
Báo cáo KLTN-          Trang 1

T VN 
Theo thng kê ca T Chc Y T Th Gii (WHO), trên th gii có khong
14,1 tring hi và 8,2 tring hp t vong xy ra trong
i 12,7 tring hp mi mc bnh và 7,6 triu ng hp t
c tính cho th
tuc chc
  t cung là hai long gp và gây t
vong cao  ph n
[64]
.
Gen APC là gen c ch khm ti v trí 5q21-q22 trên nhim
sc th s 5 ca b i. Gen APC bao gm 15 exon nm trong mt locus
98-kilobase
[83]
. S methyl hóa xy ra ti co CpG xung quanh vùng promoter
gen APC, dn c ch s biu hin ca gen, là nguyên nhân dn t
[30]
.
S methyl hóa DNA là s bii phân t gn nhóm -CH
3
vào v trí Cytosin trong
o CpG ca trình t DNA. Nhiu báo cáo khoa hc trên th gii cho thy s
methyl hóa vùng promoter ca gen APC (Adenomatous polyposis coli gene) là du
chng sinh hc ting và ch
[37] [55]
[30]
.
Trên th gii, vic nghiên c tn s methyl hóa ca gen APC c

 Kho sát thc nghim
- Kh c hiu, nhi lai tp mi methyl và unmethyl.
- Thc hin quy trình phn    m methyl hóa vùng
promoter gen APC vi các mu sinh thit mô vú t nhng bnh nhân m
vú (kèm theo thông tin mu và các ch tiêu lâm sàng) và các mu mô vú lành tính,
c cung cp t bnh vii hc TP. H Chí Minh; mu máu hoc
dch pht t nh nhim HPV kiu uy
p, mu máu hoc dch pht t o lành tính (kèm theo các ch tiêu
lâm sàng) c công ty c phn công ngh Vit Á cung cp.

Báo cáo KLTN-          Trang 3 Phn I:
TNG QUAN

Báo cáo KLTN-          Trang 4

I.1. Ung th
I.1.1. nh ngha ung th
là  


 Quá trình dlà nguyên nhân


Báo cáo KLTN-          Trang 5

(leukemia) và u lympho bào (lymphoma), xut phát t máu và t
Bnh bch cng liên n vic sn xut quá mc các t bào bch cu
ng thành, các t  các chn d
bng d b nhim trùng. Bnh bch cn các t
bào hng cu, có th t mi do thiu máu.
    ng phát trin trong h bch huyt (lá lách, amidan, và
tuyn c).
 t phát t mô liên kt,
n, và cht béo.
 U hc t do ri lon ca t bào sc t.
 U quái bt ngun t các t bào mm.
I.1.3. Bnh ung th vú
 vong ph bin nht trong các b
ph n. Bnh ung  n s phát trin bng ca các t bào có
ngun gc t các mô vú
[49]
 xy ra  ph n mà còn  c
nam gii, t l mc bnh  nam gii chim khong 1% ca tt c ng hp

[91]
.
 Các yu t nguy c dn đn ung th vú:
Các yu t i vi bi tính n i ln
tui. Yu t m: Tin s i tit t, li sng và ch 
ng thiu khoa hng sng b ô nhim
 Tui và gii tính
i tác. Hu hng hp ung

.
 Yu t môi trng
Yu t ng có th  p xúc vi
hóa cht, tia bc x
[25][58]
.
I.1.4. Ung th c t cung:
 t cung là ng th hai trong s các long
gp  ph n trên toàn th gii và là nguyên nhân chính gây t 
ph n thuc n.
 Các yu t nguy c dn đn ung th c t cung:
Ht c ng hp  t n HPV
(Human Papiloma Virus), mt loc thù theo mô, d lây lan và
lây lan rng rãi. HPV là vi rút d lây nhing tình dc nht. Không có
thuu tr c hiu cho nhim HPV
[81]
.
HPV là mt t hp các chng vi rút khác nhau
[62]
. Trên th git t
100 chng HPV. Vi rút HPV c chia làm 2 nhóm: nhóm nhóm
p (v Các nhóm u ht các bnh
u môn - sinh dc, trong khi các nhóm p có th gây sùi
mào gà sinh dc, t bào c t cung bng, bng hô hp tái phát,

Báo cáo KLTN-          Trang 7

hoc ph bin nht là các viêm nhim không có triu chng và không phát hin

[80]

i  tuyn vú xut hin dch tit núm vú hoc mt khi u mi.
 Siêu âm
Siêu âm s dng sóng âm thanh tn s  quan sát hình nh ca các mô vú.
Siêu âm có th phân bit gia mt khi rn, có th t u nang cha
y d

Báo cáo KLTN-          Trang 8

 Chp cng t MRI
MRI s dng t ng  quan hình nh chi tit và cho phép phân bit m
t. MRI  c s d sàng lc
 nhng ph n mc bnh cao.
 Sinh thit t bào
Mu bnh phc qua sinh thit bng mt kim nh thích hp cho vic
ch bào hc. ó, mu mô c kim tra i kính hin vi  phân
tích trng thái ca bnh. Tuy nhiên, sinh thit t bào bng kim nh có th xy ra
hing âm tính gi 
I.1.5.2.Các phng pháp chn đoán ung th c t cung.
Theo t chc y t th gi  t cung có th  u tr
c phát hin sm. Các xét nghim Pap smear (pht t bào)
là th nghim duy nhc s dng rng rãi trong chc chng
minh là làm gim t l mc u t cung và t vong. Các xét nghim khác
(VIA, HPV, khoét chóp sinh thit CTC )  ha hn mang li hiu qu trong
chu tr.
 Sàng lc t bào hc ậ Pap’s smear
,  bào hc phát
hin nhng bng ca t bào bi phát hin s
c gi là Pap smear. Nguyên lý da trên tính cht bong ra mt cách t nhiên,
liên tc ca t c bit là các t bào bng có tính cht
bong sm và rt d bong.

i vi t bào tin n
si phi có phòng xét nghim hay nhân viên
o chuyên sâu. Kt qu cho thy ngay lp tu tr ngay
trong ln u kim tra.  nhy ca VIA tt bng hoc t nhy ca Pap
 smear, kim tra bng mng là rt ch
quan, và cn ph kim soát chng cm tra
bng mng. VIA có th không phù hp lm  ph n sau mãn kinh bi vì
vùng chuyn tip dch chuyn vào ng c t cung khi mãn kinh
[26][27][76][74]
.
 Phng pháp Sinh hc phân t HPV-PCR
Mu máu hoc mu t bào t c t cung, o c ly c xét nghim
dt sinh hc phân t c bit là PCR. Mm ca xét nghim
c thc hiu ki
không mang tính ch c bng mng và sàng
lc t bào hc. Bên cnh vic nh

Báo cáo KLTN-          Trang 10

nhim b nh các ph n  bnh  c t cung
[88]
.
I.1.6. Tình hình ung th trên th gii và  Vit Nam:
I.1.6.1. Tình hình ung th trên th gii
c tính, trên th gii có khong 14,1 tring
hi và 8,2 tring hp t vong x012, so vi
12,7 tring hp mi mc bnh và 7,6 triu ng hp t vong 
c tính cho thcó 32,6 trii ( tu
sng, c chm
[69]

Hình 1.1.1: Thng kê 10 bnh ung th gây t vong ph bin nht trên th
gii, s liu nm 2012
[105 ]
.
I.1.6.2. Tình hình ung th  Vit Nam
 
 do ung

 
. 
TP.HCM     

[96]
.
Ngoài ra, theo BS Trng Khoa Ni 4, bnh viu
thành ph H  1995-2010, ti Vit Nam, s ph
n mc b t cung; hin tr thành loi bnh
ng gp nht  n gii và s tip tng thi
ph n Ving có tâm lý e ng 
t cung n bnh s u tr hiu qu
[96]
. Bnh vin Ung
u thành ph H Chí Minh cho bit, mp nhn khong 300

Báo cáo KLTN-          Trang 12

bnh nhân b  c mu tri
Bnh vin K Hà Ni, mp nhi 200 b
vú mc mu tr. Ti Vit Nam b hóa so
vi các quc gia khác trên th gii tc là có nhiu ph n i 40 tui

.
Methyl hóa DNA là bii phân t xy ra do mt nhóm CH
3
liên kt cng hóa tr
vi cacbon s 5 ca Cytosin nm  v trí hai nucleotide Cytosin - Guanin (vit tt
là CpG - vi p là liên k gn gc -CH
3
vào DNA trong

Báo cáo KLTN-          Trang 13

quá trình phân bào nh các enzyme methyltransferases (DNMTs). DNMTs tìm
thy trong các t ng vt có vú bao gm DNMT1, DNMT3a, và DNMT3b
[13]
. Hình 1.2.1: S b xung nhóm CH
3
vào v trí cacbon s 5 ca Cytosin.
c bit ph bin trong gen c ch khi u và gen sa cha
DNA
[24]
. Methyl hóa ti các v trí CpG trong vùng promoter ca các gen c ch
khi u, sa cha DNA trong t u hòa, kim soát chu
k t bào, kt dính t bào, hoc sa cha DNA. S methyl hóa DNA bng 
nhng gen p16, INK4A, p14 ARF, p15, CCDN2, DAPK, MGMT, hMLH1, GSTP1,

[24][93]
.
Hình 1.2.2: S methyl hóa trong t bƠo bình thng và t bào ung th.
I.2.3. o CpG
Vùng trình t c khong 200bp vi tp hp CG chi
c g  o CpG
[50]
. Trong t  i có khong 70- o CpG b
methyl hóa, khong xut hin  vùng promoter và kéo
n exon 1 trong trình t gen cng vt có vú
[33]
. Khi DNA b methyl hóa
trong vùng promoter cc bu, các gen b bt hot
và im lng dn ri lou hòa trong các t bào khi u
[16][46]

vy, s methyl hóa to CpG thuc vùng promoter ca gen n
s biu hin ca gen c ch khi u, làm cho gen không th phiên mã và dn

I.3. Gen APC
I.3.1. Cu trúc gen APC và protein APC
Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) là gen c ch kh c Goss
K.H. và cs. 2000 thông qua liên kt ca nó vi mt hi chng di
truyn ci trc gi là n có tính cht 


 Kìm hãm con đng tín hiu Wnt kinh đin (Canonical)
Mt trong nhng v quan trng nht trong nghiên cu v gen APC là xác
nh ng chu trách nhim v sinh bnh hc u (tumorigenesis) ca nó.
Protein APC là yu t ng truyn tín hiu Wnt-catenin -
kim soát tng sinh và bit hóa t bào
[8]
.
Protein APC là mt phn ca phc hp Axin gây phosphoryl hóa -catenin, c
ch s dephosphory hóa ca -catenin, thúc y loi b -catenin t nhân, làm
gim phc hp -catenin/TCF trong nhân
[40][65][72]
. Bên cnh  protein APC
 liên kt vi -catenin, nhm  chn s  tác vi TCF
[65]
.

Hình 1.3.2 : Con đng truyn tín hiu Wnt kinh đin
[107]

 Kích thích s bám dính t bào
S bt hoy quá trình phát sinh khi u
qua vic làm m bám dính ca t bào
[14][15]
. Nhiu kt qu nghiên cu trên th
gii cho rng protein APC kích thích s bám dính t bào bng cách g-catenin
ti các vùng lp li Armadillo, các vùng lp li 15 ho kim soát

Báo cáo KLTN-          Trang 17


.
T nhng kt qu nghiên cc
[7][39][84]
, protein APC giúp s phân chia
chính xác nhim sc th bng cách gn vào các vi ng t   n (basic
domain)  u hòa các cha kinetochore - mt cu trúc protein  nhim
sc thi tr bào -  y
các nhim sc th xa ra.
 c ch s cht theo chng trình ca t bào (apoptosis)
Protein APC c ch s cht t    a t bào

Báo cáo KLTN-          Trang 18

bng cách g-catenin ti các vùng lp li Armadillo, các vùng lp li 15
ho c ch s cht t  n G2/M
trong chu trình t ng tín hi
cho s phân chia nhim sc th 
[28]
.
I.3.3. S methyl hóa gen APC trong ung th
S methyl hóa bng vùng promoter gen APC xy ra  rt nhiu loi ung
i trc tràng
[29][51]
i
[53[89]
vú
[45][89][30]
, ung
 t cung
[21]

th các mu mô lành tính là 87,7% (Rigi-Ladiz M., 2011).

Ti Vi c phát hin là 87,5%  các
m,8% trên các mô cách v trí khi u 5cm  các bnh nhân
 (Duong Thi Quynh Mai và cs., 2011
30
) Vit Nam kt hp
vi Thn nghiên cu v methyl hóa  các bnh nhân mc bi
trc tràng, và phát hin m methyl hóa  các bnh nhân Vit Nam và Thy
n lt là 44,9% và 53,8% (Dimberg JJ., 2013).
Các nghiên cu v m methyl hóa  vùng promoter gen APC c thc
hin  nhiu quc gia trên th gii và  nhiu louy nhiên, các nghiên
cu  Vit Nam còn hn ch, bên cu v  t
c công b, vì vy, nhóm chúng tôi thc hi tài n kho sát mc
 methyl hóa to CpG thuc vùng promoter gen APC  các bnh nhân
  t cung.
I.4. Phng pháp phát hin s methyl hóa DNA
Hin nay, m methyl hóa DNA có th ng rt
nhii trình t trc tip Direct sequencing
[35]
, Bisulphite
pyrosequencing
[59]
, Q-MSP
[18]
, Ms-SNuPE
[41]
 c bi    
c s dng nhiu nh n s methyl hóa  o CpG.
 Phng pháp Methylation Specific PCR (MSP)

mt phn ng PCR, nó n nhi  nóng chy c  
nhi bt cp ca mi v   phân bit gia trình t DNA methyl và
unmethyl, mi có cha v trí CpG càng nhiu càng tt (ít nht mt CpG) và tt
nht  u 3'. Ít nht mt trong ba nucleotide cui cùng tu 3' ca mi phi là
mt CpG "C".
Chiu dài mi là mt yu t quan trng trong phn ng dao

Báo cáo KLTN-          Trang 21

ng t 18 bp-ng hp c th thì chiu dài có th
c nghiu dài chung 15 bp-30 bp. Các cp mi chúng
tôi s dng có chiu dài hoàn toàn phù hp yêu cu, xem kt qu  bng 3.2.2.
Nhi nóng chy ca các m rt quan trng. Da vào
nhi nóng chy mà ta có th quynh nhi  (bt cp) trong phn ng
ng nhi nóng chy ca mi xuôi và mc nên xp x
nhau, nhi  chênh lch gia hai mi này không nên quá 5
o
C. Nhi nóng
chy ca các mi chúng tôi s dng có nhi chênh lch khong 2
o
C.
 Cu trúc th cp:
Kh t to cu trúc th cp ca mt tiêu chí quan trng
 i. Cu trúc này bao gm: hairpin loop, homo dimer và hetero dimer.
Nu cu trúc này càng bn vng thì hiu qu ca phn ng PCR s càng thp vì nó
s góp phn cn tr kh t cp ca các mi vào trình t 
  bn vng ca các liên ki ta dùng mt khái nim là
giá tr bing t  n
 không n phn ng PCR s dng các cp
mi khu  

II.2.1. Khai thác d liu và kho sát in silico
II.2.1.1. Thu thp trình t gen quan tâm, xác đnh v trí vùng cn tìm
Thu thp trình t nucleotide ca gen APC t ngân hàng gen có Accession
number NC_000005.10. Vùng kho sát kéo dài t  n exon 1A ca
gen. S dng phn mm trc tuyn Methprimer (
 xác
nh v trí các o CpG trong c vùng gen n quan tâm nht.
II.2.1.2. Phng pháp đánh giá, thit k mi
S dng   c tuyn TFSEARCH trên trang web
/>  nh v trí nhn bit ca
các nhân t phiên mã trên vùng promoter ca gen APC.
Thit k mi cho phn ng MSP b   
(www.urogen.org).
Kim tra kh t cp b sung, v trí bt cc sn phm to
thành ca các cp mi trên gen bng phn mm Annhyb.
 

Cui cùng, chúng tôi phân tích các thông s ca mi: Tm (nhi nóng chy),
chiu dài, t l % GC, kh o các cu trúc th cp ca mi, bao gm: self
dimer, hairpin loop và hetero dimer bng phn mm trc tuyn IDT

Báo cáo KLTN-          Trang 24

www.idtdna.com
  m t
thuyt ca các cp mi.
II.2.2.Kho sát in vitro
 Ni dung nghiên cu
Vi mh giá m o CpG thuc vùng promoter gen
APC bchúng tôi tin hành nghiên cu theo quy trình thc

(Thermo Final Test)
- 
+ Phenol (TBR)

Báo cáo KLTN-          Trang 25

+ Chloroform (Merck)
+ NaCl 5M
+ Tris HCl 1M (pH=8)
+ EDTA 0,5M (pH=8)
+ SDS 10%
+ Ammonium acetate 5M
+ Ethanol 100% (Merck)
+ Ethanol 70% (Merck)
+ Proteinase K (Fermentas)
 Phng pháp tin hành:
- Mu mô trong parafc ct nh và cho vào eppendorf 1,5 ml. Thêm 1 ml
xylene, vortex 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút, 2 phút.
- Thêm 1 ml Ethanol 100%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút, thu cn.
- Thêm 1 ml Ethanol 70%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút,
thu cn.
- Thêm 1 ml Ethanol 50%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút,
 trong vòng 30 phút.
- .  trong 56
o
C/3 ngày.
Thành ph
NaCl 5 M 14 µl
Tris-HCl 1 M, pH 8 14 µl
EDTA 0.5M, pH 8 14 µl