Số hóa bởi trung tâm học liệu ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM VĂN PHÚC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR
PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus
VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM
PHẠM VĂN PHÚC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR
PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus
VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã Số: 60420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN VĂN DUY Số hóa bởi trung tâm học liệu ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Lê Quang Hòa,
trưởng phòng Công nghệ gen, Viện CNSH&CNTP, Trường Đại học Bách Khoa
Hà Nội; TS. Nguyễn Đắc Trung, phó trưởng khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học
4.1. Ý nghĩa khoa học 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus và Salmonella 3
1.1.1. Trên thế giới 3
1.1.2. Ở Việt Nam 6
1.2. Tổng quan về Salmonella typhi và Staphylococcus aureus 7
1.2.1. Salmonella typhi 7
1.2.1.1. Hình thái, cấu tạo của Salmonella typhi 7
1.2.1.2. Cấu trúc di truyền của Salmonella typhi 10
1.2.1.3. Các chỉ thị phân tử của Salmonella typhi 11
1.2.1.4. Đặc tính sinh học của Salmonella typhi 12
1.2.1.5. Đặc tính gây bệnh của Salmonella typhi 14
1.2.2. Staphylococcus aureus 15
1.2.2.1 Hình thái , cấu tạo của Staphylococcus aureus 15
1.2.2.2. Cấu trúc di truyền của Staphylococcus aureus 18
1.2.2.3. Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus 18
1.2.2.4. Đặc tính sinh học Staphylococcus aureus 19
Số hóa bởi trung tâm học liệu iv
1.2.2.5. Đặc tính gây bệnh do Staphylococcus aureus 22
1.3. Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 24
1.3.1. Các phương pháp vi sinh 24
1.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử 25
1.4. Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR 27
1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật multiplex PCR 27
1.4.2. Ứng dụng của kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây
Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 40
3.2. Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus
và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR 43
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn 43
3.2.2. Nghiên cứu nồng độ DNA tối thiểu của các phản ứng PCR đơn phát hiện riêng
rẽ Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 45
3.2.3. Tối ưu phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus
aureus và Salmonella typhi 47
3.2.4. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các chủng vi khuẩn
thuần …………………………………………………………………………… 53
3.2.5. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các phương pháp tách chiết
DNA khác nhau 54
3.3. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh
và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. 56
3.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng
thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. 57
Chƣơng 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 60
4.1. Kết luận 60
4.2. Kiến nghị 61
Số hóa bởi trung tâm học liệu vi
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62
DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tên đầy đủ
Số hóa bởi trung tâm học liệu viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp
KauffmannWhite. 8
Bảng 1.2. Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci 22
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 32
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 32
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33
Bảng 3.1. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số của các chủng vi khuẩn
nghiên cứu. 44
Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR khi
sử dụng 2 phương pháp tách chiết DNA khác nhau 55
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex
PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. typhi và S. aureus 57
Số hóa bởi trung tâm học liệu x
Hình 3.10. Kết quả điện di kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR
trên các chủng vi khuẩn kiểm định. 58
Số hóa bởi trung tâm học liệu 1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm trở lại đây vấn đề bảo đảm chất lượng và an toàn thực
phẩm (ATTP) đang là mối quan tâm đặc biệt ở nước ta và nhiều nơi trên thế
giới. Thực tế hiện nay thực phẩm có nguồn gốc từ động vật, gia cầm bán ở các
chợ, cửa hàng lại không đảm bảo chất lượng. Chính vì vậy con người có thể bị
nhiễm vi sinh vật thông qua thức ăn sống hoặc nấu chưa chín như thịt, gia cầm,
trứng và các sản phẩm sữa [54]. Điều đó cũng lý giải vì sao mà hàng năm có rất
nhiều vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) xảy ra. Trên thế giới các vụ ngộ độc thực
phẩm có xu hướng ngày càng tăng [37]. Trung bình cứ 1.000 dân có 175 người
bị NĐTP mỗi năm và chi phí cho 1 ca NĐTP mất 1.531 đôla Mỹ (FDA 2006).
Ở Việt Nam theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục An toàn vệ sinh thực
phẩm (ATVSTP) từ đầu tháng 4/2012 đến hết tháng 12/2012 cả nước đã xảy ra
10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong đó có 726 người phải nhập
PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella
typhi gây bệnh trong thực phẩm”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
Xây dựng được kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời
Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm với độ nhạy
và độ đặc hiệu cao.
3. Nội dung nghiên cứu
* Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR.
* Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus
aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR.
* Xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và
đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi.
* Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và
đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi.
4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng
thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm. Tạo tiền
đề khoa học cho việc phát triển bộ kít phát hiện nhanh hai loài vi khuẩn gây
bệnh này trong mẫu thực phẩm.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Số hóa bởi trung tâm học liệu 3
Kết quả nghiên cứu sẽ tạo tiền đề phát triển bộ kít phát hiện nhanh và
đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm góp
phần giám sát chất lượng ATTP.
Chƣơng 1
đã được xác định vai trò gây bệnh. Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn,
nấm, ký sinh trùng và virút, trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% số ca
bệnh tử vong ở người. Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản
xuất và phân phối một sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian
địa lý dẫn đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm.
Đồng thời, trong quá trình công nghiệp hóa, thực phẩm được sản xuất hàng loạt
đã làm khả năng nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao. Số ca mắc các bệnh
do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [51].
Mặc dù y học hiện nay đã khá phát triển, song các tác nhân gây bệnh trực
tiếp từ thực phẩm vẫn chưa được phát hiện đầy đủ. Tại Mỹ, chỉ có 14/76 triệu ca
mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện và 1,8/5 nghìn ca tử vong do nhiễm độc thực
phẩm là chẩn đoán được chính xác nguyên nhân [51]. Trong số các nguyên
nhân đã được xác định, có một số mầm bệnh có khả năng gây nhiễm trùng,
nhiễm độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao như: Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera,
Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica. Tụ cầu vàng gây ra
khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm và hàng năm Mỹ mất khoảng 1,5
tỉ đô la cho những vụ ngộ độc do tụ cầu [57]. Ngoài vấn đề viện phí còn phải
mất nhiều thời gian làm việc cũng như sản phẩm lao động của người bệnh, và cả
việc phải loại bỏ những sản phẩm bị nhiễm.
Vụ ngộ độc lớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở
Michigan do phomai. Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt bò bị nhiễm vi
sinh vật. Thịt bò bị nhiễm tụ cầu vàng cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo,
Michigan vào năm 1907. Năm 1914 ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa
lấy từ bò bị viêm vú đã gây ra ngộ độc ở người. Năm 1930, Dark lại xác định
được vụ ngộ độc do S. aureus từ bánh giáng sinh [50].
Cách đây vài thập niên, các vụ ngộ độc do tụ cầu chiếm 25% các vụ ngộ
độc thực phẩm ở Mỹ [57]. Từ năm 1988 đến 1992, S. aureus gây ra 5,1% trong
Số hóa bởi trung tâm học liệu
Thủ phạm chính bị nghi ngờ là cà chua, ớt đỏ và ngò tươi. Tốc độ nhiễm trung
Số hóa bởi trung tâm học liệu 6
bình là 25-40 ca mỗi ngày, lan tràn trong 41 tiểu bang. Tại Canada cũng có 4
trường hợp [9].
1.1.2. Ở Việt Nam
Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ
cầu vàng để lại hậu quả không nhỏ. Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới,
hàng năm Việt nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại
trên 200 triệu đô la. Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở
nước ta ngày càng gia tăng. Năm 2000 có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233
người mắc 59 người tử vong [3].
Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong
những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do
tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40 - 45% trong các loại gây ngộ độc,
trong số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là vi khuẩn Staphylococcus
aureus và vi khuẩn Salmonella typhi [8].
Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa
dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), xúc xích
(96,6%), bánh gato (85%), patê (83,3%). Đáng chú ý là vi khuẩn S. aureus
thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [10]. Qua các cuộc
khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại
các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao, phù hợp với
các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố Hồ Chí Minh trong
những năm qua. Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30 mẫu
(53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) [6], [8]. Điển hình là vụ ngộ độc
thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất và Sinh học trường Đại học Khoa
của màng tế bào. Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu
đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường. Những thay đổi trong thành
phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại kháng
nguyên O khác nhau. Kháng nguyên O được chia thành các nhóm kháng huyết
thanh khác nhau (serogroup) qui ước bằng số như O9, O2, O4 [29].
Số hóa bởi trung tâm học liệu 8
Salmonella là vi khuẩn đường ruột duy nhất có thể biểu hiện hai loại
kháng nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau [29]. Tuy nhiên
hoạt động của 2 gen được phối hợp sao cho chỉ một kháng nguyên H được biểu
hiện ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn [29]. Hai kháng nguyên H này
được xếp vào pha 1 và pha 2. Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu hiện
một kiểu kháng nguyên duy nhất do sự bất hoạt của gen mã hóa cho kháng
nguyên pha 1 hoặc pha 2. Ngoài ra, một số tuýp huyết thanh “đơn pha” do tự
nhiên như S. enteriditis, S. typhi.
Theo phương pháp định danh này, Salmonella được chia thành hai loài:
Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella
enterica phân loài V). Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài qui định
bằng tên hoặc số La Mã. Trong đó S. typhi thuộc phân loài I [27].
Bảng 1.1. Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp
KauffmannWhite [27].
Loài và phân loài
Salmonella
Số lƣợng tuýp
huyết
thanh trong mỗi
phân loài
Salmonella enterica và phân loài enterica [27].
Salmonella typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I
9,12(Vi):d:- để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9, 12
và mang thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không có
kháng nguyên H pha 2. Phần lớn (59%) tuýp huyết thanh của Salmonella thuộc
S. enterica phân loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là
O2, O4, O9 gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động
vật máu nóng [27].
* Đặc điểm cấu trúc của Salmonella typhi (Hình 1.1)
Hình 1.1. Cấu trúc tế bào vi khuẩn S. typhi [59]
Salmonella typhi có chiều dài 2-3µm và đường kính 0,5 µm, cấu trúc gồm
2 màng, màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng
nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào. Màng trong và màng ngoài đều là các
lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế bào.
Số hóa bởi trung tâm học liệu 10
Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra khỏi tế
bào chất [59].
Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O. Ở S. typhi và S.
paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân tử của axit
Nacetylglucosamine uronic, nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao phủ kháng
nguyên O. Salmonella typhi còn mang các roi dài 2-5 µm là sự kéo dài của các
thể nền bên trong tế bào. Hầu hết Salmonella được bao phủ bởi lớp lông giúp
cho sự gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ. Những sợi lông này có đường
kính khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợi roi, cấu trúc từ các
trí đa hình [42]. Việc tìm hiểu những vi khuẩn có tính đa dạng di truyền thấp như
S. typhi gặp rất nhiều khó khăn và đòi hỏi những kỹ thuật phức tạp [12].
Trình tự gắn chèn IS200 là một nhân tố di truyền có thể di chuyển. Ở E.
coli không có trình tự này. Trình tự IS200 được tìm thấy trên các locus bảo tồn
ở nhiễm sắc thể của nhiều tuýp huyết thanh của Salmonella. Trong nghiên cứu
của mình, Gibert đã xác định số lượng nhân tố IS200 trên 15 chủng S. typhi dao
động từ 10-25. Do số lượng bản sao nhiều và khác biệt đáng kể nên IS200 được
xem là chỉ thị thích hợp để phân biệt các kiểu di truyền ở S. Typhi [34]. Tuy
nhiên trong một nghiên cứu dịch tễ sử dụng trình tự IS200 để phân biệt các kiểu
di truyền ở S. typhi chỉ tìm được 11-15 nhân tố IS200 trên nhiễm sắc thể S.
typhi. Dựa vào các trình tự này có thể xác định được một số kiểu di truyền ở S.
typhi nhưng hiệu quả phân biệt không cao [59].
1.2.1.3. Các chỉ thị phân tử của Salmonella typhi
Cho đến nay, nhiều trình tự gen của Salmonella typhi đã được sử dụng
làm chỉ thị trong việc phát triển các phương pháp phát hiện nhanh loài vi khuẩn
này. Chaudhry R. và cộng sự (1997) đã sử dụng gen fliC-d mã hóa cho kháng
nguyên lông có mặt ở hơn 100 phân loài của Salmonella để phát hiện S. typhi
[30]; Hashimoto Y. và cộng sự (1995) đã sử dụng gen kháng nguyên vỏ ViaB
làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi [36]; Zhu Q. và cộng sự (1996) đã sử dụng
gen 16S rRNA làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi [78]; Pui C. F. và cộng sự
(2011) đã sử dụng gen 23S rRNA làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi [63].
Kumar S. và cộng sự (2005) đã sử dụng multiplex PCR để khuếch đại bốn trình
tự gen invA, viaB, flic-d, prt nhằm phát hiện vi khuẩn S. typhi [44]. Gen prt là
một phần của cụm gen rfb và mã hóa cho CDP paratose synthase trong đó
Số hóa bởi trung tâm học liệu 12
chuyển đổi CDP-4-keto-3, 6 - dideoxyglucose thành CDP paratose. Gen này
S
Số hóa bởi trung tâm học liệu 13
từ cơ chất sulphat tan. Chúng sinh catalase nhưng không tạo oxidase trong quá
trình sống [39].
Điều khác biệt giữa S. typhi so với hầu hết Salmonella là không bao giờ
sinh hơi từ glucose, không sử dụng citrate hoặc decarboxylate orthinine và
không lên men rhamnose. Salmonella typhi không sinh indole, thử nghiệm
Voges-Proskauer âm tính, phenylalanine deaminase và urease âm tính. Các đặc
tính sinh hóa này được sử dụng kết hợp với các thử nghiệm ngưng kết kháng
huyết thanh trong định danh S. typhi [39].
Salmonella typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không gây
bệnh ở bất kỳ sinh vật nào khác. Salmonella typhi có khả năng thay đổi để
chống lại các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp vì vậy rất
khó để loại bỏ tận gốc vi khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn. Salmonella typhi có thể
tồn tại ở thịt chưa được nấu chín và xâm nhập qua hàng rào cản axit dạ dày để
gây bệnh ở người [39].
Copyright: Tài liệu đại học ©