B GIÁO DC VẨ ẨO TO
TRNG I HC M TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài

KHO SÁT CÁC CH TIÊU VI SINH VT
TRONG MT S MU SA VÀ CÁC SN
PHM T SA KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T
CBHD: ThS. Nguyn Vn Hòa
ThS. Trn Th Ánh Nguyt
SVTH: Nguyn Uyên Vy
MSSV: 1053012976
Khóa: 2010 ậ 2014
DANH MC BNG
Bng 1.1:ăQuyăđnh ca b y t v gii hn vi sinh vt trong sn phm sa 10
Bng 3.1.1 :ăKtăquăthcăhinăkimătraămtăsăchătiêuăviăsinh
trên 20 muăsaăbtă 43
Bngă3.1.2:ăKtăquăthcăhinăkimătra mtăsăchătiêuăviăsinhă
trên 20 muăsaătiătitătrùng 44
Bngă3.1.3:ăKtăquăthcăhinăkimătra mtăsăchătiêuăviăsinhă
trên 15 muăsaăchua 45
Bngă3.1.4:ăKtăquăthcăhinăkimătraămtăsăchătiêuăviăsinhă
trên 30 muăphô mai 46
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 4

MC LC
T VNă 6
PHN 1: TNG QUAN 7
1.1. GII THIU V TRUNG TÂM K THUT TIÊU
CHUNăOăLNG CHTăLNG 3 (QUATEST 3) 7
1.2. TNG QUAN V SA VÀ VI SINH VT CN
KIM TRA TRONG SA 9
1.1.1. Tng quan v sa và các sn phm t sa 9
1.1.2. Vi sinh vt cn kim tra trong sa 10
PHN 2: VT LIU VẨ PHNG PHÁP NGHIểN CU
2.1. NI DUNG CHÍNH 18
2.1.1. THAO TÁC THU, BO QUN, CHUN B MU THC
PHM 18
2.1.2. K THUT KIM TRA CH TIÊU VI SINH TRONG THC
PHM 20
2.2. VT LIU VÀ PHNGăPHÁPăNGHIểN CU

Theo báo cáo gnăđơyăca T chc Y t Th giiă(WHO),ăhnă1/3ădơnăs cácănc
phát trin b nhăhng ca các bnh do thc phm gây ra miănm.ăi vi các
ncăđangăphátătrin, tình trng li càng trm trngăhnănhiu,ăhƠngănmă gơyăt
vongăhnă2,2ătriuăngi. Các v ng đcăcóăxuăhng ngƠyăcƠngătng.ăTrongăđó,ă
có khongăhnă50%ăcácăv ng đc thc phm là do tác nhân vi sinh vt.[14]
Trong cuc sng bn rnăngƠyănay,ăconăngiăđòiăhi s dng loi thc phm va
nhanh, tiên li,ăđng thiăcngăphiăđápăng nhu cu v mtădinhădng. Và nhóm
thc phm t sa chính là s la chnăhƠngăđu.
Sa và các sn phm t sa là loi thc phm có giá tr dinhădngăcaoăvƠăđyăđ
chtădinhădngănhăprotein,ăglucid,ălipid,ăchtăkhoáng,ăvitamin,ầăMt sn phm
không th thiu trong cucăconăngi. Nhngăcâu hiăđcăđt ra  đơyălƠăcácăsn
phm này có nhim vi sinh vt gây bnh?ăNóiăcáchăkhác,ăchúngăcóăđm bo cht
lng v sinh an toàn thc phm hay không?
Các sn phm t saăđc làm ra là c mt quá trình thu nhn ,ch bin,ăđóngăgói,ă
phân phi,ăluătr, bo qun. Ch cn mt hoc nhiuăgiaiăđon này cha vi sinh vt
gây bnh,ăđc t ca chúng s gây ra hinătng ng đc thc phm, nhăhng xu
đn sc khe caăngi tiêu dùng. Chính vì th, vic kim tra mt s ch tiêu v vi
sinh vt ca các sn phm t saătrcăkhiăđnătayăngi tiêu dùng là cc k quan
trng.
Vi mcăđíchăđó,ătôiăđưăthc hinăđ tài “Kho sát các ch tiêu vi sinh vt trong
sa và các sn phm t sa (t ngày 5/11 đn ngày 17/05/2014)”

 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 7

PHN 1: TNG QUAN
1.1. GII THIU V TRUNG TÂM K THUT TIÊU
CHUN O LNG CHT LNG 3 (QUATEST 3)[15]
1.1.1. a ch liên lc

- Kho sát, quan trc,ăphơnătích,ăđánhăgiáăthc trng công ngh, chuyn giao
công ngh.
- ƠoătoăvƠătăvnănngăsut chtălng, ng dng k thut mã s - mã vch.
- Ơoă to nghip v, chuyên môn và k thut v tiêu chună đoă lng cht
lng.
- Nghiên cu, ch to và cung cp các chună đoă lng, mu chun và các
phngătinăđo.ăTrangăb và cung cp dch v boătrì,ăbáoădng và sa cha
cácăphngătinăđoălng, th nghim, thit b k thut.
- Tip nhnăđngăkỦămưăs, mã vch.
- Cung cp thông tin, tiêu chun và các tài liuăliênăquanăđn tiêu chun,ăđoă
lng, chtălng.
1.1.3.2. Các lnh vc hot đng chính ca trung tâm
 C khí và không phá hy (NDT)
 Hàng tiêu dùng
  g gia dng
 Vt liu xây dng
 ină&ăđin t
 Tngăthíchăđin t (EMC)
 Hóa cht
 Môiătrng
 Du khí
 Thc phm
 Vi sinh - sinh vt binăđi gen (GMO)
1.1.4. Phòng vi sinh & GMO
1.1.4.1. Nng lc k thut chính
 Phân tích vi sinh trong thc phm, nông sn, m phm,ănc, thcănăchnă
nuôi,ăđ ung, phân vi sinh, ch phm sinh hc và các sn phm tiêu dùng
khác.
 tài khóa lun tt nghip


tanătrongănc. Cht béo trong saăcngăd xy ra nhng quá trình phân hy
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 10

lƠmă thayă đi thành phn và tính cht sa dnăđn gim chtă lngă vƠăhă
hng sa.
1.2.1.3. Protein
- Trong sa có 3 loi protein ch yu: casein chim khong 80%, lactalbumin
chim 12% và lactoglobulin chim 6%. Còn mt s li protein khác tuy
nhiênăhƠmălngăkhôngăđángăk.
1.2.1.4. Carbohydrate
- Carbohydrate có trong nhóm thc phm t sa ch yu là lactose. Lactose
khó b thyăphơnăhnăcácăloiăđng khác. Lactose b thy phân s cho mt
phân t glucose và mt phân t galactose.ăDi tác dng ca vi khun lactic,
lactose b lên men thành acid lactic gi là quá trình lên men lactic.
1.2.1.5. Cht khoáng
- Cht khoáng trong sa có nhiu loiă nh:ă kali,ă canxi,ă natri,ă st, nhôm,
mangan,ầ TrongăđóăcanxiăvƠăkaliălƠănhiu nht. Các mui khoáng trong sa
có nhiu loi, ph bin là muiăphotphat,ăclorua,ăcitrate,ầ
1.2.1.6. Vitamin
- Vitamin A, D
1
, B
2
,ăPP,ăC,ầ ă
1.2.2. Vi sinh vt cn kim tra trong sa [1,4]
Bng 1.1: Quy đnh ca b y t v gii hn vi sinh vt trong sn phm sa
TT
Sn phm

UHT hocăcácăphngă
pháp tit trùng bng nhit
đ cao khác
TSVSVHK (a)
10
2

Coliform
Không có
E.coli
Không có
(Hoc <3 MPN)
S.aureus
Không có
Listeria monocytogenes
Không có
Salmonella spp.
Không có
3
Sa lên men bao gm sa
lngăvƠăđc
Coliform
10
E.coli
Không có
(Hoc <3 MPN)
S.aureus
Không có
Listeria monocytogenes
Không có

Saăđc
Listeria monocytogenes
Không có
Salmonella spp.
Không có
6
Kem sa (cream)
6.1
Kem saăđc tit trùng
Coliform
10
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 12

bngăphngăphápăPasteur
E.coli
Không có
(Hoc <3 MPN)
S.aureus
Không có
Listeria monocytogenes
Không có
Salmonella spp.
Không có
6.2
Kem saăđc tit trùng
bngăphngăphápăUHT
TSVSVHK (b)
10

(a) TSVSVHK  21
o
C
(b) TSVSVHK  30
o
C
(*) Tính trên 25 g hocă25ămlăđi vi Salmonella spp. và Listeria monocytogenes
1.2.2.1. Vi sinh vt hiu khí
- Là nhóm vsv ch tngătrng và hình thành khun lc trongăđiu kin có O
2
.
S lng vsv hiu khí có mt trong mu thc phm biu th mcăđ v sinh
thc phm.
- Tng s VSV hiuăkhíăđcăxácăđnh bngăphngăphápăđm khun lc trên thch
đa.ăT mtălng muăxácăđnh,ătrênăcăs xem mt khun lc là sinh khi phát
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 13

trin t mt t bào hin din trong mu.ăđnăv biu din Colony forming unit CFU:
đnăv hình thành khun lc.
- Mt s tên gi khác :
 Tng s đmătrênăđa:ăTotalăPlateăCountă(TPC)
 S vi sinh vt hiu khí: Aerobic Plate Count (APC)
 Tng s vi sinh vt sng: Total Vable Count (TVC)
 S đmăđcătrênăđaăchun: Standard Plate Count (SPC)
1.2.2.2. Coliform
- Là nhóm nhng trc khunăđng rut gram âm, không sinh bào t, hiu khí
hoc k khí tùy nghi, có kh nngăsinhăacid,ăsinhăhiădoălênămenălactoseă
37

và lactose.
Kháng nguyên: Salmonella có trên 60 kháng nguyên O, kháng nguyên H có 1 hay 2
dng và kháng nguyên Vi.
c t:có 2 loiăđc t:ăăđc t rut và thn kinh
- c t rut gm niăđc t và ngoiăđc t. Niăđc t gm LT không chu nhit và
ST chu nhit.
- Ngoiăđc t thnăkinh:ătácăđng lên thn kinh.
Liu nhim trùng: liu có th gơyă đcă đi viă ngi khe mnhă thng 10
6
vi
khun/1g thc phm.ăNhngăđi vi tr emăvƠăngi già thì liu gây ng đc s
gimăhn.
1.2.2.4. Staphylococcus aureus
S.aureus là cu khun,ă gramă dng,ă xp
thƠnhăhìnhăchùmănho,ăkhôngădiăđng, không
to bào t, hiu khí hay k khí tùy nghi.
Tính cht sinh hóa:
Th nghim coagulase (+), catalase (+), MR
(+), VP (+), kh nitrat thành nitrit, có kh
nngălênămenăvƠăsinhăacidăt manitol,
saccharose, mn cm vi novobiocine, làm tan thch máu, chuăđc nngăđ mui
15%.
Kháng nguyên: S.aureus có kháng nguyên O gm peptidoglucan, protit A, acid
teichoic, hemolynase và mt s enzym gây đc.
c t: gm niăđc t và ngoiăđc t
Niăđc t nhăleukocidinădit bch cu, exfoliative to nt mnănc trên da
Ngoiăđc t nhă-toxinăvƠă-toxin làm tan hng cu.Ngoiăđc t rut enterotoxin
gơyătrúngăđc thc phm.
Tính gây bnh:
Hình 1.2: Staphylococcus aureus

chy cho tr emă vƠă ngi ln gm 2 loi LT (Thermolabiles) và ST
(Thermostable).
Hình 1.3: Escherichia coli qua kính hin
viăđin t
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 16

 Nhóm EIEC ( Enteroinvasine E.coli): đơyălƠănhómăE.coliăxơmăln. Chúng
gây loét niêm mcăđi tràng, tiêu chy lnăđƠm,ămáu.ăCácăchng này có phn ng
LDC (-)
 Nhóm EHEC (Enterohemorhagic E.coli): gây xut huyt rut và hi chng
tan máu-urê huyt,ăngoƠiăraăchúngăcònălƠănguyênănhơnăgơyăviêmăđi tràng xut
huyt.
 Nhóm EAEC (Enteroaggretive E.coli): vi khun nhóm này có yu t bám
dính ph kín b mt ngoài ca niêm mc rut góp phn to nên s xâm ln dai
dng và gây tiêu chy kéo dài dnăđn s kém hp thu các chtădinhădng.
Liu nhim trùng: liu gây nhimăquaăđng tiêu hóa là 10
6
-10
8
vi khun /ml (g).
1.2.2.6. Nm men, nm mc
- ơyă lƠă nhómă viă sinhă vt nhân
tht, có vách t bào là lp v
chitin, có nhân và các bào quan
khác. Tt c các loài men và mc
đu thuc nhóm vi sinh vt d
dng, chúng cn ngun carbon
huă căđ cung cpă nngă lng

L.monocytogenes là vi khun có hình gy ngn, mnh,ăgramădngăsauăkhiănuôiăcy
20 gi, là tác nhân gây bnh nguy him (nhim trùng máu, sy thai  ph n, viêm
màng não, gây t vong thai nhi) loƠiănƠyăthngăđc phát hin trong thcănăgiaă
súc,ănc,ănc thi,ălƠăloƠiăđc bit nguy him trong các loi thc phm đưăquaăgiaă
nhit.
c đim sinh hóa
Catalase (+), oxidase (-), chuynăđng xoay tròn tngăđt trong tiêu bn git treo,
có kh nngăthy gii esculin và làm tan huytătrênămôiătrng thch máu, sinh acid
t rhamnoseănhngăkhôngăxylose,ăphn ng CAMP (+) vi Staphylococcus aureus
và (-)ăđi vi Rhodococcus equi.
1.2.2.8. Bacillus cereus
Là nhng trc khunăgramădng,ăhiu khí và k khí tùy ý. LoƠiănƠyătngătrng
trong nhităđ t 5 ậ 50
o
C, tiăuă 35 ậ 40
o
C;ăpHădaoăđng t 4,5 ậ 9,3, d to bào
t và bào t ny mm rt d dƠng.Trênămôiătrng chn lc loài này to khun lc
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 18

rt to, mcălan,ărìaănhn.ăViăkhun này din hinătrongăđt, bi, các loi thc phm
(sa, tht, rau qu, hn hp gia v, sn phmăkhô,ầ).ă
c đim sinh hóa
Diăđng, to ni bào t,ălênămenăglucoseăsinhăhi,ăphn ng VP (+), có kh nngăs
dng nitrate.
c t
Vi khun có th tit ra 2 loiă đc t chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chy và
emetic toxin gây nôn ma.

2.1.1.3. Chun b mu th [12]
- Các sn phmăđông:ănên đcărưăđôngăbngăcáchăđ ngoài nhităđ phòng
(18-27)
o
C/3 h hoc (3± 2)
o
C/24 h, mu phi đc kim tra càng nhanh càng
tt.
- Các sn phm khô cng: nghin muănhngăkhôngăquáă 1 phút hocăđng
nht bng máy stomacher không quá 2,5 phút.
- Các sn phm lng hoc bán lng:ă trc khi phân tích lc bng tay hoc
máy.
- Các sn phm hn hp: lyăc s ca mi thành phnăđi din cho mu th
ca sn phmăbanăđu
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 20

2.1.1.4. Cách tin hành
2.1.1.4.1. Sa và các sn phm t sa
- Trn mu th nghim và lc nhanh bình cha mu, không quá 3 phút, tránh to
bt hoc cho btăvngăra.
- ng nht huynăphùăđ đc dung dch pha loãng 10
-1
. Chun b dãy pha loãng
caoăhnănu cn thit.
Hìnhă2.1:ăDưyăphaăloưngămă10
2.1.1.4.2. Sa bt, whey dng bt, saăchua,ăbăsa và lactose dng bt
- Lc và trn mu trong bình chaăchaăm. Nu mu th nghimăđng trong bình
chaăchaăm vƠăquáăđy thì cn chuyn mu vào mt bình cha lnăhnăsauăđóă

- Cn thc hin vi nhiuăđ pha loãng bc 10 liên tip sao cho xut hin các
khun lc riêng l trên b mt thch.
- ơyălƠăphngăphápătt nhtăđ xácăđnh mtăđ t bào sng.ăuăđimălƠăđ
nhyăcao,ăchoăphépăđnhălng vsv  mtăđ thp trong mu.ăPhngăphápă
nƠyăđc s dng ph bin trong kim nghim vi sinh vtătrongănc, thc
phm, bnh phm.
2.1.2.2. Phng pháp MPN
- Phngăphápăphaăloưngăti hn hay còn giălƠăphngăphápăđnhălng vsv
có xác xut cao nht hin din trong mtăđnăv th tích mu.ăPhngăphápă
này da trên kt qu đnh tính ca mt lot thí nghimăđc lp li  mt s
đ pha loãng khác nhau.
2.1.2.3. Phng pháp đo đ đc: t bào vsv là mt thc th khi hin din
trongămôiătrngălƠmămôiătrng tr nênăđc.ă đc ca huyn phù t l
vi mtăđ t bào. Do vy có th đnhălng mtăđ t bào mt cách gián tip
thôngăquaăđoăđ đc bng máy so màu  cácăbc sóng t 510-610 nm.
2.2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIểN CU
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 22

Tôi tin hành kim tra mt s ch tiêu trên 85 mu sa và các sn phm t sa bao
gm 20 mu sa bt, 20 mu saătiătit trùng, 15 mu sa chua và 30 mu phô
mai có sn ti phòng thí nghim vi sinh ca Quatest 3 (các muănƠyăđc nhiu
công ty gi đn kimătraăvƠăđcăluăgi ti phòng thí nghim công ty).
2.2.1. VT LIU ậ DNG C - MỌI TRNG
2.2.1.1. Vt liu, dng c, thit b
 Bao PE, Pipetman (loi 1000ăl,ă300ăl,ă400ăl),ăđaăpetri, ng nghim, ng
đongăvôătrùng.
 Giáăđ ng nghim,ăđènăcn,ămáyăđt que cy, que cy, kéo, kp, thìa, bình
thy tinh.

,ănc ct
2.2.1.4. Thuc th
 Oxidase, duăkhoáng,ăCreatine,ăKOHă40%,ă-naphton 5%, Kovacs
 aăgiy O.N.P.G
2.2.1.5. Kháng huyt thanh: Anti-Vi serum, Anti-O serum, Anti-H serum.
2.2.2. PHNG PHÁP NGHIểN CU
2.2.2.1. Listeria monocytogenes [5]
 tài khóa lun tt nghip

SVTH: Nguyn Uyên Vy Page 23

2.2.2.1.1. Chun b mu th và huynăphùăbanăđu
- Thôngăthng cân 25 g muăđưăđcăđng nht cho vào bao nylon vô trùng
và b sungă225ămlămôiătrng LEB.
- Nu s dngălng mu không phi 25 g thì b sungămôiătrng LEB sao
cho dung dch muăthuăđcăcóăđ pha loãng là 1/10.
2.2.2.1.2. Cy và  mu
- Dùng pipet vô trùng chuyn 0,1ml huyn phùă bană đuă vƠoă 2ă đaă thch
ALOA. Tip tc thc hin vi các nngăđ tip theo.
- i vi nhng muăcóălng Listeria monocytogenes thp thì có th tngăgp
10 ln bng cách hút 1 ml huynăphùăbanăđuăvƠoă3ăđaăpetriăcóăcha môi
trng ALOA (ví d: 0,4 ml; 0,3 ml; 0,3 ml). chun b muăképă(6ăđa).
- Dàn dch cy lên b mt thch,ăđ khô  nhităđ phòng trong 15 phút.
- Ltăngcăđa,ă (37 ± 1)
o
C.
- Kimătraăcácăđaănghiăng là Listeria.spp sau (24 ± 3) h và  tip (24 ± 3) h
nu khun lc mc yu hoc không có khun lc.
- Khun lc L.monocytogenes trênă môiă trngă ALOAă mƠuă xanhă đc bao
quanh bi qungăsángăđc, thm chí không có qung sáng.

-  (25 ± 1)
o
C / 48 h
- Quan sát s phát trină xungă quanhăđng cy, nu không rõ  thêmă đ 5
ngày ri quan sát liăđng cy. Listeria.spp diăđng hình dù.
2.2.2.1.4. Khngăđnh L.monocytogenes: (Nuăcácăđc tính hình thái, sinh lý hc và
phn ngăcatalaseăđcătrngăchoăListeria.spp)
 Phn ng dung huyt:
- Ly khun lc ri t TSYEA cyăđơmălênămôiătrng thch máu. Cyăđng
thi chngă đi chngă dngă (L.monocytogenes) và chngă đi chng âm
(L.innocua).
-  (37 ± 1)
o
C / (24 ± 2) h.
Quan sát mu th và chngăđi chng:
- L.monocytogenes có vùng dung huytăăsáng,ătrong,ăhp.
- L.innocua không dung huyt quanh vt cy.
- L.ivanovii có vùng dung huytăăsáng,ătrong,ărng.
 Phn ngălênămenăđng
- T môiătrng TSYEB cy vào các ng nghim có cha dung dch purple
carbohydrate broth vi nng đ cácăđng là 0,5% ; rhamnose, và xylose.
-  (37 ± 1)
o
C / (24 ậ 120) h.
- Phn ngădngătínhă(lênămenăaxit)ămôiătrng có màu vàng trong (24 ậ
48)h.
 Phn ng CAMP:
- Trênăđaăthch huyt cu, cyă1ăđng mng chúng Staphylococcus aureus
dung huytăăsongăsongăvƠăcáchăđu (khong 4cm) so viăđng cy chng
Rhodococcus equi.

- Trnăđu mu viămôiătrng,ăđ yênăđnăđôngăđc hoàn toàn.
- Thi gian gia quá trình cy muăvƠăđ môiătrng không quá 15 phút.
- Ltăngcăđaăđưăcy mu và  đaăpetriă 44
o
C / (18-24) h
 Lu ý: Nu vi sinh vt b tnăthngăthìăđu tiên   37
o
C / 4h,ăsauăđóă 
44
o
C / (18-24) h.
- Khun lc E.coli dngătínhă-glucuronidaseăđin hình trên miăđaăcóăchaăítăhnă
150 khun lcăđcătrngăvƠăítăhnă300ătng khun lcăđcătrngăvƠăkhôngăđcătrng.
2.2.2.2.2. Tính kt qu
 Trongătrng hp có t (15-150) khun lcăđcătrng