B GIÁO DC VÀ ÀO TO
TRNG I HC M TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
 TÀI:
KHO SÁT TÌNH TRNG METHYL HÓA
TI CÁC O CpG THUC VÙNG PROMOTER
CA GEN GSTP1 TRÊN MT S LOI UNG TH

KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH-SINH HC PHÂN T

Ging viên hng dn: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
ThS. Lao c Thun
Sinh viên thc hin: Võ Th Ngha
MSSV: 1053010489
Khóa hc: 2010 - 2014
Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014
Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha i

LI CM N
 có đc bài báo cáo khóa lun nƠy thì đơy lƠ kt qu ca mt thi gian dài tìm hiu
và thc hin đ tài, ngoài nhng n lc ca bn thân thì s giúp đ, hng dn ca các
thy cô góp mt phn rt ln đ em có th hoƠn thƠnh đ tài này.
Li đu tiên em xin chân thành cm n Cô_PGS.TS Lê Huyn Ái Thúy lƠ ngi đƣ
đng tên hng dn em trong k khóa lun tôt nghip này, em xin chân thành cm n
cô đƣ hng dn, góp Ủ đ em có th hoàn thành tt bài báo cáo.
Em cng xin chơn thƠnh cm n Thy_ThS Lao c Thun là mt ngi thy, ngi

1.2 TNG QUAN V DU CHNG SINH HC (Biomarkers) 7
1.3 EPIGENETICS 9
1.3.1 Khái nim epigenetics 9
1.3.2 o CpG 10
1.3.3 Khái nim methyl hóa DNA 11
1.3.4 C ch gơy ung th do s methyl hóa DNA 13
1.4 TNG QUAN V GEN GSTP1 15
1.4.1 GST (glutathione S-transferases) 15
1.4.2 Gen GSTP1 (Glutathione S Tranferase P1) 15
1.4.3 C ch hot đng ca GSTP1 16
1.5 Các phng pháp phát hin s methyl hóa DNA 19
1.5.1 Phng pháp bin đi BSP (Bisulfide sequencing PCR) 19
1.5.2 Phng pháp Methylation Specific PCR (MSP) 19
PHN 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU
Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha iii

2.1 VT LIU 20
2.1.1 Khai thác c s d liu 20
2.1.2. Kho sát in vitro 21
2.2 PHNG PHÁP NGHIÊN CU 23
2.2.1 Khai thác c s d liu 23
2.2.2 Kho sát in silico 23
2.3 KHO SÁT IN VITRO 24
2.3.1 Tách chit DNA 24
2.3.2 Kim tra cht lng DNA thu nhn bng phng pháp đo quang ph 26
2.3.3 Bin đi bisulfide DNA 26
2.3.4 Phn ng MSP 27

PH LC 67

Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha v DANH MC HỊNH
Hình 1.1 T l mc bnh và t l t vong trên toàn th gii nm 2012 4
Hình 1.2 T l mc bnh và t vong vì ung th ca Vit Nam nm 2012 6
Hình 1.3 Methyl hóa DNA đc nghiên cu rng rƣi nh mt du chng sinh hc 8
Hình 1.4 S methyl hóa ca cytosine to thành 5-methylcytosine 10
Hình 1.5 S b sung nhóm -CH
3
vào v trí 5’ca cytosine nh enzyme DNMTs 12
Hình 1.6 Mô hình s bin đi gen bi methyl hóa DNA to khi u 13
Hình 1.7 C ch gơy ung th ca DNA methylation 14
Hình 1.8 V trí gen GSTP1 trên NST s 11 16
Hình 1.9 Chc nng ca protein GSTP1 trong t bào 17
Hình 1.10 Mô hình mô t tng tác ca GSTP1-JNK và GSTP1- TRAF2 trong con
đng diu chnh tín hiu JNK và TNF- . 18
Hình 1.11 Biu đ tn s methyl hóa ca GSTP1 qua các loi mu ung th vú khác nhau
34
Hình 1.12 Biu đ tn s methyl hóa ca GSTP1 qua các loi mu ung th c t cung
khác nhau 36
Hình 1.13 Biu đ tn s methyl hóa ca GSTP1qua các loi mu ung th tuyn tin lit
khác nhau 39
Hình 1.14 V trí gen GSTP1 trên nhim sc th s 11[92] 40
Hình 1.15 Các đo CpG trên vùng promoter gen GSTP1 41

t cung 35
Bng 1.8 Thng kê tn s Methyl hóa ca gen GSTP1 trên mu ung th tuyn tin lit . 36
Bng 1.9 Thng kê tn s methyl hóa trung bình có trng s caGSTP1 trên ung th
tuyn tin lit 38
Bng 1.10 Trình t mi methyl tham kho t nghiên cu trc ca phòng thí nghim sinh
hc phân t 45
Bng 1.11 Thông s vt lý ca mimethyl k tha ti phòng thí nghim sinh hc phân t
đi hc M TP.HCM 45
Bng 1.12 Mi tham kho t các bài báo thng kê 47
Bng 1.13 Thông s đánh giá mi theo IDT 48
Bng 1.14 Nng đ và cht lng DNA tách chit 49
Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha viii

Bng 1.15 Tng kt kt qu methyl hóa ca GSTP1 trên 10 mu ung th vú 53
Bng 1.16 Mc đ liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter ca GSTP1 vi
ung th vú 57

Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha ix DANH MC CH VIT TT
CpG: Cytosine phospho guanine
DNMTs: DNA methyltransferase
DNMT1: DNA methyltransferase 1

PHN 1
TNG QUAN

Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha 1

T VN 
Theo T chc Y t Th gii (WHO) ung th lƠ nguyên nhơn dn đu trong các
nguyên nhân gây t vong trên toàn th gii. Theo thng kê, có khong 8,2 triu ngi
cht vì ung th nm 2012 trên toàn th gii và khong 60% các trng hp bnh mi
đc phát hin. Hin có rt nhiu nghiên cu ch ra rng có nhiu nguyên nhân dn
đn ung th, trong đó bao gm tình trng methyl hóa mt cách quá mc  mt s gen
liên quan đn c ch khi u [91].
Nh đƣ nói  trên, methyl hóa là mt trong nhng nguyên nhân dn đn ung th
nói riêng và epigenetics nói chung. Epigenetics là mt nhóm các thay đi xy ra  mc
đ di truyn lƠm thay đi s biu hin gen nhng không lƠm thay đi cu trúc DNA.
Epigenetics bao gm nhiu bin đi khác nhau, trong đó hin tng methyl hóa DNA
là mt trong nhng bin đi epigenetics đc quan tơm hƠng đu. Methyl hóa DNA là
mt loi bin đi cng hóa tr dn đn s gn nhóm -CH
3
vào v trí cacbon s 5 ca
Cytosine trong cp nucleotide CpG nh s xúc tác ca enzyme DNA
methyltransferase [4].
Hin nay vai trò ca nhng bin đi epigenetics trong ung th đƣ đc thng kê
mt cách rõ ràng [55, 10]. Trong đó, methyl hóa DNA đc hiu là làm im lng trên
nhng gen c ch khi u trên  nhiu loi ung th khác nhau [55]. Tn s methyl hóa
đc thng kê trên nhng giai đon sm ca ung th đƣ thúc đy vic phát trin các
du chng sinh hc trong chn đoán bnh [38, 39, 74, 75]. Vì vy, ngày nay


SV: Võ Th Ngha 3 1.1 TNG QUAN V UNG TH
Theo T chc Y t Th gii (WHO): Ung th lƠ mt thut ng chung cho mt
nhóm ln các bnh có th nh hng đn bt k phn nào ca c th. Mt đc trng
ca ung th lƠ s tng lên nhanh chóng ca các t bào mt cách bt bình thng. Các
t bào phân chia và phát trin không kim soát đc, hình thành các khi u ác tính và
xâm nhp vào các b phn  gn hoc xa c th thông qua h thng bch huyt hoc
máu ca c th, hin tng nƠy đc gi lƠ di cn [90]. Ung th phát sinh t mt t
bƠo đn l. Vic chuyn đi t mt t bƠo bình thng thành t bào khi u là mt quá
trình gm nhiu giai đon, thng là mt s tin trin t mt tn thng tin ung th
đn các khi u ác tính. Nhng thay đi này là kt qu ca s tng tác gia các yu t
di truyn ca ngi và các tác nhân bên ngoài, bao gm: tác nhân vt lý, chng hn
nh bc x t ngoi và bc x ion hóa; tác nhân hóa hc, chng hn nh aming, các
thành phn ca khói thuc lá, aflatoxin (cht gây ô nhim thc phm) và thch tín
(mt cht gây ô nhim nc ung) và các tác nhân sinh hc, chng hn nh nhim
trùng virus, vi khun hoc ký sinh trùng [90].
Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha 4

1.1.1 Tình hình ung th trên th gii
Theo s liu thng kê ca WHO, nm 2012 trên toƠn th gii có khong 14,1
triu trng hp ung th mi đc phát hin, 8,2 triu ngi t vong và 23,6 triu
ngi sng vi ung th. Trong đó có khong 60% các trng hp bnh mi phát hin
xy ra  các nc châu Phi, châu Á, Trung và Nam M. Cng theo d đoán ca WHO,
trên th gii s có khong 1,5 triu ngi t vong vì ung th vƠo nm 2015 [91].

150.000-200.000 ngi mc bnh ung th mi và khong 75.000-100.000 ngi t
vong vì ung th [87]. Do đó, đơy thc s là mi quan tâm y t hƠng đu ca quc gia.
Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha 6

Trên toàn quc, ch có mt s bnh vin nhƠ nc hƠng đu có th tin hành vic cha
tr ung th mt cách hiu qu, bao gm: Bnh vin Ung th Quc gia và bnh vin
Bch Mai  Hà Ni, bnh vin Ung Bu Tp.HCM, bnh vin Ung Bu Gia nh và
bnh vin Ch Ry Tp.HCM. Chính vì th Vit Nam hin ch đáp ng đc 20-30%
nhu cu đc điu tr ca bnh nhân ung th. iu này dn đn thc trng các bnh
vin điu tr ung th ti Vit Nam luôn luôn trong tình trng quá ti [87].
Ngoài ra, phn ln các bnh nhơn ung th  Vit Nam (khong 70%) ch đn
bnh vin điu tr khi đƣ quá mun, khin cho c hi cha khi bnh rt thp. Theo
thng kê, t l cha khi bnh ung th  Vit Nam là 35% [87].

Hình 1.2 T l mc bnh vƠ t vong vì ung th ca Vit Nam nm 2012 [91]
Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha 7

1.2 TNG QUAN V DU CHNG SINH HC (BIOMARKERS)
Theo Vin Y T quc gia Hoa K (NIH-US National Institutes of Health),du
chng sinh hc ung th (Cancer Biomarker) lƠ mt phơn t sinh hc cho thy du hiu
v s hin din ca ung th. Phơn t sinh hc nƠy có th đc tit ra bi khi u hay
mt đáp ng đc bit ca c th đi vi s hin din ca ung th. Mt phơn t sinh
hc có th đc tìm thy trong các mô, trong máu, hoc trong các dch khác ca c
th. Du chng sinh hc có th lƠ mt du hiu ca mt quá trình bình thng hay bt

xy ra trc tip thông qua methyl hóa DNA ca gen hoc gián tip bi methyl hóa,
acetyl hóa, phosphoryl hóa histone [59]. Trong đó s methyl hóa DNA lƠ mt trong
nhng bin đi biu sinh quan trng. Trong nhng nm gn đơy thì methyl hóa DNA
càng tr nên rõ rƠng hn trong các s kin bin đi epigenetics gơy ung th vƠ các
bin đi di truyn bt thng [31].Chính vì th mƠ du chng sinh hc ung th lƠ s
methyl hóa DNA đang rt đc quan tơm.

Hình 1.3 Methyl hóa DNA đc nghiên cu rng rƣi nh mt du chng sinh hc [16]
Hình 1.3 là biu đ thng kê v mc đ s dng ca các bin đi epigenetics
trong vai trò là mt du chng sinh hc và du chng sinh hc trong ung th. Qua biu
đ ta có th nhn thy rõ vai trò đc bit quan trng ca s methyl hóa DNA trong
vic làm mt du chng sinh hc nói chung và du chng sinh hc trong ung th nói
Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha 9

riêng vi s lng các bài báo nghiên cu rt nhiu và chim t l cao vt tri so vi
nhng du chng sinh hc là epigenetics khác nh methyl hóa histone, acetyl hóa
histone, MicroRNAs hay RNA không mã hóa.
Du chng sinh hc methyl hóa DNA có th đc s dng cho phát hin c
nhng trng hp ung th giai đon đu cng nh nhng trng hp ung th di cn
hoc tái phát. Ví d nh s methyl hóa DNA trên vùng promoter ca gen p16 trong
huyt thanh có s tng quan vi tình trng tái phát ca ung th đi trc tràng [33]. S
phát trin ca phng pháp điu tr chng li nhng thay đi epigenetics trong t bào
ung th, cùng vi các xét nghim tiên lng và chn đoán da trên các mu DNA b
methyl hóa đc ha hn lƠ con đng mi cho vic ci tin trong chm sóc bnh
nhơn trong tng lai [14, 15, 20, 54, 60, 61, 66].
1.3 EPIGENETICS
1.3.1 Khái nim epigenetics

đng vt có vú, các đo CpG hin din đa s trong phn promoter ca gen [17 ,39 ,84].
Khi gen  trng thái bình thng thì ti nhng đo CpG trên vùng promoter ca gen
không b methyl hóa, ch nhng phân nhóm riêng bit t vùng promoter đn vùng
exon đu tiên ca gen b methyl hóa. Nhng v trí CpG nƠy đóng vai trò lƠ nhng đim
nhn bit ca các nhân t phiên mã, nhm đm bo s phiên mƣ bình thng ca gen.
Tuy nhiên, các đo này b methy hóa vi tn s cao hin din trong các t bào ung th
[31, 17].

Hình 1.4 S methyl hóa ca cytosine to thành 5-methylcytosine
Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy
Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha 11

1.3.3 Khái nim methyl hóa DNA
Methyl hóa DNA là mt hin tng ca epigenetics xy ra trong quá trình phát
trin bình thng ca t bào. Nó là mt loi bin đi liên kt cng hóa tr trong đó mt
nhóm methyl (-CH
3
) đc thêm vào v trí C
5
ca Cytosine trong cp dinucleotide CpG
nh xúc tác ca enzyme S-adenosylmethionine (SAM) [4, 5, 19, 37, 39, 51]. Quá trình
gn nhóm methyl này xy ra sau quá trình sao chép ca DNA [24]. Trên nhng t bào
bình thng có khong 3-6% cytosine là b methyl hóa, mc đ methyl hóa thay đi
mt cách đáng k trong quá trình phát trin ca con ngi và s phát trin ca bnh
trên nhng t bào khác nhau. S methyl hóa ca các dinucleotide CpG không phi là
mt s phân b ngu nhiên trên b gen ngi, chúng thng xy ra trên các đo CpG
thuc vùng promoter ca gen [36]. Bình thng có khong 50% các đo CpG b
methyl hóa, nhng đo CpG b methyl hóa nƠy thng nm trên vùng promoter ca

Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun

SV: Võ Th Ngha 13 Hình 1.6 Mô hình s bin đi gen bi methyl hóa DNA to khi u [54]
1.3.4 C ch gơy ung th do s methyl hóa DNA
Ung th lƠ kt qu ca nhiu c ch khác nhau trong c th, trong đó bao gm c
nhng bin đi biu sinh mƠ đc bit là hin tng methyl hóa trên DNA. S methyl
hóa DNA ti các đo CpG đóng mt vai trò quan trng trong vic điu tit biu hin
gen, mô hình bt thng trong methyl hóa DNA thng dn đn nhiu bnh khác nhau
[15, 32, 45, 77, 80].
Khi s methyl hóa quá mc xy ra trên vùng promoter ca các gen c ch khi u
s dn đn nhng hot đng bt n ca gen bng nhiu c ch khác nhau [11, 12].
Biu hin ca gen b c ch theo hai c ch riêng bit, c ch trc tip vƠ c ch gián
tip. i vi c ch trc tip, khi mt gen b methyl hóa quá mc thì quá trình sao
chép ca gen s b ngn chn vƠ quá trình phiên mƣ cng b kìm hãm.  c ch c ch
gián tip, c ch nƠy liên quan đn 2 loi protein methylation-binding protein (MBD).

Trích đoạn Ph ng pháp Methylation Specific PCR (MSP) ng 1.3 Chu trình nh it cho p hn ng MSP vi GSTP1

---