ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Phƣơng Hà
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CLORAMPHENICOL TRONG
DƢỢC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE SỬ DỤNG
ĐIỆN CỰC GIỌT THỦY NGÂN TREO

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

1.1.
Giới thiệu chung
2
1.1.1.
Giới thiệu về kháng sinh
2
1.1.2.
Giới thiệu về cloramphenicol
3
1.1.2.1.
Giới thiệu chung
3
1.1.2.2.
Tính chất hóa lý
4
1.1.2.3.
Dƣợc lý và cơ chế tác dụng
6
1.1.2.4.
Sản xuất
10
1.2.
Giới thiệu về phƣơng pháp von-ampe
10
1.2.1.
Giới thiệu chung
10
1.2.2.
Các cực làm việc thƣờng dùng trong phƣơng pháp von-ampe
11

1.3.3.1
Cực phổ xung vi phân
19
1.3.3.2.
Cực phổ sóng vuông
20
1.3.3.3.
Phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng đầu dò vi sợi cacbon
20
1.3.4.
Một số phƣơng pháp khác
21
Chƣơng 2:
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
22
2.1.
Nội dung nghiên cứu
22
2.2.
Phƣơng pháp nghiên cứu
23
2.2.1.
Tiến hành thí nghiệm theo phƣơng pháp von-ampe xung vi phân
23
2.2.2.
Ghi đƣờng von-ampe
23
2.2.3.
Các yếu tố đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
23

35
3.5.
Khảo sát ảnh hƣởng của oxi
38
3.6.
Khảo sát ảnh hƣởng của các chất hữu cơ
40
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

3
3.6.1.
Ảnh hƣởng của axit oxalic
40
3.6.2.
Ảnh hƣởng của axit citric
41
2.6.3.
Ảnh hƣởng của glucozơ
42
3.7.
Ảnh hƣởng của các ion vô cơ
43
3.7.1.
Ảnh hƣởng của ion Na
+
(K
+
)
43
3.7.2.

51
3.11.3.2.
Mẫu thuốc viên 250mg
53
3.11.3.3.
Mẫu thuốc tiêm
54
2.12.
So sánh kết quả đối chứng
55
KẾT LUẬN
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
58
„
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

4
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:
Cấu trúc hóa học của cloramphenicol
3
Hình 1.2:
(a) Sự biến thiên thế thời gian, (b) Dạng đƣờng von-ampe
trong kỹ thuật von-ampe xung vi phân
14
Hình 1.3:
(a) Sự biến thiên thế thời gian, (b) Dạng đƣờng von-ampe
trong kỹ thuật von-ampe sóng vuông

Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt
của axit oxalic tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
40
Hình 3.8:
Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt
của axit citric tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
40
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

5
Hình 3.9:
Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt
của glucozơ tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
42
Hình 3.10:
Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt
của ion Na
+
tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
43
Hình 3.11:
Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt
của ion Ca
2+
tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
44
HÌnh 3.12:
Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt
của ion Fe
3+

Các tính chất vật lý và hóa học của cloramphenicol
5
Bảng 3.1:
Giá trị E
p
và I
p
của cloramphenicol 2,5ppm trong một số
nền khác nhau
31
Bảng 3.2:
Ảnh hƣởng của pH đến chiều cao pic cloramphenicol trong
nền đệm axetat
33
Bảng 3.3:
Giá trị I
p
của cloramphenicol trong các nồng độ nền đệm
axetat pH 5,5 khác nhau
35
Bảng 3.4:
Giá trị I
pa
và I
pc
thay đổi theo tốc độ quét
36
Bảng 3.5:
Ảnh hƣởng của thời gian xục khí N
2

của cloramphenicol trong sự có mặt của ion Ca
2+

tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
44
Bảng 3.11:
Giá trị I
p
của cloramphenicol trong sự có mặt của ion Fe
3+

tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
45
Bảng 3.12:
Giá trị I
p
của cloramphenicol tại 11 mức nồng độ
45
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

7
Bảng 3.13:
Giá trị b‟ trong kiểm tra các hệ số của phƣơng trình hồi quy
47
Bảng 3.14:
Các giá trị liên quan đến hệ số b‟
47
Bảng 3.15:
Các giá trị dùng để khảo sát độ đúng của hệ số a
47

Giá trị I
p
của cloramphenicol trong mẫu thuốc viên nén và
các giá trị thêm chuẩn
53
Bảng 3.24:
Giá trị hàm lƣợng cloramphenicol trong mẫu thuốc viên nén
54
Bảng 3.25
Giá trị I
p
của cloramphenicol trong mẫu thuốc tiêm và các
giá trị thêm chuẩn
54
Bảng 3.26:
Giá trị hàm lƣợng cloramphenicol trong mẫu thuốc tiêm
55
Bảng 3.27:
Tổng hợp so sánh kết quả phân tích mẫu
56 1
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cuộc sống hiện đại đòi hỏi con ngƣời phải lao động ở cƣờng độ
cao. Thêm vào đó, môi trƣờng sống ô nhiễm là một trong những nguyên nhân khiến
tỉ lệ mắc các bệnh do nấm và khuẩn ở ngƣời ngày càng tăng. Việc nghiên cứu thuốc
chữa trị các loại bệnh này rất đƣợc quan tâm chú ý. Kháng sinh là chất có khả năng
ức chế hoặc tiêu diệt một số loài nấm, vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và sinh vật. Vì
vậy các loại thuốc kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và nâng cao

tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học. [8]
 Phân loại:
Hiện có khoảng hơn 12000 chủng loại kháng sinh khác nhau [8], chúng đƣợc chia
thành 10 nhóm chính [29]
- Nhóm phenicol: cloramphenicol, Thiaphenicol, Florphenicol, Florfenicol amin…
- Nhóm sulfonamide: Sulfadimethoxine, Sulfamethoxipyridine, Sulfamoxole,
Sulfisoxazole, Sulfixomidine, Sulfamethazine, Sulfamethoxazole…
- Nhóm β-lactam: Peneciline, Amoxilline, Cloxacilline, Penicilline G,
Cephalosporin, Cètazidime…
- Nhóm quinolone: Nalidixic acid, Danofloxacin, oxonilic acid, Ciprofloxacin,
Norfloxacine…N
- Nhóm Tetracyline: Tetracyline, Oxy Tetracyline, Clortetracyline…
- Nhóm amino Glycoside: Gentamicin, Gentamicin C, Spectinomycin, Hygromycin
B, Treptomicin, Dihydrotreptomicin…
- Nhóm ionorphore polyether: Semduramicin, Monensin, Salinomycine, Narasine…
- Nhóm Macrolide: Erythromycine A, Cladonose, Spiramicin, Neospiramycin,
Tylosine…
- Nhóm Nitrofuran: Furazolidone, Nitrofurazone, Furaltadone,…
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

3
- Nhóm Miscellaneous: N-acylamico dilactone, 4-butyrolactiones, Antimycin A…
1.1.2. Giới thiệu về cloramphenicol
1.1.2.1. Giới thiệu chung [1,2,11,12,13]
Cloramphenicol là kháng sinh thuộc nhóm phenicol, ban đầu đƣợc phân lập
từ Streptomyces venezuelae vào năm 1947, nay đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp
tổng hợp. Cloramphenicol thƣờng có tác dụng kìm khuẩn, nhƣng có thể diệt khuẩn
ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao. Tên quốc tế của
cloramphenicol là
2,2-dichloro-N-[1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide.

thƣờng ở dạng bột mịn màu trắng xám, trắng hoặc vàng trắng, với nhiệt độ nóng
chảy vào khoảng 150,5
o
C đến 151.5
o
C. Nó thăng hoa trong chân không cao và nhạy
cảm với ánh sáng. Các nhóm nitro là dễ dàng khử thành các nhóm amin. Tính chất
điện hóa của cloramphenicol đƣợc thể hiện một cách rõ ràng ở vị trí cấu trúc này:
→
Trong 4 chất đồng phân lập thể, chỉ có dạng αR, βR (hay còn gọi là dạng D)
là có hoạt tính (IARC 1990). Các thuộc tính vật lý và hóa học của cloramphenicol
đƣợc liệt kê trong Bảng 1.1.[13] Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

5
Bảng 1.1: Các tính chất vật lý và hóa học của cloramphenicol
Tính chất
Thông tin
Tài liệu tham khảo
Khối lƣợng phân
tử
323,1322 g/mol
Budavari et al. 1996, Chemfinder
2000
Màu sắc
Trắng xám hoặc trắng
vàng
Budavari et al. 1996, CRC 1998,

HSDB 1995
Tính tan
Nƣớc 25
o
C
Propylen
glycol
50% acetamit
Clorofom
Methanol

Tan ít, 2,5 mg/mL
150,8 mg/mL
5%
Tan
Tan tốt
Tan tốt

Chemfinder 2000, HSDB 1995
HSDB 1995
HSDB 1995
HSDB 1995
HSDB 1995
HSDB 1995
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

6
Etanol
Butanol
Etyl acetat

polymyxin, gentamicin, amphoterricin. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm
cho các phân tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài.
• Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein.
- Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm
cho quá trình dịch mã không chính xác.
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

7
- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.
- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm
ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
• Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic.
- Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao
mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)
- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai
mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của
DNA.
- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzonic acid) có tác
dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid.
- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic.
Đối với Cloramphenicol, cơ chế kháng khuẩn đƣợc cụ thể hóa qua việc ức
chế sinh tổng hợp protein ở những vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn vào tiểu thể
50S của ribosom. Thuốc có cùng vị trí tác dụng với erythromycin, clindamycin,
lincomycin, oleandomycin và troleandomycin.
Cloramphenicol cũng ức chế tổng hợp protein ở những tế bào tăng sinh
nhanh của động vật có vú. Cloramphenicol có thể gây ức chế tủy xƣơng và có thể
không hồi phục đƣợc. Cloramphenicol có hoạt tính ức chế miễn dịch nếu cho dùng
toàn thân trƣớc khi kháng nguyên kích thích cơ thể. Tuy vậy, đáp ứng kháng thể có

thải của thận. Khi tiêm tĩnh mạch liều 1 g cloramphenicol natri sucinat cho ngƣời
lớn khoẻ mạnh, nồng độ cloramphenicol trong huyết tƣơng xê dịch trong khoảng
4,9 - 12 microgam/ml sau 1 giờ, và 0 - 5,9 microgam/ml sau 4 giờ.
Sau khi dùng tại chỗ ở mắt, cloramphenicol đƣợc hấp thu vào thủy dịch.
Những nghiên cứu ở ngƣời bệnh đục thể thủy tinh cho thấy mức độ hấp thu thay đổi
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

9
theo dạng thuốc và số lần dùng thuốc. Nồng độ thuốc trong thủy dịch cao nhất khi
dùng thuốc mỡ tra mắt cloramphenicol nhiều lần trong ngày.
Cloramphenicol phân bố rộng khắp trong phần lớn mô cơ thể và dịch, kể cả
nƣớc bọt, dịch cổ trƣớng, dịch màng phổi, hoạt dịch, thủy dịch và dịch kính. Nồng
độ thuốc cao nhất trong gan và thận. Nồng độ trong dịch não - tủy bằng 21 - 50%
nồng độ trong huyết tƣơng ở ngƣời bệnh không bị viêm màng não và bằng 45 - 89%
ở ngƣời bệnh bị viêm màng não. Cloramphenicol gắn kết khoảng 60% với protein
huyết tƣơng.
Nửa đời huyết tƣơng của cloramphenicol ở ngƣời lớn có chức năng gan và
thận bình thƣờng là 1,5 - 4,1 giờ. Vì trẻ đẻ non và trẻ sơ sinh có cơ chế liên hợp
glucuronid và thải trừ thận chƣa trƣởng thành, nên những liều cloramphenicol
thƣờng dùng thích hợp với trẻ lớn lại có thể gây nồng độ thuốc trong huyết tƣơng
quá cao và kéo dài ở trẻ sơ sinh. Nửa đời huyết tƣơng là 24 giờ hoặc dài hơn ở trẻ
nhỏ 1 - 2 ngày tuổi, và khoảng 10 giờ ở trẻ nhỏ 10 - 16 ngày tuổi. Nửa đời huyết
tƣơng của cloramphenicol kéo dài ở ngƣời bệnh có chức năng gan suy giảm. Ở
ngƣời bệnh có chức năng thận suy giảm, nửa đời huyết tƣơng của cloramphenicol
kéo dài không đáng kể.
Cloramphenicol bị khử hoạt chủ yếu ở gan do glucuronyl transferase. Ở
ngƣời lớn có chức năng gan và thận bình thƣờng, khoảng 68 - 99% một liều uống
cloramphenicol thải trừ trong nƣớc tiểu trong 3 ngày; 5 - 15% liều này thải trừ dƣới
dạng không đổi trong nƣớc tiểu qua lọc cầu thận và phần còn lại thải trừ qua ống
thận, dƣới dạng những chất chuyển hóa không hoạt tính. ở ngƣời lớn có chức năng

+ Cực so sánh: là cực có thế không đổi thƣờng là cực calomen hoặc cực bạc
clorua có bề mặt lớn
+ Cực phù trợ glassy carbon hoặc Pt
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

11
Nắp bình điện phân còn có một lỗ để dẫn một luồng khí trơ vào với mục
đích để đuổi khí oxy hoà tan trong dung dịch ra khỏi bình điện phân. Để vẽ đƣợc
đƣờng phân cực ngƣời ta liên tục theo dõi và đo cƣờng độ dòng điện chạy qua mạch
khi tăng dần điện thế đặt vào hai cực của bình điện phân, sau đó vẽ đồ thị biễu diễn
sự phụ thuộc của I–E, trong đó I là cƣờng độ dòng điện chạy qua mạch, E là điện
thế đặt vào hai cực của bình điện phân. Ta sẽ đƣợc một đƣờng cong đó chính là
đƣờng cong von-ampe hoà tan.
1.2.2. Các cực làm việc thường dùng trong phương pháp von-ampe
a. Cực giọt thủy ngân treo (HMDE)
Cực HMDE là loại cực đƣợc dùng phổ biến nhất trong phƣơng pháp von-
ampe. Nó là một giọt thủy ngân hình cầu kích thƣớc nhỏ đƣợc treo trên đầu cuối của
một mao quản có đƣờng kính trong 0,15 † 0,50 mm. Sau mỗi phép đo, giọt thủy
ngân bị cƣỡng bức rơi ra khỏi mao quản và nó đƣợc thay thế bằng một giọt mới
tƣơng tự. Một kiểu cực giống với cực HMDE cũng thƣờng đƣợc dùng là cực giọt
thủy ngân tĩnh (SMDE) do hãng PAR (USA) chế tạo. Cực HMDE và SMDE cho
kết quả đo có độ chính xác và độ lặp lại cao, có quá thế với hidro lớn khoảng -1,5 V
trong môi trƣờng kiềm và trung tính, -1,2 V trong môi trƣờng axit, nên các cực này
có khoảng điện hoạt rộng, do đó cho phép chúng ta nghiên cứu đƣợc các chất trong
một khoảng thế rộng. Chúng đƣợc dùng rộng rãi để xác định hàng chục kim loại và
á kim nhƣ Cd, Cu, Pb, Zn, In, Bi, Sb, Se, các halogenua,… và nhiều hợp chất hữu
cơ theo phƣơng pháp ASV hoặc CSV. Điểm hạn chế của cực HMDE và SMDE là
khó chế tạo, vì rất khó tạo ra các giọt thủy ngân có kích thƣớc lặp lại một cách hoàn
hảo. Ngoài ra, chúng không cho phép xác định các kim loại có thế hòa tan dƣơng
hơn nhƣ Au, Ag,…

hợp chất “gian kim loại” (intetmetallic) dễ dàng hình thành trên nó khi phân tích các
kim loại theo phƣơng pháp ASV và do đó, có thể làm biến dạng tín hiệu von-ampe
hào tan và gây sai số, trong khi đó cực HMDE và SMDE lại khắc phục đƣợc điều
này. Mặt khác, độ hồi phục của các phép đo khi đi từ cực MFE này đến cực MFE
khác thƣờng kém hơn so với cực HMDE và SMDE.
Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

13
c. Cực đĩa rắn
Cả cực HMDE và MFE đều không cho phép xác định các kim loại có thế
oxy hóa–khử tƣơng đối dƣơng nhƣ Ag, Au,… hoặc các kim loại không tan trong
thủy ngân nhƣ As, Mn, Nhƣng các kim loại đó lại có thể xác định đƣợc trên các
cực rắn đĩa. Cực rắn đĩa là một mặt phẳng tròn (hình đĩa) có đƣờng kính khoảng 2 †
4 mm và đƣợc làm bằng các kim loại vật liệu trơ nhƣ than thủy tinh (glassy carbon),
than nhão (paste carbon), graphit, graphit ngâm tẩm (wax-impregnated graphite),
Các cực rắn đĩa thƣờng dùng để xác định các kim loại khác nhƣ Ag, Au, Hg theo
phƣơng pháp ASV và phân tích một số kim loại khác nhƣ Mn, Co, Ce, Sb, As,…
theo phƣơng pháp CSV. Cực rắn đĩa có nhƣợc điểm là các hợp chất “gian kim loại”
dễ hình thành trên nó và cực dễ bị biến đổi do các kim loại, oxit kim loại,… kết tủa
trên bề mặt cực và do đó, kết quả của phép đo trƣớc ảnh hƣởng đến phép đo sau,
dẫn đến làm giảm độ lặp lại hoặc gây sai số.
1.2.3. Các kỹ thuật ghi đường von-ampe
Trong phƣơng pháp SV, để ghi đƣờng von-ampe, ngƣời ta có thể dùng các
kỹ thuật khác nhau nhƣ von-ampe xung vi phân, von-ampe sóng vuông,… Khi đó,
một cách tƣơng ứng, phƣơng pháp von-ampe cũng đƣợc gắn thêm tên của các kỹ
thuật đó nhƣ: von-ampe xung vi phân, von-ampe sóng vuông,… Dƣới đây sẽ giới
thiệu nguyên tắc của một số kỹ thuật von-ampe thƣờng dùng trong phƣơng pháp
von-ampe.
1.2.3.1. Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (Differential Pulse Voltametry)
Kỹ thuật von-ampe xung vi phân là một trong những kỹ thuật đƣợc dùng phổ

; ở đây t là thời gian, R là điện trở, C* là điện
dung vi phân của lớp kép. Theo cách ghi dòng nhƣ trên, dòng tụ điện ghi đƣợc trƣớc
lúc nạp xung và trƣớc lúc ngắt xung là gần nhƣ nhau và do đó, hiệu số dòng ghi
đƣợc chủ yếu là dòng Faraday. Nhƣ vậy, kỹ thuật von-ampe xung vi phân cho phép
loại trừ tối đa ảnh hƣởng của dòng tụ điện [14].

Error!
Hình 1.2. (a). Sự biến thiên thế thời gian,
(b). Dạng đường von-ampe trong kỹ thuật von-ampe xung vi phân:
Pulse amplitude - Biên độ xung Voltage step - Bƣớc thế
Start potential - Thế bắt đầu Voltage step time - Thời gian mỗi bƣớc thế
Pulse time - Bề rộng xung Peak height - Chiều cao pic
Peak voltage - Thế đỉnh pic
Lund và Onshus đã đƣa ra phƣơng trình dòng đỉnh hòa tan xung vi phân (khi
phân tích theo phƣơng pháp ASV) trên cực HMDE nhƣ sau:
I
p
= k. n
2
. r. ∆E.ω1/2 . t
dp

thời điểm: thời điểm 1 (dòng dƣơng I
1
) và thời điểm 2 (dòng âm I
2
). Dòng thu đƣợc
là hiệu của hai giá trị dòng đo (I = I
1
- I
2
) và I đƣợc ghi là hàm của thế đặt lên cực
làm việc. Theo cách ghi dòng nhƣ vậy, kỹ thuật này loại trừ đƣợc tối đa ảnh hƣởng
của dòng tụ điện.
Trong một số trƣờng hợp, kỹ thuật von-ampe sóng vuông có độ nhạy cao
hơn so với kỹ thuật von-ampe xung vi phân, nhƣng về GHPH, nói chung là tƣơng
đƣơng nhau.

Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

16 Hình 1.3. (a) Sự biến thiên thế thời gian
(b) Dạng đường von-ampe trong kỹ thuật von-ampe sóng vuông:
Start potential - thế bắt đầu Peak height - chiều cao pic