TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN
PHAN VĂN HÙNG
BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
MÔN VIRUS HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Khóa học: 2010 – 2014
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Ts. Nguyễn Tất Toàn
An Giang, Tháng 04 năm 2014
2
3
Bài I
KỸ THUẬT TIÊM TRỨNG VÀ KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TÁN TRÊN
THẠCH
I. Kỹ thuật tiêm virus Newcastle(Tiêm xoang niệu mô)
1. Mục đích
Xác định sự hiện diện của virus Newcastle trong phôi trứng gà, ứng dụng sâu hơn là sản xuất
Vắc xin.
2. Dụng cụ - hóa chất

Hình 1: Một số dụng cụ và hóa cần thiết
Nước muối sinh lý 10- 20%
Cồn
Iod
Parafin lỏng
Kim tiêm
3. Chuẩn bị nguyên liệu
Chuẩn bị trứng gà đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi
4
Muối sinh lý

-3
để tiêm vào trứng, đối với virus Newcastle. Ta tiến hành tiêm ở xoang
niệu mô, liều lượng là 0,1-0,2 ml/trứng.
4. Quy trình thực hiện
Hình 8: Trứng đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi
6
Hình 9: Soi trứng, xác định buồn hơi thật, vị trí phôi và làm dấu vị trí phôi
Hình 10: Xác trùng vỏ trứng bằng cồn và Iod
Hình 11: Tiến hành đục lỗ, sau đó xác trùng lại lần nữa
Hình 12: Tiến hành tiêm(liều tiêm 0,1-0,2 cc/trứng)
7
Lưu ý : Tiêm về phía đối diện phôi không tiêm trực tiếp lên phôi
Hình 13: Dùng parafin hơi nóng bịt kín lỗ khoan sau đó tiến hành ủ ở 37
0
c
5. Xem kết quả
II. kỹ thuật tiêm Virus Đậu mùa(kỹ thuật tạo buồng hơi giã)
1. Mục đích
Xác định sự hiện diện của Virus đậu mùa trong phôi trứng gà, thông qua bệnh tích biểu hiện
trên màng CAM(nốt pock trên màng CAM).
Ứng dụng sản xuất Vắc xin để phòng bệnh đậu mùa
2. Dụng cụ - hóa chất
Nước muối sinh lý, cồn, Iod, nút bóp cao su…
3. Chuẩn bị nguyên liệu
Chuẩn bị trứng gà đã ấp 9 – 11 ngày tuổi.
Chuẩn bị vắc xin đậu gà nhược độc, pha loãng thành các nồng độ 10
-1
,10
-2
,10

xuống từ từ. chảy đều trên lame không được có vết nhăn và lồi lỗm chỗ nào, độ dày khoảng 3
mm
Hình 22: Pipet hút, cho lên lame, môi trường thạch dày 3 mm trên Lame
Hình 23: Đem thạch vào tủ lạnh, làm dấu những vị trí cần đục lỗ, tiến hành đục lỗ
Cho kháng nguyên( kháng thể gà) và kháng thể( kháng thể thỏ) vào những vị trí đã đục lỗ
theo quy định như sau : lỗ trung tâm là kháng thể thỏ, 4 lỗ xung quanh là kháng thể gà, từ
20µl - 50µl cho mỗi lỗ trên thạch.
11
Hình 24: Cho kháng thể thỏ vào lỗ trung tâm, kháng thể gà vào 4 lỗ còn lại, đặt những
miếng bông gòn để giữ độ ẩm
Thực hiện xong ta chuyển vào tủ ủ, ủ ở 37
0
c, sau 48h để quan sát kết quả
Bài 2
THAM QUAN CÔNG TY NAVETCO
I. Mục đích
Học hỏi tìm hiểu thêm về quy trình sản xuất Vắc xin của công ty, và một số vấn đề liên quan
về công ty. Một số thiết bị và những ứng dụng Công nghệ sinh hocj vào sản xuất vắc xin được
anh Tú nhiệt tình hướng dẫn
Hai điểm mới và nỗi bật nhất , đáng quan tâm nhất đó là : cách nuôi Virus dùng để sản xuất
vắc xin, và kỹ thuật DNA tái tổ hợp vào sản xuất vắc xin. Điều thiệt thòi nhất là chỉ được ngồi
trên giảng đường, mà không được chứng kiến tận mất. do công ty tan ca làm việc.
II. Một số vắc xin sản xuất được tại công ty
Vắc xin heo tai xanh
Vắc xin cúm
Vắc xin viêm não nhật bản
Vắc xin uốn ván…
III. Quy trình sản xuất vắc xin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp
Công nghệ tái tổ hợp lấy đoạn DNA miễn dịch gắn vào vi khuẩn Plasmid chuyển vào nấm
men, hay vi khuẩn, để nhân nhanh sinh khối, tách thu sinh khối, để sản xuất vắc xin.

Bước 1: xử lý mẫu
Lấy 5gr mẫu đã chuẩn trước đó, cắt nhỏ cho vào cối giã nhiễn ra
Hình 27: Cắt mẫu và giã nhiễn
Cho 5ml dung dịch PBS vào mẫu đã giã nhiễn và trộn điều
Hình 28: Hút dd PBS cho vào mẫu đã giã nhiễn
Hút mẫu mô cho vào eppendorf, bỏ cặn. Đem ly tâm 6000 vòng/5 phút
14
Hình 29: Hút mẫu vào eppendorf và đem ly tâm
Bước 2: Cho 200µl mẫu vào eppendorf chứa sẵn 1000µl RNA Lysis Buffer trộn đều, để yên
30 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/1 phút Phá vỡ tế bào, phóng thích RNA.

Hình 30: Cho mẫu vào eppendorf chứa sẵn RNA Lysis Buffer sau đó trộn đều mẫu
Bước 3: Cho 175µl hỗn hợp dung dịch trên vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer,
trộn đều, ủ 65
o
c trong 3 phút, ly tâm 13000 vòng/ 10 phút  Tủa protein tạp và các tạp chất.
Hình 31: Cho hỗn hợp vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer sau đó đem ly
tâm
Bước 4: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 96
0
. Cho tất cả vào
eppendof lọc, ly tâm 13000 vòng/1 phút  Giữ RNA trên màng lọc.
15
Hình 32: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 96
0
và Cho tất cả vào
eppendof lọc
Bước 5: Đổ hết phần nước, cho 600µl dung dịch rửa vào eppendof lọc ly tâm 13000 vòng/1
phút  Loại bỏ protein tạp và tạp chất.
Hình 32: Hút 600µl dung dịch rửa vào eppendof lọc

Thực hiện
- Trước tiên lấy huyễn dịch nước trứng với HA (+) đem li tâm.
- Dùng kim tiêm hút lấy phần nước phía trên.
- Bơm kim tiêm đã hút nước huyễn dịch vào màng lọc có kích thước 0.45 µm và 0.22 µm.
- Thu dịch lọc.
Thử nghiệm phản ứng HA trên kính và ghi nhận kết quả
Lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.45µm thực hiện kiểm tra bằng phản ứng HA trên
kính, có 2 trường hợp xảy ra:
+ Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn dịch có
kích thước lớn hơn 0.45µm.
18
+ Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch
có kích thước nhỏ hơn 0.45µm. Ở trường hợp HA dương tính ứng với dịch nước đã lọc được ở màng lọc
0.45µm, tiếp tục lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.22µm thực hiện kiểm tra phản ứng HA trên kính.
* Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn
dịch có kích thước lớn hơn 0.22µm.
* Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch có
kích thước lớn hơn 0.22µm.
6. Kết quả và thảo luận
 Quan sát phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM màu đỏ tươi do virus Đậu gây
xuất huyết phôi nhưng không làm chết phôi. (Hình 1)

Hình 1 : Phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM
 So sánh phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM và tiêm ở xoang niệu mô
- Khi tiêm virus Đậu ở màng CAM không gây chết phôi, nhưng gây xuất huyết, phôi có màu
đỏ tươi và virus này tạo nốt Pock trên màng CAM. Còn tiêm virus Newcastle ở xoang niệu mô thì sau 24 giờ
ấp trứng (sau khi tiêm) virus làm chết phôi. Phôi đã chết nên không có màu đỏ tươi. (Hình 6)
19
Hình 2: Tiêm ở xoang niệu mô làm phôi chết
 Nốt Pock trên màng CAM: Bệnh tích gây thủy thủng, dày lên tạo thành nốt pock trên

Hình 5: Hồng cầu 1%
 Tiến hành
Cho nước muối sinh lý vào các hàng từ lỗ 1 đến 12, mỗi lỗ 50µl
Cho thêm 50µl huyễn dịch virus vào lỗ thứ 1, trộn đều. sau đó lấy 50µl huyễn dịch từ lỗ 1 cho
vào lỗ 2, trộn đều và cứ tiếp tục làm cho đến lỗ thứ 11, hút 50µl huyễn dịch từ lỗ thứ 11 bỏ ra ngoài. Lỗ thứ
12 dùng làm đối chứng.
Cuối cùng cho 50µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các lỗ từ 1 đến 12, lắc đều, để yên
30 phút rồi đọc kết quả.
Ta tiến hành 3 lần lặp lại.
4. Kết quả
 Phản ứn HA dương tính: xảy ra ngưng kết hồng cầu ở:
Hàng I: từ vị trí thứ 1 - 6 (n = 6), đóng nút tại vị trí thứ 7 . Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó
virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 64.
Hàng II: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.
Hàng III: từ vị trí thứ 1 - 8 ( n = 8), đóng nút tại vị trí thứ 9. Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó
virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 512.
Hàng IV: từ vị trí thứ 1- 10 ( n =10), đóng nút tại vị trí thứ 11. Vậy hiệu giá pha loãng mà ở
đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 1024.
Hàng V: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.
Hàng VI: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.
23
 Kết quả: Xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc” có thể do sai sót thao tác không cho huyễn dịch
virus vào lỗ nên không thể ngưng kết hồng cầu gà tạo hiện tượng đống nút.
24
Hình 6: Kết quả phản ứng HA
Bài 3: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu
(HI: Haemagglutination inhibition)
1. Nguyên lý
Khi Newcastle gặp kháng thể đặc hiệu tuơng ứng sẽ bị kháng thể này kết hợp,không còn khả
năng gây ngưng kết hồng cầu, hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở sự ngưng kết hồng cầu của virus.