Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
PHẦN 1
LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Tuy có diện tích trồng chè xanh rất lớn, chất lượng vào loại tốt nhất
thế giới nhưng nước ta chỉ chú trọng vào việc sử dụng làm đồ uống mà bỏ
qua Kaempferol, một hoạt chất quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh
ung thư – căn bệnh nan y của thế giới.
Sau khi được học xong bài tách chiết các chất hữu cơ, cùng với các tư
liệu mà các thầy cô giáo cung cấp, chúng em thấy việc tách Kaempferol là
không khó nên chúng em quyết định thực hiện ý tưởng này.
Mục đích đề tài của chúng em là chiết tách kaempferol từ lá chè xanh
nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có trong nước, góp phần
giảm bớt giá thành thuốc chữa ung thư – thường có giá rất cao. Đồng thời
nếu thành công và ứng dụng trong thực tế chúng ta còn có thể chủ động
nguồn nguyên liệu trong nước mà không phụ thuộc vào nước ngoài.
Từ những lý do trên, nhóm chúng em đã chọn đề tài: " NGHIÊN CỨU
CHIẾT TÁCH KAEMPFEROL TỪ LÁ CHÈ VIỆT NAM"
1
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
PHẦN 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về đề tài
Thực trạng bệnh ung thư: Theo thông tin từ Bộ Y tế Việt Nam và Tổ
chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000
-200.000 người mắc bệnh ung thư mới và khoảng 75.000 - 100.000 người tử
vong vì căn bệnh này. Ung thư hiện nay đang là nguyên nhân thứ hai gây tử
vong ở Việt Nam và thực sự là mối quan tâm của cả quốc gia.
Kaempferol là một trong những dược chất được các nhà nghiên cứu
trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu trong việc điều trị và phòng tránh
nhiều bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư khoang
miệng…

Quốc gia, Học viện Quân y, Viện Hoá học - Viện hàn lâm khoa học Việt
Nam gồm có:
Máy móc
– Máy cất quay chân không Eyela (Nhật Bản)
– Tủ sấy Memmert (Đức).
– Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).
– Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ).
– Máy cất quay chân không Büchi R-220 (Thụy Sỹ).
– Bếp ôm bình cầu có bảo ôn Heating Mantle (Trung Quốc).
– Máy đo nhiệt độ nóng chảy Memmert (Đức).
3
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
– Máy UV – VIS (Nhật).
– Thiết bị xác định phổ hồng ngoại (IR) Perkin Elmer.
– Thiết bị xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500
FT-NMR Spectrometer.
– Thiết bị xác định phổ khối lượng Varian 320 MS (Mỹ).
– Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)
Dụng cụ
– Phễu chiết 500mL và 1000mL ( Đức)
– Pipet
– Ống đong 100mL ( Đức)
– Cột thủy tinh
– Bình hút ẩm
– Bình cô quay 100mL, 250mL và 500mL
– Và các dụng cụ thuỷ tinh khác…
3.2. Khảo sát quá trình chiết xuất flavonoid từ lá chè xanh
Lá chè xanh được đem sấy ở 60
0
C trong 24h, sau đó đem xay thành

Bảng1. Kết quả khảo sát hàm lượng cắn flavonoid toàn phần từ lá chè
Dung môi
Hàm lượng cắn flavonoid thu được (g)
Cách 1 Cách 2
Methanol 60% 2,55 3,55
Methanol 70% 2,99 3,87
Methanol 80% 3,08 4,00
Nhận xét:
Ở cả 2 phương pháp chiết, dung môi chiết xuất là methanol 80% đều
cho hiệu suất cao nhất và ở các trường hợp dịch chiết được acid hoá cho hiệu
quả tốt hơn.
Sau khi thu được cắn flavonoid toàn phần, chúng em tiến hành xác
định xem trong đó có chứa kaempferol hay không bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng (TLC) với các điều kiện như sau: Bản mỏng silica gel GF
254
(Merck) được hoạt hóa ở 110
0
C trong 1 giờ. Hệ dung môi triển khai:
Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (5 : 4: 1). Hiện vết bằng hơi ammoniac
bão hòa .
Kết quả:
Trên sắc ký đồ cho thấy các vết đã được tách rõ ràng. Các vết này
đậm màu hơn khi hơ trên miệng lọ amoniac đặc, chứng tỏ trong đó có chứa
hỗn hợp nhiều flavonoid. Vết trên cùng (có Rf là 0,54) tương ứng với vết
Kaempferol chuẩn, chứng tỏ trong hỗn hợp này có chứa kaempferol.
5
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam

Hình 1. Kết quả sắc ký lớp mỏng cắn flavonoid
Như vậy, có thể khẳng định trong cắn flavonoid toàn phần chiết được

mAU
366nm,4nm (1.00)
/14.797/8413554
Hình 2. Sắc đồ kaempferol với điều kiện lựa chọn
Bảng 2. Hàm lượng kaempferol trong cắn flavonoid
Dung môi
Hàm lượng kaemferol trung bình trong cắn (%)
Cách 1 Cách 2
Methanol 60% 0,14 0,50
Methanol 70% 0,16 0,48
Methanol 80% 0,13 0,78
Kết quả thu được với phương pháp chiết bằng methanol 80% và acid
hoá cho hàm lượng kaempferol thu được là cao nhất, vì vậy chúng em quyết
định lựa chọn phương pháp này để tiến hành thực nghiẹm các bước tiếp
theo.
Từ các kết quả khảo sát thu được ở trên, nâng khối lượng lá chè nên
500g chúng em đề ra quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần trong lá chè
như sau:
Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chè:
Cân 500g lá chè rồi cho vào bình cầu 10L. Cho thêm 5L MeOH 80%.
Ngâm trong khoảng 6 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ nhất. Thực hiện ngâm bã
dược liệu trên với 2,5L MeOH 80% trong khoảng 2 giờ rồi rút dịch chiết lần
thứ hai. Đuổi bớt dung môi ở các lần chiết, gộp các dịch chiết methanol, cô
cạn dung môi dưới áp suất giảm bằng máy hút chân không thu được cắn.
Thêm nước nóng vào hòa tan cắn bám quanh thành ống nghiệm sau cô cạn,
thu được dung dịch có màu xanh lá đậm. Cho 50mL HCl đậm đặc vào dung
7
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
dịch, thủy phân trong khoảng 8 tiếng rồi cho dung dịch thu được vào bình
gạn. Lắc đều 3 lần với CHCl

đổ từ từ lên cột. Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ để các hạt chất nhồi
cột lắng xuống .Trong quá trình này luôn bổ sung CHCl
3
lên cột, tránh để
không khí tiếp xúc với silica gel. Ổn định cột trong khoảng 20 phút, đến khi
khoảng cách từ mặt trên lớp chất nhồi đến mặt trên dung môi rửa giải còn
khoảng 1 cm thì đóng khóa cột.
Xử lý mẫu:
Hòa tan 4 g flavonoid toàn phần trong cloroform, 4 g chất nhồi cột
silica gel 60 ,trộn đều, cô cạn dung môi thu được hỗn hợp bột. Chuyển nhẹ
nhàng vào cột, tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột, dùng pipet tráng vòng
quanh bên trong cột trước khi thêm dung môi rửa giải. Dùng hệ dung môi
giửa rải lần lượt như sau:
Lần 1: 80mL CHCl
3
Lần 2: 40mL CHCl
3
+ 0,5mL Aceton + 0,5mL CH
3
COOC
2
H
5
+
0,5mL CH
3
OH
Lần 3: 40mL CHCl
3
+ 1mL Aceton + 1mL CH

Xử lý mẫu:
Hòa 0,2g cắn với 4ml MeOH rồi đổ vào trong cột (đổ từ từ vào thành
cột để tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột), dùng pipet tráng vòng quanh
bên trong cột trước khi thêm methanol. Rửa giải bằng methanol, bỏ qua
dung dịch đầu cho đến khi màu của cắn chạm tới đáy cột. Cô cạn dịch rửa
giải thu được 0,8g chất.
Quy trình tách kaempferol từ flavonoid toàn phần được tóm tắt như
sau:
11
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
Sơ đồ 2.Quy trình phân lập kaempferol từ flavonoid toàn phần
12
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm
3.4.1. Nhiệt độ nóng chảy
Tiến hành đo điểm chảy của sản phẩm Kaempferol theo phương pháp
đo trong mao quản. Kết quả đo điểm chảy cho thấy điểm chảy của sản phẩm
là 279,1 ± 0,3. So với giá trị lý thuyết là 277 ± 1.
Nhận xét: Điểm chảy đo được của các hợp chất nghiên cứu phù hợp
với điểm chảy lí thuyết của hợp chất này.
3.4.2. Sắc ký lớp mỏng
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu kaempferol của viện
kiểm nghiệm thuốc trung ương thấy sản phẩm thu được có giá trị thời gian
lưu

phù hợp với chất chuẩn.
Hình 6. Kết quả sắc ký lớp mỏng của sản phẩm
3.4.3. Kết quả đo phổ
3.4.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS
Mẫu thử được hòa tan trong MeOH, nồng độ 0,01 mg/ml. Đem quét

14
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
PHẦN 4
KẾT LUẬN
Đa số các tác giả đã nghiên cứu tách chiết hợp chất này đều đưa ra
phương pháp chiết xuất, phân lập để lấy được hợp chất tinh khiết dùng cho
nghiên cứu phổ (qui mô phân lập từ vài milligram đến vài chục milligram).
Song, các tài liệu trên các tác giả chỉ quan tâm đếnviệc lấy được hợp chất và
nhận dạng đúng chất bằng một số phương pháp phổ màchưa tiến hành khảo
sát lựa chọn phương pháp tối ưu để chiết xuất, phân lập và tinhchế hợp chất.
Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng em đã khảo sát các phương pháp
chiết xuất, phân lập để lựa chọn phương pháp phù hợp nhất cho mục đích
tách được kaempferol, mục đích để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, với các
dung môi thong dụng và rẻ tiền. Cụ thể với việc chiết xuất Kaempferol:
Kaempferol là hợp chất tương đối phân cực do có nhiều nhóm –OH trong
cấu trúc phân tử, Kaempferol tan tốt trong methanol, ethanol, diethylether,
tan trong dung dịch kiềm, không tan trong cloroform, benzen. Xuất phát từ
đặc điểm này, chúng em đã lựa chọn methanol là dung môi chiết xuất. Khảo
sát các nồng độ khác nhau và pH môi trường (có acid hóa và không acid hóa
dịch chiết nước trước khi chiết bằng ethyl acetat). Kết quả khảo sátcho thấy,
trong tất cả các phương pháp, phương pháp ngâm lạnh bằng MeOH 80%,
acid hóa là phương pháp cho hàm lượng Kaempferol cao nhất. Với nhiều
nhóm –OH trong cấu trúc phân tử, Kaempferol tan khá tốt trong các dung
môi phân cực, tuy nhiên phương pháp ngâm lạnh trong methanol 80% cho
hiệu suất chiết cao nhất có thể là vì với độ cồn cao hơn thì methanol làm
đông vón tế bào thực vật tốt hơn, giúp giải phóng các chất trong tế bào tốt.
Phân lập Kaempferol: Phương pháp phân lập Kaempferol được tiến
hành qua hai giai đoạn, giai đoạn một sử dụng cột silicagel, giai đoạn hai
tiếp tục phân lập trên cột Sephadex LH-20.
Như vậy, chúng em đã thực hiện thành công việc chiết tách