1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
=====***=====
ĐẶNG TRUNG THÀNH
3 LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được đề tài thạc sỹ, cũng như bản thân trưởng thành như ngày
hôm nay, cho tôi xin được gửi lời cảm ơn tới bố mẹ tôi đã sinh thành và dưỡng dục,
động viên giúp đỡ tôi những lúc khó khăn, chia sẻ niềm vui nỗi buồn trong suốt
cuộc đời.
Cho tôi được cảm ơn tới các thầy cô giáo đã dạy dỗ tận tình, trang bị những
kiến thức cần thiết để tôi trưởng thành như ngày hôm nay.
Tôi xin cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm khoa Chế biến, các thành viên trong bộ
môn Công nghệ Chế biến, các thành viên trong khoa Chế biến đã giúp đỡ tôi rất
nhiều trong công việc, giúp tôi hoàn thành đề tài cũng như động viên tinh thần
những lúc khó khăn.
Đặc biệt, tôi xin cảm ơn tới GS.TS. Trần Thị Luyến. Cô không chỉ là người
hướng dẫn thực hiện đề tài cho tôi mà còn hướng cho tôi đi theo con đường nghiên
cứu khoa học tuy gian khổ nhưng cũng có nhiều vinh quang.
Tôi cũng xin cảm ơn tới các bạn cùng học lớp cao học 2004 và bạn bè đã
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CPE: Chế phẩm enzyme chitinase
DC: Dịch chiết
COS: chitoolygosaccharide
Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31
2.1.1.Nguồn thu nhận enzyme chitinase 31
2.1.2. Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo-chitin 31
2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.2.1.Phương pháp thu nhận và bảo quản nguyên liệu thu chitinase: 33
2.2.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn giống khoai lang thích hợp 33
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tình trạng sâu bệnh của cây, vị trí
chiết rút đến hoạt độ chitinase. 34
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định phương pháp tách chiết enzyme chitinase 35
2.2.5. Bố trí thí nghiệm thu nhận chế phẩm enzyme (CPE) 36
2.2.6. Xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương pháp NELSON 38
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ
chitinase DC và CPE. 38
2.2.8. Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của chitinase DC và CPE. 39
2.2.9.Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng chế
phẩm chitinase (CPE). 39
6
2.2.10. Các phương pháp phân tích. 41
2.2.11. Các thiết bị thí nghiệm đã sử dụng. 42
2.2.12. Phương pháp xử lý số liệu 42
Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43
3.1.XÁC ĐỊNH LOẠI KHOAI LANG SỬ DỤNG CHIẾT CHITINASE. 43
3.1.1. Kết quả chọn giống khoai lang sử dụng chiết rút chitinase. 43
3.1.2. Kết quả nghiên cứu hoạt độ chitinase từ các phần khác nhau của cây
khoai lang. 44
3.1.3. Kết quả nghiên cứu tình trạng sâu bệnh của cây ảnh hưởng đến hoạt độ
chitinase 45
Hình 3.8.Ảnh hưởng nồng độ ethanol (%) đến hoạt độ chitinase 52
Hình 3.9. Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hoạt độ CPE. 54
Hình 3.10.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chitinase DC và CPE. 55
Hình 3.11.Độ bền nhiệt của chitinase trong DC và CPE. 57
Hình 3.12.Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chitinase trong DC và CPE. 58
Hình 3.13.Ảnh hưởng của nồng độ CPE và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. . 60
Hình 3.14.Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 62
Hình 3.15.Ảnh hưởng của pH và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 64
Hình 3.16.Ảnh hưởng của nồng độ huyền phù chitin và thời gian đến lượng olygo-
chitin thu được. 65
Hình 3.17.Ảnh hưởng của nồng độ ethanol và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 67
Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thủy phân chitin. 68
Hình 3.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân chitin 69
Hình 3. 20: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thủy phân. 70
Hình 3. 21: Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hiệu suất thủy phân 70
Hình 3.22: Đường chuẩn glucosamine (Phụ lục 2)
8
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học đang có bước phát
triển mạnh mẽ. Nhiều ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống ngày
càng được chú trọng. Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học là một xu thế tất
yếu trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống đang gây ô nhiễm môi trường
nghiêm trọng. Các chế phẩm sản xuất bằng con đường sinh học không chỉ thân
thiện với môi trường sống, mang lại giá trị kinh tế cao mà còn ứng dụng rất hiệu
quả trong nhiều lĩnh vực đời sống. Enzyme là một phần không thể thiếu được của
công nghệ sinh học. Hiện nay, có rất nhiều loại enzyme được nghiên cứu và ứng
dụng của chúng ngày càng được mở rộng. Trước đây các nghiên cứu tập trung
chiết rút chitinase từ lá khoai lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin
để sản xuất olygo-chitin.
Mục đích của luận văn:
Bước đầu nghiên cứu về tính chất của enzyme chitinase từ thực vật (lá khoai
lang), tìm các điều kiện thích hợp để thu nhận enzyme chitinase và sử dụng enzyme
để thủy phân chitin tạo olygo-chitin qua đó mở rộng ứng dụng của chitin và thay thế
phương pháp hóa học sản xuất olygo-chitin gây ô nhiễm môi trường và chất lượng
sản phẩm thấp.
Nội dung nghiên cứu của luận văn:
- Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ lá khoai lang và các yếu tố ảnh
hưởng đến hoạt tính của enzyme này.
- Bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase thủy phân chitin thu olygo-chitin.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận văn:
Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần hiểu biết thêm về enzyme
chitinase từ lá khoai lang nói riêng và chitinase từ thực vật nói chung.
Nghiên cứu đưa ra được các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết rút
enzyme chitinase từ lá khoai lang, các yếu tố ảnh hưởng chitinase và bước đầu
nghiên cứu sử dụng chitinase chiết rút được vào quá trình thủy phân chitin thu chế
phẩm olygo-chitin. Kết quả thu được là cơ sở để đánh giá hiệu quả và khả năng ứng
dụng của chitinase thực vật vào sản xuất olygo-chitin, từ đó cải thiện được chất
lượng và hiệu quả sản phẩm so với phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm.
10
Chương 1
TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
carrageennan, chitin vv… trong khi đó enzyme protease chỉ xúc tác thủy phân cắt
đứt các liên kết peptid mà không xúc tác để cắt được liên kết glucosid.
Do là chất xúc tác đặc biệt, có nhiều ưu việt hơn so với các chất xúc tác khác
nên enzyme đang được nghiên cứu và ứng dụng rất mạnh mẽ trong đời sống con
người.
Enzyme bao gồm hai loại là enzyme một thành phần và enzyme hai thành
phần. Enzyme một thành phần (apoenzyme) là enzyme khi bị thủy phân thì sản
phẩm của quá trình thủy phân chỉ bao gồm các acid amin. Enzym hai thành phần,
phân tử enzyme gồm phần protein (apoenzyme) kết hợp với nhóm khác không phải
protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme. Apoenzyme quyết định tính đặc hiệu cao
của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme. Coenzyme quyết định kiểu
phản ứng mà enzyme xác tác, trực tiếp tham gia phản ứng và làm tăng độ bền của
apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính [6], [8], [32].
Tính chất của enzyme: Bản chất của enzyme là protein nên enzyme không
bền với nhiệt. Dưới tác dụng của nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính mất khả năng
xúc tác. Môi trường acid, kiềm mạnh hay muối kim loại nặng cũng làm mất hoạt
tính của enzyme.
Enzyme có hai dạng biến tính là biến tính thuận nghịch và không thuận
nghịch. Nếu bị biến tính thuận nghịch, enzyme có khả năng phục hồi lại khả năng
xúc tác khi loại bỏ các tác nhân gây biến tính. Khi bị biến tính không thuận nghịch,
enzyme không thể phục hồi lại khả năng xúc tác khi loại bỏ các tác nhân gây biến
tính.
Do có kích thước lớn nên enzyme không đi qua màng bán thấm. Đây cũng là
một tính chất mà người ta sử dụng để tinh sạch enzyme.
Enzyme có tính chất lưỡng tính. Trong môi trường điện ly có thể tồn tại ở
dạng anion, cation hay dạng trung hòa về điện. Người ta lợi dụng tính chất trên để
phân tách cũng như tinh sạch enzyme (phương pháp điện di).
Cũng giống như protein, các enzyme đều có thể hòa tan trong nước, trong
dung dịch muối loãng nhưng không hòa tan trong dung môi không phân cực
histidin, indol của triptophan, guanilic của arginin.
Enzyme hai thành phần, trung tâm hoạt động của enzyme được hình thành
ngoài các nhóm chức của các acid amin còn có sự tham gia của coenzyme. Ví dụ:
vitamin, ion kim loại vv…
Yêu cầu của phản ứng hóa học xảy ra là các chất tham gia phản ứng phải va
chạm với nhau tại vị trí xảy ra phản ứng và các chất trên phải ở trạng thái hoạt động
13
tức là đã được hoạt hóa. Để hoạt hóa các phân tử thì cần cung cấp năng lượng cho
chúng, năng lượng này gọi là năng lượng hoạt hóa.
Các chất xúc tác nói chung đều có khả năng làm giảm năng lượng hoạt hóa
mà phản ứng đòi hỏi bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian.
Qua đó tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng sẽ nhỏ hơn so với trường hợp không
có chất xúc tác. Năng lượng hoạt hóa thường nhỏ đối với xúc tác bằng enzyme và
nhỏ hơn cả trường hợp có các chất xúc tác thông thường.
Ví dụ: Trong phản ứng thủy phân H
2
O
2
tạo thành H
2
O và O
2
nếu không có
xúc tác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, xúc tác là keo platin thì năng lượng
hoạt hóa là 11.7 Kcal/mol trong khi đó sử dụng enzyme catalase thì năng lượng hoạt
hóa chỉ là 5.5 Kcal/mol.
Phương trình phản ứng được biểu diễn như sau:
E + S ES P + E
E : enzyme.
hãm ra khỏi phản ứng hoặc tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme
hoặc làm biến đổi cấu hình không gian của enzyme tạo thuận lợi cho quá trình xúc
tác.
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Vì enzyme có bản chất là protein nên
tất cả các yếu tố làm biến tính protein đều là các yếu tố kìm hãm hoạt động của
enzyme. Ngoài ra còn các yếu tố kìm hãm khác tuy không trực tiếp làm biến tính
protein nhưng có thể thế chỗ cơ chất, kết hợp vào ngay trung tâm hoạt động của
enzyme tạo thành phức chất trung gian (chất kìm hãm cạnh tranh) hoặc kết hợp vào
một vị trí nào đó của enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của enzyme theo
chiều hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác (chất kìm hãm không cạnh tranh).
Có những trường hợp sản phẩm phản ứng hay dư thừa cơ chất cũng làm kìm hãm
phản ứng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp
tới vận tốc phản ứng của enzyme. Nhiệt độ càng tăng thì vận tốc của phản ứng có
xúc tác enzyme càng tăng. Nhưng vì enzyme có bản chất protein nên nhiệt độ chỉ
tăng đến một mức độ giới hạn. Nếu vượt quá giới hạn này thì phản ứng sẽ giảm
hoặc dừng lại do bản thân enzyme bị biến tính. Nhiệt độ mà ở đó tốc độ phản ứng
đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích.
15
Nhiệt độ tới hạn là nhiệt độ làm mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác của enzyme.
Nhiệt độ tối thích của các enzyme không giống nhau, phụ thuộc vào nguồn gốc của
enzyme từ thực vật, động vật hay vi sinh vật. Nhiệt độ tối thích của enzyme không
phải là hằng số mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như:cơ chất, pH môi
trường, nồng độ enzyme, nguồn enzyme. Khi thời gian tác dụng của enzyme càng
dài thì nhiệt độ tối thích càng giảm.
Ảnh hưởng của pH: Mỗi loại enzyme sẽ có hoạt tính cao nhất ở một pH xác
định gọi là pH tối thích của enzyme. pH ảnh hưởng tới hoạt tính xác tác của enzyme
có thể do nó làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức trong trung tâm
hoạt động của enzyme, có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của
nước cất, các dung dịch đệm, dung dịch muối sinh lý vv…
Dịch chiết chứa không chỉ có enzyme mà còn có các protein tạp và các tạp
chất khác. Để tách các tạp chất làm tăng độ sạch, tinh khiết của enzyme phải sử
dụng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Đối với muối, các tạp chất có phân tử
lượng thấp thường dùng biện pháp thẩm tích hoặc lọc qua cột gel sephadex. Để loại
các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao thường dùng kết hợp nhiều biện
pháp khác nhau : Phương pháp biến tính chọn lọc dưới tác dụng của nhiệt độ hay
pH môi trường: phương pháp này thích hợp đối với loại enzyme có tính bền nhiệt
hoặc bền acid. Giữ dịch chứa enzyme ở nhiệt độ cao 50 – 70
0
C hoặc pH = 5 trong
thời gian xác định các protein tạp bị biến tính và được loại bỏ bằng lọc hay ly tâm.
Kết tủa phân đoạn enzyme bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ
thích hợp đối với các loại enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi, muối trung tính.
Khi đó các protein tạp sẽ bị biến tính và được tách ra khỏi dịch chứa enzyme. Ngoài
ra còn có các phương pháp khác như: Phương pháp sắc ký, điện di hay lọc gel.vv…
Một số yếu tố gây biến tính enzyme như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc,
muối kim loại nặng thường làm mất hoạt tính xúc tác của enzyme, do đó người ta
thường dùng các yếu tố này để ức chế hoạt độ của enzyme khi cần thiết [2], [6], [8],
[24], [32].
Ứng dụng của enzyme: Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực của cuộc sống. Có thể chia ứng dụng của enzyme thành hai hướng chính.
Hướng thứ nhất: điều hòa định hướng tác dụng của enzyme ngay trong bản thân
nguyên liệu có chứa nó. Hướng sử dụng này không phổ biến vì chỉ sử dụng được
khi bản thân nguyên liệu có tồn tại enzyme. Hướng thứ hai là: tách chiết enzyme ra
khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
17
sản xuất. Hướng này có ưu điểm là chủ động được nguồn enzyme, có thể dễ dàng
điều khiển được hoạt động của nó theo các mục đích khác nhau của quá trình sản
chitin vì trong thực vật không chứa chitin. Các tác giả nghiên cứu về chitinase trong
thực vật tin rằng chitinase đóng vai trò là chất kháng thể của thực vật và sự tồn tại
của chúng trong thực vật có thể giải thích đó là sự phản ứng trở lại của cơ thể thực
vật trước sự tấn công của các loài như côn trùng, động vật gây hại hay vi sinh vật
gây bệnh [36], [44], [69], [82].
18
Cũng giống như các enzyme khác, hoạt độ của chitinase phụ thuộc vào các
yếu tố như: nguồn thu nhận enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ chitinase,
nồng độ chitin, loại chitin, thời gian thủy phân, các chất hoạt hóa, các chất kìm hãm
vv…
Tùy theo nguồn thu chitinase, các chitinase có hoạt độ khác nhau. Chitinase
thu được từ vi sinh vật thường có hoạt độ cao hơn so với chitinase từ động thực vật.
Ngoài ra, có thể điều chỉnh khả năng sinh tổng hợp chitinase của vi sinh vật bằng
cách chọn chủng thích hợp, hoặc điều chỉnh môi trường nuôi cấy. Tùy theo các
dạng dẫn xuất của chitin khác nhau cũng ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase. Mỗi loại
chitinase từ các nguồn khác nhau thích hợp xúc tác thủy phân cơ chất chitin khác
nhau. Chitinase có thể thích hợp xúc tác thủy phân các loại cơ chất khác nhau của
chitin như glycol-chitin, colloidal-chitin, swollen-chitin vv…
Nguồn và phương pháp thu nhận enzyme chitinase: Có nhiều nguồn thu
nhận enzyme chitinase. Enzyme chitinase có thể tồn tại trong thực vật, động vật và
vi sinh vật. Từ các nguồn ở trên, các enzyme chitinase sẽ được tách ra và tinh sạch
theo các phương pháp thích hợp.
Chitinase thu từ thực vật: Trong thực vật đã có những nghiên cứu và phát
hiện sự tồn tại của chúng ở một số loại cây như cây đậu Hà Lan, đỗ ván, cải bắp,
khoai lang, khoai tây, khoai mỡ, trong cây lúa, cây thuốc lá, cây lúa mỳ, lúa mạch
vv… [36], [37], [44], [70], [74]….
Chitinase thu từ động vật: Chitinase có tồn tại trong cơ thể một số động
vật. Các nhà khoa học đã nghiên cứu tách chiết và làm sạch chitinase thu được từ
gan mực ống Nhật Bản (squid Todarodes pacificus). Chitinase còn thu được từ
Khoai lang có khối lượng đường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng
lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước, sắn. Khoai lang được sử dụng củ và lá để
làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần đây đang được nghiên
cứu để làm màng phủ sinh học (bioplastic). Tuỳ theo nhu cầu thị trường mà phân
loại củ để chế biến và tiêu thụ phù hợp: củ lớn và củ vừa được dùng để bán tươi và
chế biến thực phẩm, củ nhỏ và dây lá dùng cho chăn nuôi, lá của một số giống
khoai lang chọn lọc hiện được ưa chuộng để làm rau xanh và làm nước sinh tố.
Bảng 1: Một số thành phần trong lá khoai lang trong 100 g lá.
Thành phần
Lá khoai
Năng
lượng (cal)
Protein
(%)
Ca
(mg)
K (mg) Vit A
(mg)
Vit C
(mg)
Lá tươi 53 2,8 107 562 5565 32
20
Lá luộc / 2,6 94 / 3345 5
Nguồn : food composition table.1964. Manila.
Tại Việt Nam, khoai lang là cây lương thực ngắn ngày quan trọng, thường
được trồng với các loại hoa màu khác xen giữa hai vụ lúa chính. Miền Bắc khoai
lang đứng thứ 3 về diện tích canh tác sau lúa và ngô, ở miền Nam nó đứng thứ tư
sau lúa, cao su và dừa. Miền Bắc, khoai lang được trồng nhiều nhất ở các tỉnh Nghệ
của củ trung bình, độ ngọt khá.
Giống khoai lang VX-37: Giống khoai có thân tím, đốt ngắn, phân nhánh
nhiều, lá xanh, gân lá tím, lá xẻ thùy nông. Củ màu hồng nhạt, ruột vàng nhạt, bở,
ăn ngon. Củ hình thành sớm 15-20 ngày sau trồng, tích lũy nhanh, thời gian sinh
trưởng ngắn ngày 90 ngày thích hợp với vụ thu đông và đông sớm. Khả năng chịu
nóng khá, chịu rét kém.
Giống khoai lang HL4: Giống có thân chính dài, màu xanh. Lá xanh thẫm,
phân thùy 3-5 khía nông, gân lá màu xanh. Vỏ củ màu đỏ, ruột màu cam đậm.
Giống khoai lang 143: Giống khoai sinh trưởng mạnh, thân lá phát triển
sớm, năng suất chất xanh cao. Thân màu xanh sẫm, lá to hình tim, phiến lá mỏng,
dây dài phân nhánh ít.Củ màu hồng nhạt, ruột vàng, dạng củ thuôn dài, ăn ngon, bở.
Khả năng chịu rét khá, tỷ lệ của thương phẩm cao.
Giống khoai lang KL5: Giống khoai sinh trưởng thân lá mạnh, khả năng tái
sinh nhanh. Thân lá mềm ngọt, thích hợp làm thức ăn gia súc. Lá xẻ thùy sâu. Củ to
thuôn dài, vỏ đỏ tươi, ruột củ màu vàng, chất lượng khá.
Giống khoai lang KL1: Giống khoai có lá to hình tim, màu xanh hơi vàng,
cuống lá dài. Dạng củ thuôn dài, vỏ và ruột củ màu vàng, ăn ngon và bở.
Thu hoạch: Đối với các giống khoai lang phổ biến hiện nay thường thu
hoạch sau 90-100 ngày ở mùa mưa, sau 85-95 ngày ở mùa khô.
1.1.4. Giới thiệu về chitin và một số dẫn xuất của chitin
Chitin là một polysaccarit có đạm với khối lượng phân tử lớn. Chitin là
polymer hữu cơ có trữ lượng lớn, đứng thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose và
chúng được tạo ra trung bình 20g/năm/m
2
trên bề mặt trái đất. Chitin hiếm khi tồn
tại ở trạng thái tự do mà hầu hết ở trạng thái liên kết với protein, canxi cacbonat và
các hợp chất hữu cơ khác. Ví dụ chitin tồn tại ở dạng liên kết với canxi tạo thành
lớp vỏ cứng của loài vỏ giáp xác, hay côn trùng [20].
22
NHCOCH
0
3
CH OH
2
H
H
H
H
H
OH
NHCOCH
0
0
0
3
CH OH
2
H
H
H
H
H
OH
NHCOCH
n
Tính chất của chitin: Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong
kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ khác như: ete, rượu…
Chitin hòa tan trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối Thioxianat Liti
glucosid, tiếp theo là sự loại bỏ nhóm acetyl [20], [23], [35].
23
Ứng dụng của chitin: Do tính chất của chitin không hòa tan trong nước vì
vậy ứng dụng chitin có phần bị hạn chế hơn so với các dẫn xuất của nó.
Chitin được sử dụng để sản xuất da nhân tạo, sản xuất băng, gạc y tế điều trị
các vết thương, đặc biệt rất hiệu quả đối với các bệnh nhân bị bỏng. Chitin cũng
được sử dụng để sản xuất chỉ khâu tự tiêu trong phẫu thuật, ứng dụng trong xử lý
nước thải do khả năng hấp thu một số kim loại nặng, ứng dụng trong công nghệ sinh
học, công nghệ nano, nông nghiệp, trong công nghiệp, mỹ phẩm vv…
Từ chitin có thể tạo ra rất nhiều loại dẫn xuất bằng các phương pháp khác
nhau. Mỗi dẫn xuất đều có các tính chất khác nhau, vì vậy việc tạo ra ngày càng
nhiều các dẫn xuất sẽ tạo ra nhiều tính chất mới và ứng dụng của chitin ngày càng
được mở rộng. Từ chitin có thể tạo rất nhiều dẫn xuất khác nhau với nhiều tính chất
và ứng dụng mới. Dưới đây là một số dẫn xuất của chitin:
Carboxymethylchitin, Colloidal
chitin, Regenerated chitin, Glycol chitin (O-
hydroxyethylated
chitin ), Ethylene glycol chitin, Flake (bông, tuyết) chitin, Swollen
chitin, N-acetyl-beta-D-glucosamine, chitobiose (GlcN
2
), chitotriose (GlcN
3
),
chitotetraose(GlcN
4
),
Phương pháp sản xuất chitin và các dẫn xuất của chitin: Trong thực tế,
nguồn chitin tồn tại trong côn trùng, các loài giun, trong loài giáp xác. Chitin cũng
có thể được sinh tổng hợp từ vi sinh vật. Tại Việt Nam, phế thải từ ngành chế biến
thủy sản như vỏ tôm, cua và mực là nguồn chính để sản xuất chitin và các dẫn xuất
từ chitin.
Trong thành phần nguyên liệu để sản xuất chitin như vỏ tôm, cua không chỉ
chứa chitin mà còn các thành phần khác như protein, sắc tố, và khoáng… vì vậy để
thu được chitin phải tiến hành tác các tạp chất đó ra khỏi nguyên liệu.
Tách tạp chất là chất khoáng: Sử dụng acid để tách khoáng, trong thành phần
cấu tạo của vỏ tôm cua khoáng chiếm một lượng rất lớn, chủ yếu ở dạng CaCO
3
,
Ca
3
PO
4
… có thể sử dụng các acid mạnh để tách khoáng như acid clohydric, acid
sunfuric. Dùng acid clohydric tốt hơn vì muối có gốc clorua luôn ở dạng hòa tan
nên khoáng dễ hòa tan, tách ra và được rửa trôi.
Tách protein: sử dụng kiềm loãng (5%) để thủy phân protein còn trong
nguyên liệu. Sử dụng kiềm để tách protein ra khỏi nguyên liệu ít nhiều cũng ảnh
hưởng đến chất lượng của chitin thu được. Để tránh ảnh hưởng của môi trường
kiềm đến mạch polymer của chitin có thể thay thế bằng các chế phẩm protease để
tách protein. Phản ứng thủy phân diễn ra nhẹ nhàng, ít ảnh hưởng đến mạch
polymer của chitin, chitin thu được có chất lượng tốt hơn [20], [21], [22].
Có rất nhiều dẫn xuất của chitin trong đó chitosan là dẫn xuất được sản xuất
và ứng dụng nhiều nhất hiện nay:
Sản xuất chitosan từ chitin: người ta sản xuất chitosan bằng cách loại bỏ
nhóm acetyl trong mạch polymer của chitin. Có thể dùng môi trường kiềm đặc để
25
nhau. Hoạt độ của chitinase giảm dần khi chiết từ các bộ phận từ cây theo thứ tự lá,
chồi (búp), cuống lá, củ. Trong cùng điều kiện thí nghiệm, hoạt độ chitinase từ lá
cao hơn dây khoai. Hoạt độ chitinase từ các lá khoai bị côn trùng cắn sẽ có hoạt độ
cao hơn so với các lá còn nguyên vẹn. Hoạt độ chitinase từ dây khoai có lá bị côn
trùng cắn cũng cao hơn so với dây khoai có lá còn nguyên vẹn. Khối lượng phân tử
enzyme chitinse của lá và chồi của cây khoai lang khoảng 16 kDa mặc dù khối
lượng của hầu hết các chitinase từ thực vật khoảng 30kDa (Boller et al., 1983;
Chang et al., 1992; Molanol et al., 1979; Vad et al., 1991; Wadsworth and Zikakis
Copyright: Tài liệu đại học ©