TRNG I HC M THÀNH PH H CHÍ MINH BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài:
XÁC NH
MÔI TRNG CM NG TO PHÔI THÍCH HP
VÀ CI THIN KH NNG
TO DÒNG N BI KÉP BNG COLCHICINE
TRONG NUÔI CY BAO PHN BP Khoa: Công ngh sinh hc
Chuyên ngành: Nông nghip
CBHD 1: TS. Lê Th Kính
CBHD 2: CN. Phm Ngc Hi
SVTH: Nguyn Th Thu
MSSV: 1053010750
Khóa: 2010 Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014

i

LI CM N
 mt sinh viên có đc chng đng hc tp trên ging đng đi hc nói
chung và khong thi gian thc tp và làm khóa lun tt nghip nói riêng thành công,

Bng 3.1: T l phôi to thành t bao phn bp trên ba môi trng MS, N6, YP 29
Bng 3.2: nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi
ca bao phn bp NK67 34
Bng 3.3: nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi
ca bao phn bp HN88 35
Bng 3.4: nh hng ca colchicine lên kh nng cm ng to phôi ca bao phn bp
NK67  ngƠy th 30 sau nuôi cy 39
Bng 3.5: nh hng ca colchine lên kh nng tái sinh cơy trong nuôi cy bao
phn bp 41 iii

DANH MC HÌNH
Trang
Hình 1.1: S phát trin in vitro ca ht phn bp 7
Hình 1.2: Cu to ca c bp và bông bp 11
Hình 3.1: Bp ngun HN88 vƠ NK67 đc trng vƠ chm sóc trong nhƠ li
sau 30 ngày gieo ht 24
Hình 3.2: Mt s giai đon phát trin in vivo ca ht phn bp
 đ phóng đi 40X 25
Hình 3.3: S tng quan gia các giai đon phát trin ca ht phn
vi hình thái c bp, bông bp và bao phn 26

Hình 3.4: Nuôi cy bao phn bp NK67 trên môi trng
cm ng to phôi N6 27
Hình 3.5: Cu trúc phôi hình thành t nuôi cy bao phn bp HN88 trên môi
trng YP sau 34 ngày nuôi cy 28
Hình 3.6: Phôi phát sinh t bao phn bp NK67 trên môi trng YP
sau 34 ngày nuôi cy 32

vi

MC LC

T VN  1
Phn 1: TNG QUAN TÀI LIU 3
1.1.Tng quan v cây bp 3
1.1.1. Phân loi 3
1.1.2. Ngun gc và phân b 3
1.1.3. Tình hình sn xut bp trên th gii và Vit Nam 3
1.1.4. Vai trò ca bp trong nn kinh t 4
1.1.5. Ging bp lai đn F1 NK67 vƠ HN88 5
1.2. Tng quan v nuôi cy bao phn bp 6
1.2.1. Các giai đon phát trin in vivo ca ht phn bp 6
1.2.2. S phát trin ca ht phn bp trong điu kin in vitro 7
1.2.3. Các nghiên cu v nuôi cy bao phn trong vƠ ngoƠi nc 8
1.2.4. Các nhân t nh hng đn nuôi cy bao phn bp 9
1.2.5. Ci thin kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp
bng colchicine 14
Phn 2: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 17
2.1. Vt liu 17
2.1.1. a đim và thi gian thí nghim 17
2.1.2. Vt liu 17
2.2. Phng pháp nghiên cu 18
2.2.1. Xác đnh giai đon phát trin ca ht phn bp in vivo 18

vii

2.2.2. Thí nghim 1: Xác đnh môi trng cm ng to phôi thích hp cho
nuôi cy bao phn bp 18

quyt. Phng pháp truyn thng thng đc s dng lƠ rút dòng t qun th phơn ly
(F2, F3). T mt qun th lai F2 phi tri qua 6 ậ 8 v t th (khong 4 nm) mi to
ra dòng có đ thun đ tiêu chun dùng cho lai to. Tuy nhiên vi s phát trin ca
công ngh sinh hc hin đi, bng phng pháp nuôi cy các t bƠo đn bi (giao t),
đc bit lƠ giao t đc, ngi ta có th to ra dòng thun ch trong vòng vƠi tháng. T
đó tit kim ngun lc vƠ rút ngn thi gian cn thit đ to ging mi.
Nuôi cy bao phn lƠ k thut nuôi cy in vitro các bao phn cha ht phn cha
thƠnh thc trên môi trng dinh dng thích hp đ to ra cơy đn bi (haploid) và
đn bi kép. Môi trng cm ng to phôi nh hng ln đn t l cơy tái sinh t bao
phn bp. Tuy nhiên, kh nng cm ng vƠ tái sinh ca bao phn in vitro còn thp vƠ
ph thuc nhiu vƠo kiu gen. Vì vy đ xác đnh môi trng ti u cho mi kiu gen
cn phi qua thc nghim. Mt s môi trng cm ng thng đc s dng trong các
nghiên cu trc đơy nh MS (Murashige and Skoog, 1962), N6 (Chu, 1975), YP
(Genovesi and Collins, 1982), Nitsch (Nitsch, 1969). Trong đó N6 vƠ YP đƣ đc
chng minh lƠ tt trong nuôi cy bao phn bp khi so sánh vi mt s môi trng cm
ng to phôi khác (Armstrong và cs, 1985; Mohammadi và cs, 2007).
Trong nuôi cy bao phn bp, cây tái sinh phn ln có b nhim sc th đn bi.
Trong quá trình nuôi cy, phôi phát sinh t bao phn có th t đa bi hóa mt cách
ngu nhiên đ to thƠnh cơy đn bi kép (DH: double haploid). Cơy đn bi kép tái
sinh t nuôi cy bao phn có s đng nht v kiu gen vƠ có kh nng sinh sn bình
thng, vì vy nuôi cy bao phn đc coi nh phng pháp rút dòng thun hu hiu.
Theo nhiu nghiên cu trc đơy, t l cây t đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp
dao đng t 4,5% đn 22%, trung bình lƠ 10% (Buter, 1997). Trong khi đó, t l này là
50%  lúa mch (Lyne và cs, 1986) vƠ lúa nc (Rania, 1989). Nn nông nghip hin

2

đi đang phát trin vi nhu cu v ging ngƠy cƠng cao c v s lng vƠ cht lng,
do đó rút ngn thi gian chn to nhng ging mi u tú lƠ rt cn thit. S t đn bi
kép trong nuôi cy bao phn bp xy ra theo kiu ngu nhiên vi tn s thp, vì vy

xâm nhp vào châu Á, bp đƣ phát trin và ta rng vi tc đ nhanh. Cây bp đc
du nhp vào Vit Nam khong 300 nm trc vƠ lƠ cơy lng thc quan trng đng
th hai sau lúa (ng Hng Dt, 2004).
1.1.3. Tình hình sn xut bp trên trên th gii và Vit Nam
1.1.3.1. Tình hình sn xut bp trên th gii
Cùng vi lúa nc và lúa m, bp lƠ cơy lng thc quan trng đi vi các nc
trên th gii. Bp đng th 3 v din tích, đng th hai v sn lng vƠ đng th nht
v nng sut. Nm 1985, din tích trng bp trên toàn th gii là 126,706 triu ha và
nm 2005 lƠ 145,499 triu ha, nng sut bp trung bình là 4,9 tn/ha và cho tng sn
lng 712,87 triu tn, trong khi lúa m din tích là 215,9 triu ha, nng sut 2,9
tn/ha và sn lng 625,10 triu tn vƠ lúa nc tng ng 151,7 triu ha, 4,1 tn/ha
và sn lng 629,90 triu tn (Ngô Hu Tình, 2009).
M luôn lƠ cng quc s mt v bp. Nm 2006 có din tích 28,6 triu ha, nng
sut bình quân 9,36 tn/ha và tng sn lng là 267,6 triu tn, chim 39% sn lng
bp th gii.

4 Trung Quc lƠ nc có nn sn xut bp phát trin và có s tng trng rt
nhanh, hin lƠ nc có din tích và sn lng bp đng th hai th gii. Nm 2006
Trung Quc sn xut 27,1 triu ha bp vi nng sut bình quân là 5,4 tn/ha và tng
sn lng là 145,6 triu tn (FAOSTAT, 2007).
1.1.3.2. Tình hình sn xut bp  Vit Nam
Cây bp đc đa vƠo Vit Nam vào khong th k XVII, cách đơy khong 300
nm.  nc ta bp là cơy lng thc quan trng đng th 2 sau lúa, vi din tích
trng đang tng dn qua các nm, nm 2000 lƠ 700 ngƠn ha vƠ nm 2006 lƠ 1,032
triu ha.
Trc nm 1981 hu ht din tích trng bp đu đc gieo trng ging bp đa
phng nên nng sut rt thp, ch đt khong 1,47 ậ 1,56 tn/ha/v. Nng sut này

gii dùng bp làm thc n chn nuôi lƠ 60% - khong 400 triu tn/nm. Các nc
phát trin có t l dùng bp làm thc n chn nuôi thng trên 70%. Mt s nc có t
l này rt cao nh M 76%, B Ơo Nha 91%, Malaysia 91%, (CIMMYT, 2001).
Hin nay, Vit Nam dùng bp làm thc n chn nuôi lƠ chính. Khong 70% cht
tinh trong thc n gia súc có ngun gc t bp. Ngoài ra, thân bp ti cng đc  đ
làm thc n cho gia súc (Cao c im, 1998). Nhu cu thc n chn nuôi  nc ta
là rt ln, cn khong 4 triu tn bp mi nm. Nhu cu bp s ngƠy cƠng gia tng vì
ngƠnh chn nuôi đang phát trin rt mnh, kt hp vi ngành thy sn cng tiêu th
mt lng bp rt ln làm thc n cho tôm, cá.
Ngoài ra, bt bp còn đc dùng đ nu cn, sn xut đng glucose làm môi
trng nuôi cy nm Pennicilin, Streptomicin, sn xut acid acetic. Lõi bp đc dùng
làm nguyên liu sn xut nhiu hp cht hóa hc nh aceton, nha hóa hc. Phôi bp
cha 17,2 ậ 56,8% lipid nên có th dùng đ ép du. Du bp đc s dng rng rãi
trong công nghip thc phm và công nghip dc (ng Hng Dt, 2004).
1.1.5. Ging b
Ging bp t NK67 và bp np NH88 là hai ging bp lai đn F1 đc trng ph
bin ti Vit Nam. Trong đó bp lai F1 NK67 có ngun gc t Syngenta, là ging bp
đá, trái to, dƠi, cùi nh, đc bit có kh nng chu hn khá và kháng bnh r st, đm lá.
Nng sut v hè thu khong 7 ậ 8 tn/ha (www.agpps.com.vn). Ging bp HN88 do

6

công ty c phn Ging cây trng Trung ng tuyn chn, là ging bp np ngn ngày,
nng sut cao, cht lng ngon, có v đm, thm đc trng. Sinh trng khe, chu
hn và chu rét tt, chng chu tt vi sâu bnh, bp to dài, kín lá bi. Nng sut bp
ti đt 18-20 tn/ha (www.vinaseed.com.vn). C hai ging bp đu có th trng
quanh nm, tuy nhiên gieo trng cn tránh bp tr c phun râu vào các tháng quá khô,
quá nóng, quá lnh đ đm bo nng sut.
1.2. Tng quan v nuôi cy bao phn bp
n phát trin in vivo ca ht phn bp

ht phn phát sinh phôi thun tuý". Sau giai đon này các cu trúc t bƠo đa nhơn tng
trng v kích thc và tách khi v ht phn. Các cu trúc phát sinh phôi đc tách

8

ra hoƠn toƠn vƠ đc bao bc bi lp t bào ngoi vi. Cui cùng là các cu trúc tng
t phôi (embryo like structure) đa bƠo hình thƠnh (Pescitelli vƠ cs, 1988).
1.2.3. Các nghiên cu v nuôi cy bao phc
Nm 1921, Bergner phát hin ra cơy đn bi đu tiên trong t nhiên  cƠ đc
dc Datura stramonium L. vƠ đc báo cáo bi Blakeslee vƠ cs (1922). Ti thi đim
đó, vai trò quan trng ca th đn bi đi vi công tác lai to vƠ nghiên cu di truyn
thc vt đƣ nhanh chóng đc công nhn. S lng loƠi có kh nng t đn bi đc
phát hin ngƠy mt nhiu. n nm 2010, danh sách nhng loƠi thng xy ra s t
đn bi mi đc công b bi Dunwell. Tuy vy, cơy đn bi trong t nhiên xut hin
mt cách ngu nhiên vi tn sut rt thp không th đáp ng yêu cu nghiên cu vƠ
chn to ging.
Khong 40 nm sau khi cơy đn bi t nhiên đu tiên đc phát hin, hai nhà
khoa hc Guha vƠ Maheshwari (1964) đƣ chng minh có th nuôi cy bao phn cha
trng thƠnh trong điu kin in vitro nhm ngn cn s phát trin bình thng ca ht
phn, làm cho phôi to ra có b nhim sc th đn bi, t phôi này có th to ra cây
tái sinh đn bi. Phát hin nƠy đƣ to tin đ cho hàng lot nghiên cu sơu hn trong
tng lai. Lúa mch (Hordeum vulgare L.), ci du (Brassica napus L.), khoai tây
(Nicotiana spp.) vƠ lúa nc (Triticum aestivum L.) thng đc dùng đ nghiên cu
sâu v s to phôi t ht phn bi chúng có kh nng tái sinh cao (Forster vƠ cs,
2007).
Tuy nhiên, không phi giao t đc ca tt c các loi cây trng đu có kh nng
cm ng tt trên môi trng to phôi. Mt s loài quan trng v mt khoa hc và kinh
t nh nhng cây thuc h thp t, cây thân g hay mt s loài thuc h đu vn còn
gp nhiu khó khn trong vic phát sinh hình thái in vitro (Bajaj, 1990; Germanà,
2009).

1978). Kh nng cm ng to phôi là khái nim ch t l phôi to thành t nuôi cy
bao phn ca mt kiu gen, mt kiu gen có kh nng cm ng to phôi cao khi t l
phôi to thành t nuôi cy bao phn ca kiu gen đó cao. Miao và cs (1978) báo cáo
rng ch có 9 trong tng s 159 (khong 5,6%) kiu gen bp trong nghiên cu có kh
nng cm ng. Trong khi đó, Petalino vƠ Jones (1986) ch quan sát đc hin tng

10

cm ng to phôi  12 trong s 39 kiu gen (30,8%) ly t United States Corn Belt,
trong đó bao phn ca nhng cây lai cho t l phn ng cao hn. NgoƠi ra, nhng kiu
gen d hp t thng cm ng tt hn nhng kiu gen đng hp t (Genovesi và
Collins, 1982).
1.2.4.2. Trng thái sinh lý ca cây cho bao phn
Trng thái sinh lý ca cây m nh hng đn kh nng cm ng to phôi trong
nuôi cy bao phn bp (Nitsch và cs, 1982). Bao phn trên nhng cây khe mnh có t
l cm ng to phôi cao hn hn bao phn trên nhng cây yu, ngay c  nhng kiu
gen đƣ đc cho là cm ng tt. Genovesi (1990) quan sát thy ch mt vài phôi hoc
mô so in vitro đc to thành t nhng cây m sinh trng yu, đơy lƠ mt nhân t
rt quan trng nh hng trc tip đn s cm ng to phôi trong nuôi cy bao phn.
Ông còn nhn mnh s quan trng ca yu t môi trng, bao gm nh hng ca
chu k chiu sáng, cng đ và cht lng ánh sáng, nhit đ và ch đ dinh dng
cho cây bp khe mnh. Das vƠ cs (2002) thu đc lng phôi cao gp đôi khi nuôi
cy bao phn ca cơy sinh trng trong điu kin nhiu ánh sáng khi so sánh vi cây
sinh trng trong môi trng râm mát. Mt khác, phôi t bao phn ca cây sinh
trng trong môi trng rơm mát cng phát trin chm và yu hn. Cơy m sinh
trng và phát trin trong điu kin nhit đ ban ngày t 25 ậ 30
o
C và nhit đ ban
đêm t 18 ậ 20
o

phn đc tin x lý lnh cm ng cao hn khi không đc x lý vì nhit đ thp
giúp ngn cn s phát trin ca giao t (Pace và cs, 1987). Tuy nhiên, Pescitelli và
Petolino (1988) chng minh rng ht phn vn tip tc quá trình phát trin ca chúng

12

trong thi gian x lý lnh. Ht phn  giai đon gia đn cui đn nhơn sau khi x lý
lnh 10 ậ 14 ngày  8
o
C s phát trin ti giai đon đn nhơn mun đn hai nhân gia.
ƣ có nhiu nghiên cu v nhit đ cng nh thi gian x lý lnh khác nhau.
Dieu vƠ Beckert (1986) thu đc kt qu nuôi cy tt nht khi tin x lý c bp 7
ngày  7°C và tip tc  7 ngày  14°C. Genovesi (1990) và Choi và cs (1995) x lý
 10°C và 9°C trong 14 ngày. Yuan và cs (2001) báo cáo rng x lý c  5°C t 15
đn 21 ngày cho hiu qu to thành phôi ln nht. Tip theo, gi bao phn  nhit đ
33°C giúp to ra phôi sm, nhiu và cht lng hn. Das vƠ cs (2002) thu đc t l
bao phn cm ng cao nht (8,54%)  8 - 10°C trong 14 ngày và   27 ± 2°C trong
14 ngày. T l cm ng thp nht khi    25 ± 2°C và 30°C.
1.2.4.5ng nuôi cy
Môi trng đu tiên nuôi cy thành công bao phn bp là MS (Murashige và
Skoog, 1962) cha 12 - 24% sucrose, kt qu thu đc 1% phôi đc to thành
(Anonymous, 1975). Môi trng N6 (Chu vƠ cs, 1975) đƣ đc s dng đ nuôi cy
thành công bao phn bp (Brettell, 1980). Bên cnh MS vƠ N6, môi trng YP (Ku
vƠ cs, 1978) cng đc s dng thành công trong nuôi cy bao phn bp (Genovesi
và Collins, 1982; Petalino và Jones, 1986).
Beaumont (1997) đƣ nghiên cu nh hng ca các ngun đng khác nhau lên
s cm ng ca bao phn bp. Kt qu cho thy phôi không đc to thành trên môi
trng có b sung manitol, starch, trihalose và maltotriose. Trên môi trng cha
sucrose, bao phn bp cm ng tt nht. Trc đó, Brettell (1980) đƣ s dng môi
trng N6 + 12% sucrose + 500 mg/l casein hydrolysate + 0,35 mg/l TIBA và to

tng trng ca t bƠo đa s loài thc vt. Ngi ta cho rng myo-inositol đc phân
tách ra thành acid ascorbic và peptine vƠ đc đng hóa thành phosphoinositide và
phosphatidylinositol có vai trò quan trng trong s phân chia t bào. Myo-inositol có
vai trò trong sinh tng hp thành t bào, c th là sinh tng hp acid polygalacturonic
và pectine.
Trong nuôi cy bao phn, myo-inositol thng đc b sung vƠo môi trng
nuôi cy  mt s loƠi nh lúa nc vi nng đ 100 mg/l (Niroula và cs, 2005), 100
mg/l  lúa mch (Asakaviciute và cs, 2008) và 50 mg/l  lúa m (Last vƠ cs, 1990)…

14

Trong nuôi cy bao phn bp, myo-inositol đc b sung vƠo môi trng tái sinh.
Tuy nhiên, nh hng ca myo-inositol đn s to phôi ca bao phn bp trên môi
trng cm ng to phôi vn cha đc nghiên cu và công b nhiu. Genovesi và
Collins (1982) đƣ báo cáo rng s dng myo-inositol 100 mg/l không có tác dng
kích thích s to phôi trong nuôi cy bao phn bp. Tuy nhiên nhng nng đ khác
vn cha đc th nghim.
ng tái sinh
Phôi đc to thành t bao phn bp s tái sinh thành cây hoàn chnh trên môi
trng tái sinh. Cht lng ca phôi là yu t đc quan tâm nhiu bi nó nh hng
đn s tái sinh cây trong nuôi cy bao phn bp (Dieu và Beckert, 1986). Nhng phôi
có r có t l tái sinh thp nht trong khi phôi dng cu tái sinh tt nht.
Phôi đc chuyn vào khong 20 ngày sau khi nuôi cy. Tuy nhiên có nhiu
trng hp phôi không tái sinh thƠnh cơy con bình thng. Có nhiu phôi to ra r
nhng không to chi, s khác li ra chi nhng không có r và mt s trng hp
bt thng khác. Môi trng tái sinh N6 b sung 2,4-D (2mg/l) và kinetin (1,5mg/l)
có th kim soát đc tình trng này (Hassan và cs, 2001).
Nitsch vƠ cs (1982) thu đc t l tái sinh ln nht trên môi trng YP b sung
0,1 mg/l TIBA. Barnabás (1999) đƣ s dng môi trng MS b sung 100 mg/l myo-
inositol +150 mg/l L-asparagine + 0,5 mg/l thiamine HCl + 1 mg/l kinetine + 0,05

Phng pháp x lý colchicine đc s dng ph bin nht là ngâm r cây vào dung
dch colchicine (Levan, 1938).  mt s loƠi, đnh sinh trng, chi nách, chi r
cng đc dùng đ x lý colchicine (Mathias và Robbelen, 1991). Nhng phng
pháp này cho kt qu khong 50% cây phn ng li tác đng ca colchicine, tuy
nhiên t l cây cht hoc bt thng v mc bi th cao (Wenzel và cs, 1977; Banabás
và cs, 1990).  bp, vic x lý colchicine trên cây con có th làm gp đôi b nhim
sc th  c hoc trái, nhng him khi  c hai. iu này gây tr ngi ln cho vic t
th đ to ra dòng thun (Wan vƠ cs, 1989). Nh vy, phn ln cây cht hoc phát
trin bt thng đc quan sát sau khi x lý colchicine  giai đon cây con, chng t
vic to th đn bi kép  giai đon cây tái sinh trong nuôi cy bao phn bp không
có hiu qu cao.

16

Kt qu nghiên cu ca Wan và cs (1989, 1995) cho thy: khi x lý colchicine vi
hai nng đ 0,025% và 0,05%  giai đon phôi và mô so, cây bp tái sinh t nuôi
cy bao phn  hai nng đ x lý không có s khác bit, t l đn bi kép khong
50% và n đnh v mt di truyn. Banabás và cs (1999), Payam và cs (2007) li báo
cáo rng s dng colchicine  giai đon đu nuôi cy cho t l cơy đn bi kép cao.
Nghiên cu ca Banabás và cs (1999) khi s dng hai nng đ colchicine là 0,02% và
0,03% x lý bao phn bp  giai đon đu nuôi cy cho thy nng đ 0,03% cho t l
cơy đn bi kép cao hn, tuy nhiên hƠm lng colchicine cao (0,03%, 0,04%) làm
tng t l cây bt thng (Mohammadi và cs, 2007). Trong mt s nghiên cu, x lý
colchicine kt hp sc nhit lnh trong 7 ngƠy lƠm tng t l cơy đn bi kép trong
nuôi cy bao phn bp (Saisingtong và cs, 1996; Antoine Michard và Beckert, 1997). 17

Phn 2: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIểN CU

Sigma
ng sucrose
CTCP ng Biên
Hòa
5
Colchicine
Hi Media
Laboratories,
n 
- Thit b, dng c: Kính hin vi, t lnh, máy ct nc, ni hp kh trùng, bình nuôi
cy, t cy, gng tay, khu trang…