Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
o0o
ĐỖ MINH THÀNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA LOẠI
SÂM MỚI PANAXSP. THU Ở PHONG THỔ LAI CHÂU Ngành: Sinh học thực nghiệm
Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SỸ
Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Phan Kế Long
Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành
Ngọc Linh vẫn được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố trên núi Ngọc
Linh thuộc địa phân hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum với độ cao trên
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1500m so với mặt biển [11], tuy nhiên Zhu và cộng sự [58] đã ghi nhận
Panax vietnamensis có phân bố ở Vân Nam, Trung Quốc nên chúng tôi đặt
khả năng loài này có thể phân bố ở các tỉnh vùng núi phía bắc của Việt
Nam. Năm 2012, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phê duyệt đề
tài thuộc 7 hướng KHCN ưu tiên cấp Viện KHCNVN “Nghiên cứu phân
loại, phân bố và thành phần hóa học của cây Sâm mọc ở Lai Châu” mã số
VAST 04.07/12-13 do Tiến sĩ Phan Kế Long làm chủ nhiệm với mục đích
xác định tên khoa học và phân bố của loài sâm mọc tự nhiên ở Lai Châu và
thành phần hóa học chủ yếu của nó. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp
phân tích di truyền để định loại các mẫu sâm này dựa trên cơ sở so sánh
trình tự ITS – rDNA, là vùng gen mang nhiều biến dị có khả năng bộc lộ
quan hệ giữa những loài có nguồn gốc tiến hóa gần gũi [56].
Trên có sở dự án trên, chúng tôi đã tiến hành Luận văn này được
thực hiện trên cơ sở phân tích một số mẫu vật thu được trong đợt điều tra
khảo sát ở huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu của dự án trên với với tiêu đề:
“Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loại sâm mới Panax sp. ở huyện
Phong Thổ tỉnh Lai Châu”
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu đặc điểm sâm Panax sp. (Araliaceae) ở huyện Phong
Thổ tỉnh Lai Châu dựa trên cơ sở so sánh trình tự ITS – rDNA, là vùng
gen mang nhiều biến dị có khả năng bộc lộ quan hệ giữa những loài có
nguồn gốc tiến hóa gần gũi.
notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P. pseudoginseng (không tìm thấy trong
hoang dại, nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết
quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung tâm
phân bố của chi Sâm (Panax L.) của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P.
notoginseng; P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía
Nam của chi Panax L. là loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) ở Miền
Trung của Việt Nam, tại 14
0
15
’
vĩ độ Bắc.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Hình 1.1: Nhân sâm Việt Nam – Panax vietnamensis
1.1.2. Hiện trạng của loài Sâm Việt Nam hiện nay
Ở Việt nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5
năm đó, xuất khẩu sản phẩm từ nhân sâm đạt 55 triệu USD, thị trường chủ
yếu là Hồng Kông và Trung Quốc đại lục (27 triệu USD) [35]. Virginia và
Tây Virginia là nơi xuất khẩu sâm lớn nhất của Mỹ, chiếm khoảng 18%
trong tổng số 27200 kg sản lượng sâm hàng năm của toàn quốc. Trong 3
năm (2004-2006) ngành nông nghiệp Mỹ chứng nhận việc xuất khẩu hàng
năm tương ứng đạt 1800 kg, 2270 kg và 1633 kg đem lại gần 1 triệu USD
[35].
1.1.3.2. Tầm quan trọng và giá trị của cây Sâm ở Việt Nam
Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số
loài của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong
phạm vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như
Nhân sâm (Panax ginseng); Giả nhân sâm (P. pseudoginseng); Tây dương
sâm (P. quiquefolius); Tam thất (P. notoginseng) [5,17] và sâm Ngọc Linh
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
(P. vietnamensis Ha et Grushv.). Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng
chiến chống Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm
vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc như một thứ thần
dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm
nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu
vết thương.
Theo quan điểm hoá phân loại và dược lý học, những công trình
nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi
Panax thành 2 nhóm chính:
- Nhóm 1 gồm các loài có giá trị, hiện đã được phát triển trồng trọt gồm:
Nhân sâm (Panax ginseng), sâm Mỹ (P. quinquefolius) và Tam thất (P.
7- 12cm (ít khi 15 cm). Lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi
mác, dài 8- 14 cm, rộng 3- 5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn
kéo 1,5- 2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít
khi 8- 11) cặp dọc theo gân chính và gân bên ở mặt trên của lá chét có
nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn. Cụm hoa dài 25
cm, gấp 1,5- 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc ở tậ
cùng, đôi khi có thêm 1- 4 tán phụ hoặc một hoa đơn độc. Tán hoa chính
đường kính 2,5- 4 cm, có 50- 120 hoa. Hoa mầu vàng lục nhạt, đường kính
hoa nở 3- 4 mm. Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có 2 ô, 2 vòi (chiếm
20%). Quả khi chín màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả. Quả
1 hạt hình thân, quả 2 hạt hình cầu hơi dẹt dài 7- 10 mm rộng 4- 6 mm
(Hình 1.2) [1].
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 1.2. Sâm Ngọc Linh
Mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ
20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm
chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu
là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu tháng 1
hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần
lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây
nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9.
Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở
đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ
vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây
PV có hàm lượng cao chất saponin kiểu damarane (7,58%), trong đó
saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 3,32% và một lượng nhỏ saponin của
axit oleanolic. Do đặc điểm này, Tanaka xếp nhân sâm Việt Nam vào
nhóm B- (Trước đây chỉ có nhân sâm triều Tiên và nhân sâm Hoa Kỳ được
xếp vào nhóm này) [1]. Điều này trái lại với qui luật chung là thông
thường các cây hân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng
saponin của axit oleanolic và lượng nhóm saponin damarane.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được một hàm
lượng lớn majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax
(chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4,34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit
và ocotillol saponin cao nhất có trong cây Panax. Ocotillol saponin đã trở
thành một hợp chất cần được chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân
loại hóa học cho các cây Panax vì nó có thể ảnh hưởng đế một số tác dụng
mang tính đặc thù của Panax Việt Nam.
Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn là làm cho
nhân sâm Việt Nam khác với nhân sâm Triều Tiên, vì cho tới nay người ta
chưa tìm thấy ocotillol trong nhân sâm Triều Tiên.
Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân sâm Việt Nam
có hàm lượng saponin, damarane cao nhất (12- 15%) so với nhân sâm
khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26%
trong nhân sâm Triều Tiên [1].
Ngoài những saponin nói trên, trong nhân sâm Việt Nam còn chứa
các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi
lượng [1].
điều mà các nhà khoa học hiện đại cần tìm cho ra: Do cách chế biến chưa
đúng hay các hoạt chất trong củ nhân sâm của ta hiện còn bị một thứ men
nào che lấp, không cho thể hiện ngay như củ nhân sâm Triều Tiên. Hiện
nay các nhà bào chế phải phối hợp nhân sâm Việt Nam với một vị thuốc
khác để sử dụng được phần tác dụng tốt của nhân sâm Việt Nam, đồng thời
che lấp những nguyên nhân cản trở mà chúng ta chưa tìm ra được [1].
1.3. Một số phƣơng pháp phân loại thực vật
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Hiện nay, phương pháp phân loại thực vật đều dựa trên nguyên tắc
chung đó là những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất
giống nhau, thực vật càng gần nhau tính chất giống nhau càng nhiều. Sự
giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá , một
số phương pháp thường được sử dụng như:
1.3.1. Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)
Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì
cơ quan này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dưỡng khi điều kiện môi
trường thay đổi. Những thực vật càng gần nhau càng có nhiều đặc điểm
chung về hình thái. Đây là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được
dùng phổ biến [10], hạn chế của phương pháp này đã được ghi nhận trên
một số taxa, thực tế nhiều loài khác nhau nhưng có hình thái rất giống nhau
và ngược lại. Phương pháp phân loại hình thái thực sự gặp khó khăn khi
phân loại ở các đơn vị taxon dưới loài [2].
thể, của mô, của tế bào, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại. Việc sử
dụng phương pháp này đã nhận được các kết quả nghiên cứu chính xác và
khách quan cho phân loại thực vật. Các đặc điểm giải phẫu so sánh cho
phép xác lập mối quan hệ gần gũi không những của các nhóm lớn, mà cả
của các bậc taxon nhỏ, có thể xây dựng được những tiêu chuẩn phân loại
cho các chi, các loài thuộc họ Labiaceae [39].
Phương pháp giải phẫu so sánh không đòi hỏi kỹ thuật quá phức tạp
nhưng cho kết quả khá chính xác. Đối với các loài cây gỗ thường sử dụng
đặc điểm giải phẫu thân gỗ để định loại, ngược lại các loài thân thảo
thường sử dụng đặc điểm cấu trúc của biểu bì. Phương pháp này được sử
dụng để định loại gỗ và các thanh gỗ thành phẩm dùng để xuất khẩu.
1.3.3. Phương pháp hóa học
Có nhiều phương pháp phân tích hoá học khác nhau được sử dụng
trong nghiên cứu và kiểm định nhất là đối với mẫu cây chứa các nhóm chất
có hoạt tính sinh học, các cây chứa tinh dầu (Trầm hương, Xá xị, Pơ mu )
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc
kí khí - khối phổ… đặc điểm chung của phương pháp hóa học là cho kết
quả nhanh, chính xác và có thể cho các thông số về cấu trúc hoá học. Ưu
điểm của phương pháp này là yêu cầu về tính nguyên vẹn của mẫu vật
không cao. Trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng nhiều. Ở
nước ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ
sở[40].
1.3.4. Phương pháp phân loại học phân tử
Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự khác biệt
cho phân loại và được coi là tích luỹ các đột biến theo thời gian. Thêm vào
đó nếu coi tốc độ đột biến không đổi, chúng ta sẽ tạo ra được một đồng hồ
phân tử cho biết thời gian diễn ra các đột biến, nói cách khác chúng ta có
thể ước lượng được thời gian hình thành loài. Mặc dù phân loại học phân tử
là phương pháp phân loại sử dụng đặc điểm cấu trúc của các phân tử để xây
dựng hệ thống phát sinh chủng loại, tuy nhiên mãi cho đến những thập kỷ
gần đây, con người mới có khả năng tách chiết và xác định được cấu trúc
phân tử của những chất này.
Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự DNA của Maxam – Gilbert (1977,
1980) và Singer (1977) [23] đã mở ra một ứng dụng to lớn cho phân loại
học phân tử. Hiện nay phân tích hay được sử dụng trong phân loại học phân
tử là so sánh trình tự DNA, sử dụng kỹ thuật sắp xếp phân tử (alignment)
để xác định mức độ giống nhau. Các biến đổi phân tử đơn giản hơn nhiều
so với các biến đổi hình thái, vì vật chất di truyền DNA chỉ cấu thành từ 4
loại nucleotide (adenine, guanine, thymine và cytosine). Mặc khác, các
biến đổi phân tử ít bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường. Ưu thế lớn
nhất của hệ thống học phân tử là có thể phân biệt rõ ràng các đặc điểm
tương đồng với đặc điểm tương tự [23]. Ngoài ra, nhiều phần của vật chất
di truyền có nguồn gốc và kiểu biến đổi chung cho mọi sinh vật, nên có thể
so sánh trực tiếp bất kể nhóm sinh vật nào với nhau. Các biến đổi tiến hoá
nhỏ (microevolution), hay đa dạng di truyền giữa các quần thể sinh vật
cũng thể hiện qua các biến đổi phân tử rõ hơn so với các biến đổi hình thái.
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Tính thống nhất cao là một trong những ưu điểm của hệ thống học
phân tử, sử dụng tiêu chuẩn phân tử chung cho cả sinh giới, có lợi thế trong
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Hình 1.3: Hệ gen lục lạp [41]
Genome lục lạp (cpDNA) thực chất là một phân tử DNA vòng, sợi
đơn, mỗi gen thường không lặp lại. Không giống như các gen nhân, các
gen lục lạp chỉ mã hoá cho các protein cần thiết cho chức năng quang hợp
và bộ máy biểu hiện những protein này. Vùng DNA không mã hoá trên hệ
gen lục lạp là rất ít.
Genome lục lạp (cpDNA) có kích thước từ 120 kb – 220 kb (hình 1.3),
kích thước này thay đổi do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều
nhau (Inverted repeat), tách genome lục lạp thành hai vùng (vùng lớn LSC
và vùng nhỏ SSC). Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều mang số lượng gen
như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào DNA nhân và biến mất
khỏi hệ gen lục lạp. Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 – 5 lần
so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể
thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại [23].
Hiện nay, các gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu hệ
thống học phân tử thực vật bao gồm: gen matK, gen trnL, vùng đệm psbA -
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
trnH, tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không
lớn hơn 2% giữa các loài lân cận.
Ngoài các locus được nêu trên, các vùng DNA: gen rbcL, vùng đệm
trnL – trnF, trnT – trnL thuộc hệ gen lục lạp cũng thường được sử dụng
cho phân tích. Việc sử dụng mỗi đoạn gen cho những ưu nhược điểm khác
nhau, kết quả phân loại sẽ chính xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều gen.
1.4.2. Vùng ITS
Vùng gen ITS: vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá
cho ribosome gồm các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (hình 1.4). Giữa các
đơn vị gen có các đoạn ITS-1 và ITS-2, các thành phần này tạo thành một
nhóm gen cơ bản. Các nhóm gen như vậy lặp lại liên tục trong hàng nghìn
bản sao trong hệ gen nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng NTS
(nontranscribed spacer) (hình 1.4)
Hình 1.4: Sơ đồ vùng gen ITS
Trong các nghiên cứu phân loại thực vật ở mức độ loài, vùng ITS là
locus được giải mã phổ biến nhất [28]. Vùng ITS cho thấy có sự hiệu quả
cao trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật và nấm (ngoại trừ
dương xỉ), và đây là một locus được kiến nghị làm vùng DNA barcode cho
thực vật (kỹ thuật nhận biết các loài sử dụng trình tự DNA ngắn). Ở mức
độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
gũi) và đã được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu. Thuận lợi của
vùng ITS là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và ITS2) nằm hai
bên với locus 5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu bị hư hại.
loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự nucleotit đảm bảo độ chính xác cao
nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, trong
nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các
biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa cha
mẹ và con cái ; (3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác
loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà
vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…;
và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố
khách quan do môi trường hay con người gây ra.
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử
đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát
hiện các loài mới, giải quyết các nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy
đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của
nhiếu loài động thực vật và vi sinh vật [23]. Các kết quả nghiên cứu ở
mức độ DNA đã và đang góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định
hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài
nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam [52].
Do có giá trị sử dụng và thương mại lớn, nên nghiên cứu đa dạng di
truyền đối với một số loài cây gỗ quý của chi Dalbergia sử dụng các chỉ thị
RAPD, cpSSR, AFLP cũng được nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu.
Chẳng hạn, Olivarimbola và cộng sự (2004) [21] đã dựng mối quan hệ di
truyền của 122 cá thể loài Dalbergia monticola của Madagascar bằng việc
phân tích với 60 chỉ thị RAPD và 03 chỉ thị cpSSR, kết quả nhận được cho
thấy các quần thể cây ở vùng trung tâm phía Bắc có nguồn gốc từ vùng
Holocene của phía Nam. Tương tự, các nhóm tác giả ở Pháp, Ấn Độ,
Brasil cũng đã sử dụng các chỉ thị RAPD, SSR để nghiên cứu mối quan
hệ di truyền giữa các loài, các quần thể và xác định trình tự các đoạn gen
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành
Luận văn tốt nghiệp Đỗ Minh Thành 24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
vật là nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải [8] đã dùng gen ty thể (18S
rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định DNA một số loài lan Hài, cây
Bình vôi, chim (gà Lôi), cá (cá Vược) và đã phát hiện ra mức độ tiến hóa
của chúng. Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử
dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh
chủng loại của một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [2,4].
Nguyễn Thuý Hạnh (2006), Lê Thị Muội và cs (2005) đã dùng chỉ thị
ISSR và cpSSR để nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài chi họ Dầu và
Lạc của Việt Nam [9,15]. Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã
dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây Vạn tuế của Việt
Nam làm cơ sở cho công tác bảo tồn đa dạng di truyền [13].
Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp
phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn rất ít. Đặc biệt đối với
nhóm cây rừng nói chung và loài gỗ quý có nguy cơ truyệt chủng nói riêng
nên cần tập trung nghiên cứu có hệ thống.
1.5.2. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karry Mullis và
cộng sự mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách
mạng trong sinh học phân tử. Đây là phương pháp invitro để nhân bản
nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế
(cỡ 10
-3
µg
). Kỹ thuật này có độ nhạy cảm rất cao và được ứng dụng trong
vật chất di truyền hay cơ thể. Trong nghiên cứu này là sự giống và khác
nhau về cấu trúc DNA giữa các loài. Các taxa được nối với nhau trên cây
thể hiện mối quan hệ di truyền giữa chúng, khoảng cách càng lớn, mối
quan hệ di truyền càng xa và ngược lại. Trên cây có rễ mỗi nút bên trong
cây đại diện cho một loài tổ tiên chung. Giả định nút gần nhất với rễ là
loài khởi điểm, các nút còn lại được toả ra từ nút này được gọi là con
cháu. Mỗi một nút được gọi là một đơn vị phân loại, các nút trong cây
được gọi là các đơn vị phân loại giải thiết. Độ dài của cành cây mô phỏng
thời gian tiến hoá. Cây không rễ là cây không có điểm khởi đầu, do đó nó
không tái dựng lịch sử tiến hoá của các loài. Cây không rễ chỉ cho biết
mối quan hệ họ hàng giữa các loài hiện tại. Có 4 phương pháp tạo cây bao
Copyright: Tài liệu đại học ©