………

17

1.6.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo ña chồi ………………….

22

1.7. Chuyển gen cây bông …………………………………………

23

1.7.1. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens …………

24

1.7.2. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua ñường ống phấn

28

1.7.2.1. Cơ chế của chuyển gen PTP …………………………

28

34

1.8.1.1. Gen chỉ thị chọn lọc ………………………………….

34

1.8.1.2. Gen chỉ thị chọn lọc thông dụng ……………………

35

1.8.2. Xác ñịnh sự có mặt của gen chuyển trong tế b
ào cây
chuyển gen ………………………………………………

37

1.8.2.1. Xác ñịnh sự có mặt của gen chuyển trong tế b
ào
bằng PCR ……………………………………………

37

1.8.2.2. Xác ñịnh sự gắn kết và s
ố bản sao gen chuyển bằng
Southern blot …………………………………………

39

1.8.3. ðánh giá s
ự biểu hiện của gen chuyển trong cây

46

2.1.1. Giống bông ………………………………………………

46

2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn ……………….

46

2.1.3. Cặp mồi ñặc hiệu ………………………………………….

48

2.1.4. Hoá chất …………………………………………………

48

2.1.5. Máy móc, thiết bị ………………………………………….

49

2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ………………………….

49

2.2.1. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens ……

49


56

2.2.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh …….

56

2.2.3.2. ðánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR …………

57

2.2.3.3. ðánh giá tính kháng sâu xanh của cây chuyển gen ….

57

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
vii

Trang

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………

60

3.1. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens ………

60

3.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma …

60


3.3. Sàng lọc, ñánh giá cây bông chuyển gen ……………………….

97

3.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh ………….

97

3.3.1.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin …

97

3.3.1.2. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin …….

100

3.3.2. ðánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR ………………

107

3.3.3. ðánh giá tính kháng sâu xanh của cây bông chuyển gen

110

3.3.3.1.
ðánh giá tính kháng sâu xanh của 7 dòng chuy
ển
gen thế hệ T
2

120

1. Kết luận …………………………………………………………

120

2. ðề nghị ……………………………………………………………

121

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ðà CÔNG B
Ố CÓ
LIÊN QUAN ðẾN ðỀ TÀI …………………………………………….

122

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………….

123

PHỤ LỤC ………………………………………………………………

141


m
/n

Ký hiệu cây và dòng chuyển gen. Trong ñó, C ký hiệu
của giống Coker312, S - SSR60F, L - LRA5166, M -
MCU9 và T - TM1; T
m
ký hiệu thế hệ, m = 0, 1, 2…; n
là số thứ tự cây hoặc dòng chuyển gen, n = 1, 2, 3, …
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
ðC, ðC+ và ðC- ðối chứng, ñối chứng dương và ñối chứng âm
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
GA
3
Gibberellin A
3
gfp Green fluorescent protein
gus β-Glucuronidase
hpt Hygromycin phosphotransferase
IAA 3-Indoleacetic acid
IBA Indole-3-butyric acid
ICAC International cotton advisory committee - Ủy ban cố
vấn bông quốc tế
ICP Insecticidal crystal protein - protein tinh thể diệt sâu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
x

Ký hiệu, chữ viết tắt

PTP Pollen tube pathway - ñường ống phấn
RNA Ribonucleic acid
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TDZ Thidiazuron
TE Tris - EDTA buffer
Tris-HCl Tris hydrochloride: Tris(hydroxymethyl)aminomethane
hydrochloride
VIP3A Vegetative insecticidal protein - protein sinh dưỡng diệt
côn trùng
Zeatin 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purine
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
xi
DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN
Bảng Nội dung Trang

Bảng 2.1. Trình tự 3 cặp mồi ñặc hiệu và kích thước 3 phân ñoạn
DNA dự kiến nhân …………………

48

Bảng 2.2. Tổ hợp nồng ñộ chất ñiều hòa sinh trưởng 2,4D và
kinetin trong các môi trường CI ……………………….

50

Bảng 2.3. Quy ước ñánh giá mức ñộ cảm ứng mô sẹo và mức ñộ
lớn của mô sẹo …………………………………


Bảng 3.5. Tỷ lệ cây tái sinh sống ở các phương pháp huấn luyện,
trồng cây tái sinh ………………………………………

71

Bảng 3.6. Tỷ lệ cảm ứng ña chồi của phôi hạt trên các môi trường MSI

72

Bảng 3.7. Tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi/cụm trên các môi trường S

75

Bảng 3.8. Tỷ lệ cây tái sinh ra rễ trên các môi trường R ……
77

Bảng 3.9. Tỷ lệ cây tái sinh sống trong nhà kính và nhà lưới …
78

Bảng 3.10. Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo trên môi trường CI
4
và mô sẹo
sống sót trên môi trường CP bổ sung hygromycin ở 6
nồng ñộ ………………………………………………

80

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
xii



Bảng 3.16. Số cây tái sinh trong ống nghiệm, nhà kính, nhà lưới và
cây ra hoa - ñậu quả bình thường ……………………

90

Bảng 3.17. Tỷ lệ hoa nở ở các thời ñiểm trong ngày của 4 giống bông

92

Bảng 3.18. Kích thước bầu nhụy, chiều dài trụ noãn và ñộ sâu kim
tiêm của 4 giống bông …………………………………

93

Bảng 3.19. Số hoa vi tiêm, quả ñậu và hạt chuyển gen thế hệ T
0
thu
ñược của 4 giống bông trên 3 nồng ñộ DNA plasmid …94

Bảng 3.20. Tỷ lệ ñậu quả và số hạt/quả của 4 giống bông trong
ñiều kiện không vi tiêm và vi tiêm

95

1
, dòng
chuyển gen thế hệ T
2
kháng kanamycin ……….………101

Bảng 3.26. Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 7 dòng chuyển gen thế
hệ T
2
giống LRA5166 …………………………………

105

Bảng 3.27. Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 64 dòng chuyển gen
thế hệ T
2
giống MCU9 …………………………

106

Bảng 3.28. Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 9 dòng chuyển gen thế
hệ T
2
giống TM1 ………………………………………

107


kháng sâu cao, trung bình
và yếu 114

Bảng 3.34. Tỷ lệ sâu chết và sống sót ở các tuổi khi ăn lá của 87
dòng chuyển gen thế hệ T
2
116

Bảng 3.35. So sánh ñặc ñiểm sâu sống sót khi ăn lá dòng chuyển
gen thế hệ T
2
và giống ðC

119
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
xiv

DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN ÁN
Hình Nội dung Trang

Hình 2.1. Sơ ñồ của 2 vector chuyển gen …………………………


Hình 3.8. Cây tái sinh hoàn chỉnh trong ống nghiệm, huấn luyện -

trồng cây tái sinh 76

Hình 3.9. ðoạn thân nuôi trên môi trường CI
4
b
ổ sung hygromycin
ở 6 nồng ñộ 79

Hình 3.10. Mô sẹo chuyển gen cảm ứng sau 3 tuần nuôi cấy tr
ên
môi trường CI
4
bổ sung 12,5 mg/l hygromycin 85

Hình 3.11. Nhân, ch
ọn lọc mô sẹo; phân hóa, phát triển, chín phôi;
nảy mầm, tái sinh cây chuyển gen


bằng kanamycin

102

Hình 3.17. Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
2
bằng kanamycin

104

Hình 3.18. ðiện di ñồ sản phẩm PCR nhân gen hpt ………………

108

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
xv
Hình Nội dung Trang

Hình 3.19. ðiện di ñồ sản phẩm PCR nhân gen nptII ………………

109

Hình 3.20. ðiện di ñồ sản phẩm PCR nhân gen CryIAc ……………

109

Hình 3.21. Sâu sống trên ðC và chết trên dòng chuyển gen thế hệ T
2

117

kiện nhiệt ñới ẩm như ở nước ta, sâu hại thường phát sinh và gây hại quanh
năm trên cây bông. Các loài sâu hại phổ biến là sâu xanh, sâu keo, sâu khoang
và sâu hồng. Trong số ñó, sâu xanh là loài nguy hiểm nhất, có mặt và gây hại
nặng ở hầu hết các vùng trồng bông từ Bắc tới Nam và là ñối tượng cần
phòng trừ (Ngô Trung Sơn, 1999 [11]; Nguyễn Hữu Bình, 1990 [1]; Nguyễn
Thị Hai, 1996 [5]). Trong ñó, biện pháp phòng trừ bằng giống kháng ñã ñược
ñặt ra. Tuy nhiên, ñến nay, chúng ta vẫn chưa tạo ñược giống bông kháng sâu
tốt vì không tìm thấy nguồn gen kháng sâu xanh hiệu quả trên cây bông.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
2

Theo Chương trình phát triển cây bông ñến 2015 và ñịnh hướng ñến
2020 [13], Việt Nam cần phát triển theo hướng tăng cường ñầu tư thâm canh
nâng cao năng suất, chất lượng, ñảm bảo hiệu quả kinh tế, nâng cao sức cạnh
tranh của cây bông và bảo vệ môi trường sinh thái; với chỉ tiêu ñến năm 2015,
ñạt 20 nghìn tấn bông xơ và ñến 2020 là 60 nghìn tấn. ðể thực hiện ñược ñiều
này, bên cạnh áp dụng các giải pháp quy hoạch, ñầu tư, tài chính…, thì giải
pháp khoa học công nghệ mà trong ñó ứng dụng phương pháp chuyển gen ñể
tạo giống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết.
ðể tạo cây bông Bt, chủ yếu sử dụng phương pháp chuyển gen thông
qua A. tumefaciens, vì có ưu ñiểm ñơn giản, chi phí thấp, không cần thiết bị
ñặc biệt, số bản sao gen chuyển thấp và di truyền ổn ñịnh. Tuy nhiên, phương
pháp này phụ thuộc hệ thống tái sinh mất nhiều thời gian, tỷ lệ tái sinh thấp và
bị giới hạn bởi kiểu giống. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua ñường
ống phấn là phương pháp mới, có ưu ñiểm thao tác ñơn giản, tỷ lệ chuyển gen
khá cao, khắc phục ñược những hạn chế của tái sinh và có thể chuyển gen vào
bất kỳ giống bông nào. Mặc dù, cũng có nhược ñiểm như quy mô chuyển gen
lớn, tốn nhiều công lao ñộng, phụ thuộc vào ngoại cảnh, nhưng phương pháp
chuyển gen này ñang ngày càng ñược quan tâm sử dụng.
Xuất phát từ những cơ sở trên, ñề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương

sâu ≥ 80%) làm vật liệu quý cho chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước.
3.2. Yêu cầu của ñề tài
- Chuyển ñược gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp
chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua ñường ống phấn.
- Sàng lọc, ñánh giá và chọn lọc ñược một số dòng bông chuyển gen
kháng sâu xanh cao.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
4

4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài
4.1. ðối tượng nghiên cứu của ñề tài
- Giống bông SSR60F, Coker310, Coker312, VN36P, C118, LRA5166,
MCU9 và TM1.
- Gen CryIAc, vector chuyển gen pC1300-Ubi-CryIAc và pIBT-CryIAc,
vi khuẩn E.coli chủng DH5α và A. tumefaciens chủng C58.
- Sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner).
4.2. Phạm vi nghiên cứu của ñề tài
- Phạm vi nội dung nghiên cứu là chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng
phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy
qua ñường ống phấn; và sàng lọc, ñánh giá, chọn lọc cây chuyển gen bằng
kháng sinh, PCR và bio-test (nuôi sâu ñánh giá tính kháng trong phòng).
- Phạm vi không gian và thời gian là phòng thí nghiệm, nhà kính và nhà
lưới của Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Phòng Nghiên cứu Bảo vệ
Thực vật - Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố - Nhơn
Sơn - Ninh Sơn - Ninh Thuận; từ năm 2005 ñến 2011.
5. ðóng góp mới của luận án
Lần ñầu tiên ở Việt Nam:
- Tái sinh thành công một số giống bông bằng phương pháp tái sinh
thông qua tạo phôi soma và tạo ña chồi.
- Chuyển thành công gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương

Theo ICAC (2012) [67], trong niên vụ 2010/2011, diện tích trồng bông
trên toàn thế giới khoảng 33,3 triệu ha, sản lượng ñạt 25,1 triệu tấn bông xơ
và có giá trị trên 50 tỷ USD. Trong ñó, gần 80% diện tích trồng và 83,5% sản
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
6

lượng bông xơ là của Ấn ðộ (11,1 triệu ha và 5,8 triệu tấn), Trung Quốc (5,2
triệu ha và 6,4 triệu tấn), Mỹ (4,3 triệu ha và 3,9 triệu tấn), Pakistan (2,8 triệu
ha và 1,9 triệu tấn), Uzbekistan (1,3 triệu ha và 0,9 triệu tấn) và Braxin (1,4
triệu ha và 2,0 triệu tấn).
Trên thế giới, có gần 100 quốc gia trồng bông, nhưng diện tích trồng
lớn tập trung chủ yếu ở một vài nước. Hơn 3 thập kỷ gần ñây, có 4 quốc gia
dẫn ñầu về sản xuất bông và ñóng góp lớn vào tăng trưởng sản lượng bông
của thế giới là Trung Quốc, Ấn ðộ, Mỹ và Pakistan. Ở niên vụ 1970/1971, 4
nước này ñóng góp tới 48% sản lượng bông xơ thế giới, ñến niên vụ
2009/2010, tỷ lệ này là 75%. ðặc biệt, sự gia tăng sản lượng bông xơ của
Trung Quốc và Ấn ðộ làm cho tỷ lệ ñóng góp của Châu Á vào sản lượng
bông xơ thế giới tăng từ 35% (niên vụ 1980/1981) ñến 65% (niên vụ
2009/2010) (Babacan et al., 2010) [19].
Từ 1950 ñến nay, năng suất bông thế giới trải qua các giai ñoạn tăng
trưởng chậm xen kẽ với giai ñoạn tăng trưởng nhanh, nhưng sản lượng bông
xơ liên tục tăng từ niên vụ 1977/1978 (khoảng 12 triệu tấn) ñến niên vụ
2003/2004 (khoảng 26,5 triệu tấn). Việc chấp thuận và trồng ngày càng nhiều
bông chuyển gen dẫn ñến năng suất bông tăng vọt trong giai ñoạn 1999/2000-
2003/2004. Tuy nhiên, năng suất và sản lượng bông xơ dường như bước vào
giai ñoạn tăng trưởng chậm từ niên vụ 2005/2006, do tỷ lệ mở rộng diện tích
trồng bông chuyển gen bị chậm lại (Babacan et al., 2010) [19]. Trong vài thập
kỷ tới, hy vọng những tiến bộ mới về công nghệ có thể tạo ra giai ñoạn tăng
trưởng mới về năng suất và sản lượng bông xơ.
1.1.3. Tình hình chọn tạo và sản xuất bông ở Việt Nam

trung bình ñến khá, nhưng chúng không có khả năng kháng sâu xanh, nên
năng suất bông thường bấp bênh. Vì vậy, diện tích sản xuất bông ở giai ñoạn
này mặc dù có tăng nhưng còn chậm, tổng diện tích sản xuất bông của cả
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
8

nước trong giai ñoạn 1996-1997 khoảng hơn 10 nghìn ha, sản lượng chỉ ñáp
ứng 7-10% nhu cầu nguyên liệu cho ngành dệt may trong nước (Nguyễn Hữu
Bình và ðinh Hữu Vinh, 1998) [2].
Từ năm 1996/1997, việc nhập nội các nguồn gen quý kháng sâu, kháng
rầy xanh, chịu thuốc trừ cỏ… ñã giúp công tác chọn tạo giống bông nước ta
có bước ñột phá mới. Từ năm 2000 ñến nay, nhiều giống bông lai mới lần
lượt ra ñời, áp dụng vào sản xuất, ñáp ứng kịp thời nhu cầu ña dạng hóa giống
sản xuất trên các vùng sinh thái trồng bông của Việt Nam, trong ñó, nổi bật
nhất là VN15, VN01-2, VN02-2, VN04-3, VN04-4 và VN04-5. Các giống
này, bên cạnh khả năng cho năng suất với ưu thế lai khá cao (20-30%), còn có
khả năng kháng sâu xanh. Trong ñó, giống VN01-2 bên cạnh khả năng kháng
sâu xanh còn có khả năng kháng rầy xanh, giống VN02-2 có khả năng kháng
sâu xanh và chịu thuốc trừ cỏ. Chính nhờ áp dụng nhanh tiến bộ mới về
giống, ñã góp phần quan trọng giúp cho sản xuất bông có bước tăng trưởng
nhanh chóng, diện tích sản xuất bông của cả nước tăng cao nhất trong giai
ñoạn này ñạt 32.267 ha (niên vụ 2002/2003) với năng suất bình quân 1,5-2
tấn/ha (Viện Nghiên cứu và Phát triển cây Bông, 2006) [14]. Tuy nhiên, bắt
ñầu từ niên vụ 2006/2007, diện tích trồng bông của ta bắt ñầu giảm sút còn
17.300 ha và ñến niên vụ 2007/2008 chỉ còn 7.324 ha. Hiện nay, diện tích sản
xuất bông hàng năm của Việt Nam dao ñộng khoảng 8-10 nghìn ha (Viện
Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố, 2010) [16].
Cho nên, thời gian tới, ñể khôi phục và phát triển cây bông theo như
yêu cầu và chỉ tiêu nêu ra trong Quyết ñịnh 29/Qð-TTg [13], bên cạnh áp
dụng các giải pháp quy hoạch, ñầu tư, tài chính…, thì giải pháp khoa học