1/ Đặt vấn đề :
Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn, đang phát triển trên cơ sở các kĩ
thuật mới mẻ: kĩ thuật di truyền, kĩ thuật dung hợp tế bào; kĩ thuật nuôi cấy mô; kĩ thuật nuôi
cấy tế bào; kĩ thuật cấy chuyển phôi….Những thành tựu này đang chuẩn bị cho một cuộc
cách mạng sinh học trong các ngành kinh tế-kĩ thuật.
Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng từ lâu bởi các nhà trồng hoa và các nhà
chọn giống muốn nhân nhanh những giống đặc cấp, cải thiện hiệu quả của từng thời kì chọn
lọc.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được tiến hành ở Việt Nam từ giữa những năm 70.
Hiện nay, trong cả nước đã có vài chục phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào. Phần lớn
các phòng thí nghiệm đang tiến hành những nghiên cứu ứng dụng: chủ yếu là vi nhân giống
trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn có những khả năng đóng góp cho
nnhững nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế nữa, đặc biệt là trong cải biến di truyền (chọn
dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi cấy bao/hạt phấn, lai tế bào, chuyển gen) và trong công
nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học. Đề tài “Các hướng nghiên cứu và ứng dụng
nuôi cấy mô và tế bào thực vật” giúp cho người viết có được những kiến thức cơ bản về
nuôi cấy mô tế bào thực vật, về các hướng nghiên cứu và ứng dụng đã được tiến hành thành
công tại các phòng thí nghiệm.
2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :
Đối tượng nghiên cứu: là mô và tế bào thực vật, thành phần môi trường và các chất
kích thích sinh trưởng.
Phạm vi nghiên cứu: chỉ đề cập đến các hướng nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô và
tế bào thực vật.
3/ Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu được lấy từ các
nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự phân tích, tổng hợp, so sánh, đối
chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Mặc dù đề tài được chuẩn bị khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn sơ suất, rất mong
được sự góp ý của quí thầy hướng dẫn và các bạn đồng nghiệp. Tác giả chân thành biết ơn.
4/ Cấu trúc tiểu luận:
Phần 1: Vi nhân giống in vitro.

I. Dung hợp protoplast và lai nhân 15
II. Lai tế bào chất 18
Phần 5: Chuyển gen ớ thực
vật………………………………………………………………….
………………………………….21
I. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật 21
II. Các phương pháp chuyển gen 22
1. Chuyển gen bằng Agrobacterium 22
2. Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus 23
3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp 23
4. Phương pháp bắn gen 23
5. Phương pháp vi tiêm 24
Phần 6: Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thưc vật ở
Việt
Nam………………………………………………………………………………………………
…………………………………………… 25
KẾT LUẬN ….27
TÀI LIỆU THAM
KHẢO………………………………………………………………………………………………
…………………28
.
- 2 -
PHẦN NỘI DUNG
Phần 1: VI NHÂN GIỐNG IN VITRO.
Vi nhân giống in vitro gọi tắt là vi nhân giống là hệ thống sử dụng sự phát triển nhân
tạo và nhân các điểm sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây.
Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không những quyết
định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình của D.Amato
(1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về di truyền. Tiếp
đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là

-Thuận tiện và là hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng
15kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4
o
C trong hàng
tháng vẫn cho tỉ lệ sống đền 95%.
Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm
trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây. Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng
được yêu cầu thực tiễn.
Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phương pháp vi nhân còn cao (2500
– 3000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ
giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật quí hiếm và có giá trị kinh tế cao.
Trên thực tế cây nhân bằng phương pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây giống từ hạt.
Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây như lan, hoa cúc, hoa hồng,
cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông….
Vi nhân giống ngồi việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây còn có thể rút
ngắn thời gian đưa các cây lai và các lồi cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm tốt vào
sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai.
Phần 2: TẠO CÂY ĐƠN BỘI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN
CỨU VÀ THỰC TIỄN.
- 3 -
Có nhiều phương pháp tạo cây đơn bội, nhưng từ những năm 60, việc tạo cây đơn bội
bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng nuôi cấy
bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) hoặc
môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong quá trình nuôi cấy, hạt phấn phân chia, tạo
mô sẹo hoặc phôi và tiếp theo có thể tạo cây.
I.Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo.
1.Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy.
Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng rất lớn đến hạt phấn
nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng như nhiệt độ là những yếu tố
ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của Dunwell (1976)

hạt/ml môi trường. Đối với các cây khác mật độ dao động từ
10
4
đến 10
5
.
Aùnh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần
300-500 lux. Nhiệt độ bình thường từ 25-28
o
C là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn và hạt
phấn của hầu hết các giống cây.
II.Tái sinh cây.
Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ, thậm chí
cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một số lồi cây
khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trường nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh
trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang môi trường
không có chất điều hòa sinh trưởng. Một số trường hợp phải dùng zeatin và nước dừa mới có
thể tái sinh cây.
- 4 -
Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên môi
trường không có chất điều hòa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang môi trường
có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thường hay dùng là BAP và
kinetin. Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừa thường làm gia
tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc.
Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ
tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc thường
có hiện tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977) thấy rằng
tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao. Ngồi ra, cây
bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping, 1978).
Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số lồi cây có cả cây nhị

Cây đơn bội Lưỡng bội hóa Cây lưỡng bội Dòng thuần Dòng siêu chủng
- 5 -
Phần 3: CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV).
I.Cơ sở khoa học.
Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính tồn năng. Mỗi lồi
thực vật có khả năng tái sinh khác nhau.
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế
bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật ở đấy
cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh
thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào
phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào
đến khi hình thành một cơ thể hồn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di truyền do ảnh
hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trưởng.
Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển,
những quần thể tế bào này là đối tượng hết sức lí tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột
biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa. Cũng như cây trồng, trong nuôi cấy mô và tế bào,
có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một loại là kết quả của sự thay đổi gen, được
gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại không liên quan đến thay đổi gen, được gọi là
biến đổi ngồi gen. Những thay đổi ngồi gen không di truyền được.
Ngồi những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tượng phổ
biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào có thể
thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào. Hiện tượng
này gọi là hiện tượng phân dòng sôma. Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ tế bào nuôi cấy
là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh từ protoplast là

& Widholin, 1986; Watad và cs, 1985). Đối với loại tế bào này các phương pháp chọn lọc
trực tiếp và chọn từng bước cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối tượng. Sử dụng tế
bào dịch lỏng để CDTBTV có ưu điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế bào được tiếp xúc đồng
đều với tác nhân chọn lọc, nhưng một nhược điểm quan trọng là sau khi chọn lọc khả năng
tái sinh cây bị giảm đáng kể và trong nhiều trường hợp có thể mất hẳn. Hầu hết các dòng
chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dịch lỏng đều không nhận đuợc cây (Dix, 1990). Vì thế
hệ thống tế bào dịch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòng có khả năng tổng hợp và tích lũy
các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trường hợp này thì tế bào dịch lỏng đáp ứng được
mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào
thực vật trên qui mô công nghiệp.
Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặt trong
CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào được phát triển đồng
đều trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng
là các mô sẹo tái sinh thành cây hồn chỉnh, chính vì thế có thể tránh được hiện tượng khảm.
Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs,
1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã được chọn lọc
nhờ sử dụng hệ thống protoplast.
Trước đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất là
tái sinh cây từ protoplast của những lồi cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống
nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bị hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy protoplast với
hiệu quả cao ở nhiều lồi cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng như khoai tây, cà chua,
ngô, lúa, lúa mì đã được công bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu lý tưởng cho
CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tượng quan trọng trong cải biến di
truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế bào và chuyển
gen.
Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng và
protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên liệu
CDTBTV. Một trong những mô phân hóa được sử dụng là phôi từ hạt (Kueh & Bright, 1981)
hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs (1985) đã chọn
được dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs (1989) cũng nhận

-4
– 10
-6
thì
ở quần thể cây tái sinh (R
o
) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981).
Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có thể làm tăng tần số đột
biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981).
Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần nghiên
cứu giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượng lây nhiễm ở
đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân gây bệnh
không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh).
Để chọn dòng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc tố
gây bệnh (ĐTGB).
Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễm là
protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và phân biệt
được tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển trên
cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975), Murakishi và
Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau đó nuôi vấy và chọn lọc.
Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu vàng lây nhiễm cây
thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng của tế
bào sạch virus hoặc kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô từ tế bào sạch virus sinh trưởng
nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh trưởng chậm hơn và có màu vàng.
Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh như Phoma lingam, Plamidomonas brassicae
(Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs,
1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs,
1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae (Deaton
& cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977), Xanthomonas oryzae
(Sun & cs, 1986) cũng đã được sử dụng để chọn dòng chịu bệnh.

P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá kháng
Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum
f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke (1985) đã nhận
được dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae khi sử dụng độc tố
sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên.
Ngồi phương pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế bào, mô
hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB, ứng dụng
khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thể chọn được dòng chịu
bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980; Hartan & cs,
1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng chịu bệnh theo phương pháp
này. Giống mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) và giống lhoai lang “Sarlet”
chịu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã được chọn và đưa vào sản xuất. Hiện nay khi việc tái
sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng đối với hầu hết các giống cây thì chọn lọc theo
hướng này có nhiều hứa hẹn và trên thực tế đã có các giống chịu bệnh đuợc đưa vào sản xuất
nhưng có một số mặt hạn chế của phương pháp này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần
thể lớn cây tái sinh trong điều kiện tự nhiên; thứ hai là phân dòng sôma làm thay đổi nhiều
đặc điểm khác nên nhiều khi chọn được dòng chị bệnh nhưng lại ảnh hưởng đến đặc điểm
kinh tế (Bidney & Shepard, 1981).
Nhìn chung đã có nhiều công trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng nuôi cấy mô
và tế bào để chọn dòng chịu bệnh ở cây trồng nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều vấn đề cần
giải quyết như cơ chế tương hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gây bệnh, liên
quan đến vấn đề này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Một vấn đề quan
trọng nữa là xác định được vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọn lọc in vitro. Một số
vấn đề liên quan về mặt kĩ thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rút ngắn thời gian nuôi cấy và
tái sinh cây để tránh những thay đổi về hình thái và một số đặc điểm khác. Việc chọn lựa đối
tượng để áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào vào chọn dòng chịu bệnh cũng rất quan
trọng. Một số tác giả khác cho rằng nuôi cấy mô, tế bào có thể áp dụng để chọn dòng chịu
bệnh ở các lồi cây sinh sản vô tính thì phù hợp và có kết quả hơn (Daub, 1986; Jones, 1990).
Ngồi ra nuôi cấy mô và tế bào có thể áp dụng để chọn các dòng chịu bệnh đơn gen hoặc chịu
- 9 -

theo Mendel của các đặc điểm được chọn lọc (Comner & Meredits, 1985).
Cho đến nay hầu hết các công trình chọn dòng chống chịu stress môi trường đều chọn
theo phương pháp chọn lọc trực tiếp. Việc tiến hành xử lý các stress có thể tiến hành khi mô
sẹo (callus) mới hình thành hoặc khi mô sẹo đã phát triển. Các stress có thể ở mức độ thấp
hoặc ở mức độ gây chết, và có thể xử lý một nồng độ nhất định hoặc khi tế bào chịu được
một nồng độ nào đó lại đưa lên nồng độ cao hơn. Việc tiến hành xử lý có thể liên tục hoặc
gián đoạn, thời gian xử lý có thể ngắn hoặc dài. Cho đến nay chưa có những nghiên cứu so
sánh cụ thể đối với từng trường hợp trên. Tốt nhất tùy từng đối tượng cụ thể mà kết hợp việc
chọn lọc theo cách này hay cách khác. Đây là một vấn đề nghiên cứu về mặt phương pháp
nhưng hết hết sức quan trọng, nó đóng góp vào sự thành công trong việc chọn các dòng
chống chịu stress môi trường. Muốn nhận những đột biến mới hoặc đột biến lặn, chọn lọc có
thể tiến hành ở mô đơn bội từ hạt phấn, nếu chọn lọc ở mô đơn bội từ hạt phấn lai F
1
có thể
nhận được các đột biến đơn gen và các tái tổ hợp của các alen sẵn có.
- 10 -
Trong những năm gần đây đã có những bước tiến đáng kể trong việc chọn dòng chống
chịu muối, hạn, chua và nhiệt độ. Nhiều dòng chịu muối (NaCl) đã được chọn lọc từ mô nuôi
cấy của các lồi Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium, Ipomoea babatas L.
(Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985), Medicago sativa L. (McCoy
1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and Swartz, 1984). Tính chống chịu
trong một vài trường hợp được thông báo là ổn định ở mức độ tế bào và cây hồn chỉnh
(Winnicov, 1991). Về cơ chế của tính chịu muối cũng đã có những kết quả đáng ghi nhận. Ở
Việt Nam việc tiến hành chọn các dòng thuốc lá địa phương chịu muối cũng được tiến hành
và đã thu được những kết quả tiến bộ (Nguyễn Hồng Lộc & cs, 1990). Kết quả nghiên cứu
của một số tác giả cho thấy abscisic axit (ABA) là chất có liên quan đến việc tổng hợp các
protein mới (đặc biệt là protein với phân tử lượng 26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh
& cs, 1987). Mối tương quan giữa ABA, tính chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt
là vấn đề nghiên cứu hết sức lý thú trong những năm tới. Các dòng chịu hạn đã được thông
báo (Bressan & cs, 1981, Hand & cs, 1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000

- 11 -
Vật liệu thường dùng để chọn dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao là mô hoặc
tế bào nuôi cấy dịch lỏng.
Đối với các chất thứ cấp có màu, có thể chọn bằng mắt. Đối với các chất thứ cấp
không có màu trước khi cấy chuyển cần được phân tích. Đây là việc làm tốn khá nhiều công
sức và thời gian. Để khắc phục, Ogino và cs (1978) đã đưa ra phương pháp ép tế bào. Theo
phương pháp này, các cụm tế bào hoặc mô được ép giữa hai tờ giấy lọc, nhựa tế bào sẽ ngấm
vào giấy lọc sau đó dùng phương pháp nhuộm để xác định. Đối với một số chất được tế bào
tiết ra môi trường thì có thể xác định theo phương pháp dùng màng phủ than hoạt tính để hấp
thụ các chất sau đó dùng tia cực tím (UV) để xác định (Knoop and Beiderback, 198). Ngồi ra
có thể sử dụng phương pháp xác định dựa vào tính chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn
của các chất do tế bào tiết ra như berberine chẳng hạn (Suzuki & cs, 1987). Các phương pháp
khác như phóng xạ hoặc phân biệt tế bào bằng huỳnh quang cũng đã được sử dụng.
Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao
thành công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào nuôi cấy
là rất quan trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ.Tuy nhiên vai trò
của các chất điều hồ sinh trưởng và nồng độ đường đã được ghi nhận. Hàm lượng các chất
thứ cấp trong tế bào còn phụ thuộc vào tăng trưởng về sinh khối, tốc độ tổng hợp và tiết ra
môi trường của các chất này.
Thường thường tế bào nuôi cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chu kỳ
sinh trưởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào nuôi cấy có tốc độ sinh trưởng nhanh và không
kèm theo sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp. Những tế bào nuôi cấy có tốc độ phân
chia chậm thì có ưu thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp.
Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề
được nhiều tác giả quan tâm. Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có
năng suất cao cho hàm lượng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suất thấp.
Cũng trên đối tượng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ cây có năng suất cao
không phải lúc nào cũng cho năng suất chất thứ cấp cao. Kết quả này cũng được công bố trên
những lồi cây khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979). Cho đến nay vẫn chưa có
chứng minh chắc chắn về tương quan giữa năng suất của cây làm nguyên liệu và năng suất

thứ cấp từ tế bào nuôi cấy. Viện Công nghệ sinh học Canada và các phòng nghiên cứu của
hãng Vipont đã hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công nghiệp sản xuất Sangninarine
sử dụng trong sản xuất thuốc đánh răng (Agricell Report, 1989).
Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công nghiệp
dược, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các chất này rất khó tổng hợp và hiện nay nguồn
cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng. Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng nguồn cung cấp
hoặc thay thế việc trồng trọt các cây cho những chất này đang được quan tâm đặc biệt. Vấn
đề tìm ra các phương pháp chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là khâu then
chốt để đưa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mô công nghiệp. Những thành tích đạt được
trong lĩnh vực này đặc biệt là việc công nghiệp hố sản xuất Shikonin bằng tế bào nuôi cấy là
những tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy để nhận các chất thứ cấp có giá trị
kinh tế cao.
Ở Việt Nam các nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận các chất thứ cấp đã được
bắt đầu từ những năm 80 trên các đối tượng thuốc lá, tam thất, thanh hao, taxus. Năm 1988,
Phan Huy Bảo và cs đã thông báo chọn được dòng tam thất cho hàm lượng saponin cao.
Những thay đổi về hàm lượng nicotine liên quan đến quá trình phân hố mô và cây tái sinh
cũng đã được công bố ( Nguyễn Đức Thành và cs, 1991 ).
Phần 4: DUNG HỢP PROTOPLAST VÀ LAI TẾ BÀO SÔMA.
I. Dung hợp protoplast và lai nhân.
Do không có vách xellulô nên protoplast (tế bào trần) trở thành một đối tượng lý
tưởng trong việc nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai
loại protoplast có thể tạo đươc các cây lai sôma (lai nhân hoặc lai tế bào chất). Ngồi ra có thể
sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan như nhân, lục lạp, ty thể hoặc
chuyển các vectơ mang các gen mã hố cho một số đặc điểm biết trước.
- 13 -
Protoplast có thể dung hợp tự nhiên. Hiện tượng này thường xảy ra sau khi tách
protoplast từ một loại cây. Tần số dung hợp tự nhiên phụ thuộc vào các giốâng cây Schieder
& Vasil, 1980), ở cà độc dược (Datura inoxi) tần số này đạt tới 8% (Schieder, 1974).
Để dung hợp hai loại protoplast khác nhau thường phải xử lý một số tác nhân. Một số
tác giả dùng nước biển (Hofmeister, 1954; Binding, 1966, 1974), hoặc nitrat natri (Power &

giống nhau ta sẽ tạo được các sản phẩm đồng hợp gen (homogenome). Trong trường hợp
dung hợp hai loại protoplast khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm dị hợp gen (heterogenome). Các
sản phẩm đồng hợp gen sẽ tạo ra các kiểu hình giống như bố mẹ nhưng với mức bội thể gấp
đôi. Các sản phẩm dị hợp gen sẽ tạo ra tế bào dị nhân với hỗn hợp lục lạp và ty thể. Một
trong hai nhân có thể bị thối hố hoặc cả hai đều phân ly trong quá trình phân chia tế bào. Sự
thối hố hoặc phân ly của một nhân trong tế bào dị hợp gen sẽ tạo ra những tế bào chứa tế bào
chất của cả hai loại protoplast và chỉ có một nhân. Những tế bào kiểu này được gọi là các thể
lai tế bào chất.
Muốn chọn các thể lai sôma bằng dung hợp protoplast có thể sử dụng các đặc điểm
phối hợp, các đặc điểm kháng sinh hố và các đột biến sắc tố, ngồi ra có thể sử dụng các đặc
điểm khác nhau tự nhiên giữa các loại protoplast.
- 14 -
Melcher là người đầu tiên sử dụng sự phối hợp hai đột biến bạch tạng để chọn sản
phẩm dung hợp ở thuốc lá (Melchers & Labil, 1974). Một số tác giả khác đã sử dụng phương
pháp tương tự trong các thí nghiệm lai giữa các cây dại trên cùng lồi như P.innoxia
(Schieder, 1977) và các cây khác lồi như P Parodii + P.Hybrida (Cocking 1978), N.
Tabacum + N. Glauca (Evans & cs, 1978). Sự phối hợp các đột biến tự dưỡng như thiếu
nitrate reductase, thiếu các axit amin và vitamin hoặc mẫn cảm với nhiệt độ đã được nhiều
tác giả sử dụng có kết quả (Schieder, 1974; Glimelius & cs, 1978; Muller & Grafe, 1978;
Sidorov & cs, 1981; Sidorov & Maliga, 1982; Evola, 1983; Gebhardt & cs, 1983;Shimamoto
& cs, 1983). Điều đáng chú ý là các đột biến sử dụng để chọn phối hợp phải là các đột biến
lặn và khác alen.
Đặc điểm kháng các chất ức chế trao đổi chất cũng được sử dụng rộng rãi để chọn thể
lai. Power và cs (1976) đã sử dụng actinomyxin để chọn thể lai giữa P. Parodii và P.
Hybrida. Maliga và cs (1977, 1982) dùng kanamyxin và streptomyxin để chọn thể lai trong
các thí nghiệm dung hợp giữa các lồi thuốc lá với nhau.
Một số dòng tế bào và cây lai còn được chọn bằng sự khác nhau về khả năng sinh
trưởng và tái sinh của sản phẩm dung hợp và từng loại protoplast (Carlson & cs, 1972; Power
& cs, 1977), bằng ưu thế trong sự phát triển của cây lai (Cocking & cs, 1977; Schieder, 1978;
Schieder & cs, 1978; Krumbiegel & Schieder, 1979; Dudits & cs, 1979; Lonnerndoker &

và dã yên vào protoplast của cây bình thường và tái sinh được cây (Vasil & Vasil, 1974;
Vasil, 1976). Các tác giả còn xác định được gen điều khiển tính BDĐ ở ngô.
Những công trình trên đã đi vào lịch sử. Từ đó đến nay không có những công bố tiếp
theo. Sở dĩ như vậy là do những hạn chế về việc tách nhận các bào quan nguyên vẹn và giữ
nguyên hoạt động của chúng. Đây là vấn đề hết sức khó khăn vì trong quá trình tách và làm
sạch, các bào quan bị giảm sức sống. Ngồi ra chúng còn dễ bị ảnh hưởng bởi các tác nhân
trong quá trình dung hợp. Mặt khác nữa là trong các công trình kể trên hiệu suất dung hợp
còn rất thấp.
Bắt đầu từ năm 1978 đến nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật dung hợp hai
loại protoplast, trong đó một loại có các d0ặc điểm di truyền lục lạp và ty thể đã được xác
định để tạo các cây lai tế bào chất. Belliard và cs (1978) là những người đầu tiên sử dụng
thành công phương pháp này. Tuy nhiên tỷ lệ cây lai tế bào chất nhận được còn thấp và việc
phân tích di truyền các cây lai nhận được bị gặp nhiều khó khăn do sự hình thành cả các thể
lai nhân. Để khắc phục những hạn chế trên, Zelcer và đồng nghiệp lần đầu tiên sử dụng
phương pháp dung hợp “cho và nhận“ (Zelcer & cs, 1978). Ôâng dùng tia X để giết nhân của
một loại protoplast. Những protoplast đã bị chiếu xạ này không thể phân chia được mà chỉ
đóng góp tế bào chất trong quá trình tạo cây lai. Zelcer dung hợp protoplast đã giết nhân
(protoplast cho tế bào chấ) của N. Tabacum với protoplast nguyên vẹn (protoplast nhận) của
N. Sylvestris. Ôâng đã chuyển được tính BDĐ (đặc điểm ty thể) từ N. Tabacum sang N.
Sylvestris.
Các đặc điểm liên quan tới lục lạp cũng đã được chuyển thành công nhờ phương pháp
trên (Beversdorf & cs, 1980; Menczel & cs, 1982; Aviv & cs, 1984; Fluhr & cs, 1983, 1984,
1985; Kemble & Barsby, 1988).
Ngồi việc dùng tia phóng xạ để giết nhân có thể dùng một số chất hố học như
iodoacetate (Medgyey & cs, 1980), hoặc dùng ly tâm để loại bỏ nhân (Wallin & cs, 1977;
Maliga & cs, 1982). Nhưng trong các trường hợp này tỷ lệ nhân sống sót vẫn còn đáng kể.
Đối với các đặc điểm di truyền lục lạp rất dễ dàng chọn lọc và theo dõi sau khi dung
hợp bằng các chỉ thị di truyền lục lạp như các đột biến lạp thể (Gleba & cs,1978), các đột
biến kháng sinh hố như kháng một số độc tố nấm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs, 1985), các
đột biến kháng thuốc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo & Maliga, 1982;

lạp (hoặc của bố, hoặc của mẹ). Trong công trình của Belliard, tác giả chỉ xác định được một
loại cpADN trong cây lai tế bào chất (Belliard & cs, 1978). Thành và cs đã chứng minh cây
thuốc lá nhận được từ dung hợp protoplast của hai loại cây khác tông Salpiglossis sinuata
(cây cho lục lạp) và N. Tabacum (cây nhận lục lạp) chỉ chứa một loại lục lạp của S. Sinuata
(Thanh & cs, 1988). Trong một vài trường hợp các tác giả này lại xác định được cả hai loại
lục lạp. Một số tác giả khác cũng thu được những kết quả tương tự (Aviv & cs, 1980, 1984;
Glimelius, 1981; Bonnet & Glimelius, 1983).
Mặc dù trong một số công trình các tác giả chứng minh được sự tồn tại của hai loại
cpADN trong cây lai nhưng chưa ai thấy được hiện tượng tái tổ hợp của cpADN. Vấn đề tái
tổ hợp của cpADN ở thực vật bậc cao tuy đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới
nghiên cứu, xong đến cuối những năm 80 mới có hai công bố về sự tái tổ hợp cpADN trong
cây lai tế bào chất ở thuốc lá (Medgyesy & cs, 1985) và cây lai tế bào chất giữa thuốc lá và
khoai tây (Thanh & cs, 1989). Tái tổ hợp ADN lục lạp là một vấn đề rất có ý nghĩa, thông
qua tái tổ hợp cpADN có thể tạo ra các tổ hợp gen tế bào chất mới.
Đối với ty thể trong tồn bộ các công trình đã công bố đều cho thấy ở các cây lai tế bào
chất luôn xảy ra sự tái tổ hợp mtADN (Belliard & cs, 1978; Nagy & cs, 1981, 1983; Clark &
cs, 1986; Kemble, 1986; Robertson & cs, 1987). Kết quả của sự tái tổ hợp này là tạo ra các
kiểu hình hoa mới, và các kiểu hình này rất ổn định (Belliard & Pelletier, 1979). Tái tổ hợp
mtADN xảy ra ngay cả sau khi dung hợp protoplast của hai giống thuốc lá có mtADN tương
tự nhau, tuy nhiên sự tái tổ hợp xảy ra nhiều hơn khi dung hợp hai lồi thuốc lá khác nhau như
N. tabacum và N. Plumbaginifolia (Nagy & cs, 1981, 1983).
- 17 -
Cho đến nay, việc nhận cây lai tế bào chất bằng kỹ thuật dung hợp protoplast mới
được thực hiện chủ yếu ở các lồi thuốc lá, cải và bước đầu thành công ở khoai tây. Tuy vậy
những thành tựu đạt được đã mang lại những ứng dụng thực tiễn trong việc cải biến cây
trồng. Chuyển lục lạp có thể giúp cho việc khôi phục năng suất ở cây cải dầu – Brasica
napus (Bennerot & cs, 1974; Pelletier & cs, 1983) và tạo các giống cây trồng kháng các chất
diệt cỏ (Benversdof & cs, 1980; Binding & cs, 1982; Gressel & cs, 1984; Pelletier & cs,
1985).
Lai tế bào chất bằng dung hợp protoplast có thể rút ngắn thời gian tạo các dòng bất

-Tách ADN plasmid.
- 18 -
-Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật.
-Chọn các thể biến nạp.
-Tái sinh cây biến nạp.
-Chứng minh sự có mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh.
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh
học của hệ thống chuyển gen như :
-Không phải tồn bộ tế bào đều thể hiện tính tồn năng.
-Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu
nhận gen biến nạp vào genôm.
-Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có những khả năng khác nhau. Cần xem
xét một số vấn đề như: chỉ có số ít tế bào có khả năng tái sinh và biến nạp; một số khác có
một trong hai khả năng; một số nếu tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng; một số
khác hồn tồn không có khả năng tái sinh và biến nạp.
-Thành phần các quần thể tế bào được xác định bởi lồi, kiểu gen, từng cơ quan, từng
giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
-Cho đến nay gen chỉ có thể chuyển vào tế bào có thành xellulô bằng Agrobacterium,
virus, vi tiêm, bắn gen và chuyển gen trực tiếp.
Khả năng xâm nhập của gen vào genôm một cách ổn định không tỷ lệ với sự thể hiện
tạm thời của gen.
Các ADN không phải là của virus khi có trong genôm chưa bảo đảm là đã gắn ổn định
với genôm.
-Các ADN không phải của virus không chuyển rời từ tế bào nọ sang tế bào kia, nó chỉ
ở nơi mà nó được đưa vào.
-ADN virus không xâm nhập vào genôm cây chủ, chuyển từ tế bào này sang tế bào
khác và bị loại ở mô phân sinh.
II. Các phương pháp chuyển gen.
1. Chuyển gen bằng Agrobacterium.
Chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp hữu hiệu đầu tiên dùng để chuyển

chuyển nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao; có thể chuyển gen vào protoplast
bất kỳ lồi cây nào. Tuy nhiên vấn đề tái sinh cây từ protoplast còn khó khăn ở một số lồi cây.
Mặc dù đã có nhiều thành tựu trong nuôi cấy protoplast nhất là protoplast của các giống cây
có giá trị kinh tế như lúa, ngô, luá mì, đại mạch nhưng phần lớn việc tách nuôi tế bào đều
phụ thuộc vào việc thiết lập hệ thống nuôi cấy phôi để làm nguyên liệu ban đầu mà điều này
không phải dễ thực hiện đối với các giống cây trong sản xuất.
4. Phương pháp bắn gen.
Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng được bao bọc
ADN bắn vào tế bào. Bằng phương pháp này có thể biến nạp tất cả các loại tế bào. Người ta
hy vọng phương pháp này sẽ giải quyết tất cả các vấn đề chuyển gen, nhưng cho đến nay tần
số biến nạp bằng phương pháp bắn gen còn thấp và thường xuyên nhận được cây biến nạp
khảm (cây có các tế bàobiến nạp và tế bào không được biến nạp). Có thể nói đến một số ưu
điểm của phương pháp bắn gen là :
-Thao tác dễ dàng.
-Bắn một lần được nhiều tế bào.
-Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nbuôi cấy, tế bào của các mô biệt hố và
mô phân sinh).
- 20 -
Cây đậu tương biến nạp đầu tiên đã nhận được bằng phương pháp này (McCabe & cs,
1988). Nhiều phòng thí nghiệm đã nhận được cây ngô biến nạp trong cùng thời gian (Fromm
& cs, 1990; Gordom- Kamm & cs, 1990). Một vấn đề tồn tại quan trọng là tần số biến nạp ổn
định thấp vì thế theo Potrykus (1991) thì ưu điểm thực sự của phương pháp bắn gen là ứng
dụng trong nghiên cứu sự thể hiện tạm thời của gen. Nhưng trong những năm gần đây đã có
hàng loạt các công bố về biến nạp thành công trên lúa (Zhang & cs, 1996), đu đủ, mía,
bông đã khẳng định những ưu việt của phương pháp này.
5. Phương pháp vi tiêm.
Phương pháp vi tiêm (microinjection) vào hợp tử và phôi từ hạt phấn. Phương pháp
vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi đưa ADN vào những tế bào nhất định
(Neuhaus & Spangenberg, 1990). Phương pháp này đã tạo được dòng biến nạp từ protoplast
và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn ở cây cải dầu. Giống phương pháp bắn

đại mạch để xem phương pháp điện di ADN qua mô có thể vận chuyển gen vào tế bào hay
không. Kết quả tác giả nhận được sự thể hiện tạm thời của gen chỉ thị (GUS) nhưng không
chứng minh được sự biến nạp ổn định.
-Liposom có chứa ADN cũng đã được sử dụng như một phương tiện để đưa gen ngoại
lai vào tế bào thông qua dung hợp (Caboche, 1990) hoặc vi tiêm vào không bào (Lucas,
1990). Cả hai phương pháp này đều chưa thu đựợc kết quả.
-Phương pháp vi laser được ứng dụng để tạo lỗ hổng trên màng tế bào sau đó ủ tế bào
với dung dịch ADN được Weber và cs (1990) sử dụng như một phương pháp chuyển gen
không cần vectơ, nhưng sau một thời gian dài vẫn chưa có kết quả chắc chắn về sự xâm nhập
của ADN vào tế bào (1995) Guo và cs đã kết hợp việc xử lý tế bào với dung dịch đẳng
trương để rút bớt nước từ tế bào sau đó chuyển vào môi trường có thế năng thẩm thấu yếu có
chứa ADN ngoại lai và dùng laser tạo lỗ trên màng tế bào để ADN xâm nhập vào tế bào.
Bằng phương pháp này các tác giả đã quan sát thấy sự thể hiện của gen biến nạp sau khi xử
lý tế bào và ở cây tái sinh.
Phần 6: SỰ PHÁT TRIỂN VÀ THÀNH TỰU CỦA NUÔI CẤY MÔ
VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Ở VIỆT NAM.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh
kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào đầu tiên được xây dựng tại viện
Sinh học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Bước đầu
phòng tập trung vào nghiên cứu các phương pháp nuôi cấy cơ bản trong điều kiện Việt Nam
như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Các kết quả đầu tiên về nuôi cấy
thành công bao phấn lúa và thuốc lá đã được công bố vào 1978 (Lê Thị Muội và cs, 1978; Lê
Thị Xuân và cs, 1978). Tiếp đó là thành công về nuôi cấy protoplast ở thuốc lá và khoai tây
(Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980,
1981). Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở thành phố Hồ Chí Minh và muộn hơn
nữa là tại Đại học Nông nghiệp 1 (ĐHNN1), Hà Nội và viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp
Việt Nam (KHKTNNVN) các phòng thí nghiệm cấy mô không những ở các viện nghiên cứu
(viện Di truyền nông nghiệp /DTNN; viện Rau quả trung ương /RQTƯ) mà cả ở một số tỉnh
và cơ sở sản xuất (Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh, Cần Thơ, ).
Từ giữa những năm 80 trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế

Kĩ thuật sản xuất giống trong phòng thí nghiệm còn là biện pháp hữu hiệu để xây dựng
những chương trình chọn lọc tối ưu.
Kĩ thuật nuôi cấy mô còn cho phép với một qui trình dài có được những sản phẩm có
tính di truyền hồn hảo như nhau và như thế có thể sử dụng như « bố mẹ lai » và cũng
dùng để tạo ra những dòng mới.

- 23 -
KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân, 1994: Công nghệ gen và Công nghệ sinh học ứng dụng
trong y dược học hiện đại, NXB Y học.
2. Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
4. Lê Đình Lương, 2001: Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
5. Nguyễn Đức Thành, 2000: Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Nông nghiệp.
6. Nguyễn Lân Dũng: Thế kỷ 21- thế kỷ vàng của công nghệ sinh học, Khoa học phổ thông,
Xuân 1997.
7. Nguyễn Như Khanh, 2006: Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục.
8. Trần Thế Thông: Công nghệ sinh học với nông nghiệp, Khoa học phổ thông, Xuân 1997.
9. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006: Công nghệ sinh học, NXB Giáo
dục.
10. Công nghệ sinh học : http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/cong
nghesinhhoc/chuong15.
11. Tạp chí sinh học, tập 28- số 4, tháng 12/2006.- 24 -
- 25 -