Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
ĐỖ NGỌC TUYỀN SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ
PHÂN TỬ (MAS) CHỌN LỌC CÁC DÒNG LÚA TRIỂN VỌNG
CHO NĂNG SUẤT CAO MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH
TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN ĐĂNG KHÁNH
THÁI NGUYÊN - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện hầu hết các nghiên cứu trong
luận văn này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao
chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này
chưa từng được công bố.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Tác giải luận văn Đỗ Ngọc Tuyền
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv
Danh mục bảng v
Danh mục hình vi
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Nguồn gốc, phân loại, ý nghĩa của cây lúa 4
1.2. Chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống 6
1.2.1. Chỉ thị phân tử 6
1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống ( Phương
pháp Marker assisted selection- MAS) 11
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu 15
1.3.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu quốc tế 15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 21
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Vật liệu nghiên cứu 24
2.1.1.Giống lúa nghiên cứu 24
2.1.2.Các chỉ thị phân tử và hóa chất thí nghiệm 24
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA
:
Deoxyribonucleic Acid
AFLP
:
Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình
chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc
Bp
:
Base pair – Cặp bazơ nitơ
Cs
:
Cộng sự
dNTP
:
Deoxynucleotide triphosphate
MAS
:
Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử
PCR
:
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp
QTL/QTLs
:
Quantitative Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
vi
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Minh họa QTL/gen Yd7………….………………………………. 26
Hình 3.1: Kết quả tách DNA tổng số trên gel agarose 0,8% …… ….… . …31
Hình 3.2: Sản phẩm điện di với các chỉ thị trên gel agarose 2,5% … . …32
Hình 3.3: Kết quả lai tổ hợp Khang dân 18 và KC25……………….……… . 33
Hình 3.4: Kết quả điện di trên gel agarose 2,5% với chị thị RM500 33
Hình 3.5: Kết quả điện di trên gel agarose 2,5% với chị thị RM21615 34
Hình 3.6 : Kết quả điện di kiểm tra quần thể F2 với chỉ thị RM21615 35
Hình 3.7: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F2 với chỉ thị RM500 36
Hình 3.8: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F3 với chỉ thị RM500 38
Hình 3.9: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F3 với chỉ thị RM445 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
1
và chủ yếu liên quan tới việc tăng cường tính chống chịu đối với sâu bệnh và
điều kiện ngoại cảnh bất lợi, những đặc điểm mong muốn về hình thái luôn bị
ảnh hưởng từ điều kiện môi trường hoặc không biểu hiện khi điều kiện ngoại
cảnh không phù hợp.
Xuất phát từ những thực tế trên tôi thực hiện đề tài: “Sử dụng phương
pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) chọn lọc các dòng lúa triển
vọng cho năng suất caomang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên
bông”với mục tiêu thông qua phương pháp MAS (Marker - Assisted
Selection) xác định được các dòng lúa triển vọng cho năng suất cao.
2. Mục đích nghiên cứu
Chọn được cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên
bông ở thế hệ F1, F2, F3 của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25.
Ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử chọn lọc dòng
lúa mang QTL/gen và cho năng suất triển vọng.
3. Ý nghĩa của đề tài
Xác định kiểu gen ở cả quần thể F1, F2, F3, khẳng định sự có mặt của
QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông trong quần thể.
Đánh giá nhanh và chính xác các dòng lúa mang QTL/gen làm tăng
năng suất.
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử làm giảm thời gian, công sức và vật
chất nhiều lần so với chon giống bằng phương pháp truyền thống.
Tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về các tính trạng tăng năng suất.
4. Nội dung nghiên cứu
4.1. Xác định chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7 giữa giống Khang
Dân 18 và giống KC25.
4.2. Lai tạo thế hệ F1 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
3
được trồng ở vùng ôn đới. Loài Oryza sativa L. có số nhiễm sắc thể đơn bội n
= 12. Tám trong số 23 loài lúa dại có bộ gen tứ bội, đại đa số các loài lúa dại
và lúa trồng hiện nay có bộ gen lưỡng bội (2n). Hiện có khoảng 83.000 mẫu
lúa được lưu giữ ở ngân hàng gen quốc tế tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế
(IRRI), ngân hàng gen quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia,
Việt Nam, Trong đó, có khoảng 9700 mẫu giống lúa đặc thù cho tính chịu
hạn, úng, nóng, lạnh, sâu bệnh.
Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L.) còn được gọi là lúa châu Á vì nó
được thuần hóa từ lúa dại từ ba trung tâm đầu tiên ở châu Á. Theo đặc điểm
lúa trồng Việt Nam thì chủ yếu là các giống Indica.
Lúa là cây lương thực quan trọng trong đời sống của con người. Lúa
cung cấp lương thực cho hơn 1/2 dân số thế giới. Trên 2/3 lượng calo cho 3 tỷ
dân ở châu Á, 1/3 lượng calo cho 1,5 tỷ dân ở châu Phi và châu Mỹ La Tinh
là do lúa cung cấp. Trong cơ cấu sản xuất lương thực của thế giới lúa mì
chiếm 30,5%, lúa gạo 26,5%, ngô 24%, còn lại là các loại ngũ cốc khác.
Cây lúa đem lại hiệu quả kinh tế cao. Ngoài việc sử dụng làm lương
thực, các sản phẩm phụ, cây lúa còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
5
nhau như: Làm nguyên liệu sản xuất rượu, bia, sản xuất tinh bột, cồn, phấn
mịn, cám gạo có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc; trong công nghệp dược
dùng để sản xuất vitamin B1, dầu cám có chất lượng cao dùng chữa bệnh, chế
tạo sơn cao cấp, làm mỹ phẩm, xà phòng; trấu dùng để sản xuất nấm men…;
rơm rạ có thể dùng làm chất đốt, sản xuất giấy, sản xuất nấm.
Châu Á vốn là vùng đông dân cư và cũng là vùng sản xuất lúa gạo chủ
yếu của thế giới, trong thập kỷ qua cũng có những tiến bộ đáng kể trong việc
năng cao năng suất và sản lượng lúa gạo. Châu Á sản xuất khoảng 92% tổng
sản lượng lúa gạo của thế giới, châu Mỹ 4,7%, châu Phi 2,7%, châu Đại
chỉ thị phân tử. Trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, quá trình chọn lọc
được dựa trên cơ sở các chỉ thị phân tử liên kết với các gen quy định tính
trạng cần quan tâm.
Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử trong chọn giống đã trở nên hữu hiệu
không chỉ đối với các tính trạng được điều khiển bởi các gen chính mà đối với
cả những tính trạng số lượng được điều khiển bởi các gen phụ hay các QTLs.
Hiệu quả cải tiến cây trồng sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với chọn giống cổ
điển, nhờ thực hiện chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn,
mà thông qua chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng đó. Phương pháp này cho
phép thanh lọc kiểu hình với một khối lượng quần thể lớn. Thông qua chọn
lọc nhờ chỉ thị phân tử, người ta có thể xác định được cây mang gen ngay thế
hệ phân ly đầu tiên ở F2, F3. Như vậy các nhà chọn giống có thể rút ngắn thời
gian đánh giá kiểu hình, tập trung chọn lọc những mục tiêu quan trọng khác có giá
trị về mặt kinh tế. Nếu so sánh với chọn lọc kiểu hình, MAS có thể giúp các nhà
chọn giống tiết kiệm từ 1 đến 16,7 lần trong chọn lọc quần thể [35].
Một chỉ thị phân tử ADN đạt tiêu chuẩn cần có những yêu cầu như: bản
chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội (cho phép phân biệt cá thể đồng
hợp tử - dị hợp tử), phân biệt rõ ràng giữa các alen, xuất hiện nhiều trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
7
genôm (tần suất xuất hiện trong hệ genôm cao), phân bố đều trên hệ
genôm, dễ dàng tiếp cận đánh giá, trạng thái trung tính (không chịu tác
động đa gen), phân tích nhanh và dễ dàng, khả năng tái lập cao, kết quả
trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu, chi phí thấp [33], [55]. Trong
thực tế, không có một chỉ thị phân tử ADN nào lý tưởng, đạt được đầy đủ
những yêu cầu này; tùy từng mục đích nghiên cứu mà người ta sử dụng hệ
thống các chỉ thị phân tử DNA thỏa mãn một số điều kiện chính [1].
Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử còn là phương tiện hữu ích trợ giúp đắc
phương pháp này là tốn nhiều thời gian và công sức, đòi hỏi có phòng thí
nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là tiêu hao một lượng
lớn DNA mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở một số loài khó
nhận được đa hình
b. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs – Đa hình
các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên).
Đây là loại chỉ thị di truyền được tạo ra trên cơ sở của phản ứng PCR,
sử dụng một loại mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit và quá trinh nhân bội ngẫu
nhiên. Sản phẩm nhân bội có thể được phân tách bằng điện di trên gel agarose
hoặc polyacrylamide và có thể được quan sát sau khi nhuộm gel với các hoá
chất đặc trưng. Nó là loại chỉ thị di truyền trội. Sự khác biệt giữa hai cá thể có
thẻ nhận biết bằng sự có mặt hay vắng mặt của những băng RAPD đặc trưng.
Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền, dễ sử dụng.
c. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình
chiều dài các đoạn DNA nhân bản chọn lọc).
Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn và PCR
[54]. Để thiết kế được các mồi đặc trưng trước hết cắt các mẫu nghiên cứu
bằng enzym giới hạn. Khi xử lý enzym giới hạn DNA sẽ bị cắt thành vô số
mảnh có kích thước khác nhau. Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
9
nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các
đoạn gắn (adaptor). Sau đó dùng enzym ligase để nối các đoạn DNA thích
ứng vào hai đầu DNA đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR.
Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần kia
là những nucleotide được thêm vào tùy ý, thường từ 1 – 3 nucleotide. Với mồi
thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn DNA có trình tự ở hai đầu bổ sung với
trình tự mồi mới được nhân bản.Ưu điểm của phương pháp này là lượng DNA
trong khắp hệ gen của sinh vật. Bản chất đa hình của Microsatellites có thể
được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn
mồi bổ sung với trình tự gần kề hai đầu đoạn lặp lại. Giá trị của SSR ở chỗ nó
sinh ra đa hình từ nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản
chât đồng trội, nên dễ dàng phát hiện bởi các phản ứng PCR.
Nguyên lý của kỹ thuật SSR dựa trên những đoạn DNA lặp lại một
cách có trật tự, hiện tượng này phổ biến với các sinh vật nhân chuẩn, tuỳ
thuộc vài từng loài mà số lượng các nuleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể
thay đổi. Các đoạn SSR thường nằm ở vùng gần tâm động hoặc ở đầu mút của
nhiễm sắc thể và có vai trò điều hoà hoạt động của gen. SSR là kỹ thuật dựa
trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các tình tự lặp
đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp
theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi. Các trình tự gần kề và các
trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. Các mồi SSR sau đó được sử dụng tương tự
như các mồi RAPD.
f. Chỉ thị ISSR
ISSR là kỹ thuật dựa trên PCR, nhân bản các đoạn DNA nằm giữa hai
vùng lặp SSR hướng ngược chiều nhau sử dụng một loại mồi duy nhất (dài
khoảng 15 – 25 nucleotit) có trình tự lặp giống như chỉ thị SSR. Các mồi
ISSR có thể được bổ sung thêm từ một đến bốn nucleotit “neo” ở đầu 3’ [63]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
11
hoặc đầu 5’ [68] nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng nhân gen. Hầu hết chỉ
thị ISSR là chỉ thị trội và có tính ổn định cao hơn chỉ thị RAPD. Dựa trên các
trình tự lặp và số nucleotit làm “neo” để thiết kế mồi ISSR thì số lượng chỉ thị
ISSR gần như là không giới hạn [33]. Chỉ thị ISSR có tính đa hình cao và rất
hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền.
Bên cạnh SSR và ISSR còn có nhiều chỉ thị khác được phát triển dựa
hay đi kèm với các hiệu ứng phụ không mong muốn.
Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép
phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của chị thị
hình thái tương tác theo kiểu trội lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ
hợp lai.
Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc
đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ
thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp.
b. Điều kiện để ứng dụng MAS
Sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào ba
yếu tố chính:
Bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các
vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm.
Mỗi liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs.
Sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen.
Khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và
thành hiệu quả.
Thành công của MAS còn phụ thuộc vào vị trí của chỉ thị so với gen
quan tâm. Có ba kiểu quan hệ giữa chỉ thị và gen quan tâm :
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
13
Chỉ thị phân tử được định vị ngay trong phạm vi gen quan tâm. Đây là
trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này.
Chỉ thị phân tử Linkage disequilibrium với gen quan tâm. Đây là nhóm
chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng nhau. Mối quan hệ này tìm thấy khi
gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau. Chọn lọc dựa trên chỉ thị này
gọi là LD-MAS.
Chỉ thị có mối cân bằng liên kết với các gen quan tâm. Đây là tường
mối quan hệ: “Tính trạng - Gen (QTLs) - Môi trường”. Do vậy ứng dụng quan
trọng nhất của MAS là sử dụng những chỉ thị phân tử cho ba mục đích sau:
Tìm kiếm phát hiện những biến dị di truyền, các gen quan tâm trong số
các cá thể, giữa các giống, loài.
Phân lập nhanh các cá thể cần quan tâm trong quần thể dựa trên thành phần
của gen hay các chỉ thị liên kết với các alen quan tâm đối với các locut mong muốn.
Chuyển một vùng gen, đối với những tính trạng quan tâm được quy
định bởi đơn gen hay một gen chịu trách nhiệm phần lớn việc biểu hiện kiểu
hình của tính trạng.
Trong chọn giống lúa, MAS ngày càng được sử dụng rộng rãi để rút
ngắn các quá trình phục hồi các dòng bố mẹ trong các chương trình lai lại.
MAS sẽ giúp cho quá trình những gen quan tâm vào các giống có cấu trúc hệ
gen khác nhau một cách nhanh chóng do MAS cho phép tối ưu hoá số cây cần
chọn, số lần lai trở lại, hoặc loại bỏ các cá thể không liên quan đến những gen
quan tâm. Khi so sánh với chọn giống truyền thống, vai trò trợ giúp của chỉ
thị phân tử có thể cải thiện hiệu quả chọn giống ở ba điểm:
Đối với tính trạng khó đánh giá kiểu hình, chọn lọc đối với một chỉ thị
alen cây bố mẹ cho gen tại vị trí locut gần với gen quan tâm có thể làm tăng
hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
15
Sử dụng chỉ thị để chọn lọc quần thể lai trở lại nhằm hạn chế số lượng
gen nằm ngoài vùng quan tâm và để chọn lọc quần thể lại hiếm tạo ra từ việc
tái tổ hợp gần gen quan tâm, vì thế hạn chế đối đa tác động của các yếu tố
cản trở có liên quan.
Chuyển các gen lặn bằng phương pháp truyền thống và chọn lọc trong
các quần thể tự phối sau mỗi lần lai trở lại. (Chuyển các gen lặn trong phương
pháp truyền thống đòi hỏi phải có các thế hệ tự phối sau mỗi lần lai trở lại,
QTLs quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử
RM283-RM259 của các tác giả [29], [53], [70], RG690-RM212 của các tác
giả [28], [20], [39], và RG810-RG331 xác định bởi các tác giả [28], [50]. Một
QTL liên kết tính trạng số hoa trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1-RM490
của các tác giả [22], [53], [58], [70] và một QTL liên kết tính trạng số hạt
chắc trên bông đã được xác định bởi các tác giả [22], [29], [53], [58], [70] tại
vị trí giống QTLs liên kết tính trạng khối lượng nghìn hạt RM283-RM259.
Một QTL liên kết tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM265-RM315 được xác
định bới các tác giả [50], [53], [58].
Nhiễm sắc thể số 2: QTL quy định khối lượng nghìn hạt được xác
định từ năm tác giả khác nhau với cùng vị trí chỉ thị phân tử RM240-
RM266 được xác định từ các tác giả [39], [50], [53], [70]. Ba QTL liên kết
tính trạng tổng số hạt trên khóm, tại các vị trí gần tâm động bởi các tác giả
[25], [53], vị trí chỉ thị RM263 do các tác giả [22], [70] và vị trí chỉ thị
RZ123-RZ446 [58], [59]. Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt được
xác định từ ba tác giả tại vị trí chỉ thị phân tử RZ123-RZ446 trên vai dài
của nhiễm sắc thể số 2 [50], [58], [59]. Hai QTLs quy định tính trạng số
bông trên khóm được xác định tại vị trí gần tâm động được xác định bởi
năm tác giả [39], [41], [50], [59], [69].
Nhiễm sắc thể số 3: Một số tác giả đã xác định QTL liên kết tính trạng
khối lượng nghìn hạt trên nhiễm sắc thể số 3. Một trong số đó là QTL được
Copyright: Tài liệu đại học ©