Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

MỞ ĐẦU
Sự khám phá ra vitamin là một trong những thành tựu lớn của hoá sinh.
Vitamin là một nhóm các hợp chất hoá học có mặt trong hầu hết các loại
thực phẩm, được phân loại làm hai nhóm chính: vitamin tan trong dầu và
vitamin tan trong nước. Mặc dù, các vitamin không cung cấp năng lượng
nhưng chúng rất cần thiết cho các hoạt động sống của con người. Vitamin
thúc đẩy quá trình trao đổi chất và là thành phần không thể thiếu được trong
cấu tạo của nhiều loại enzyme. Do đó vitamin đóng vai trò như những chất
xúc tác.Trong các loại vitamin thì vitamin B
2
(Riboflavin) giữ vai trò quan
trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể. Vitamin B
2
có nhiều trong các sản
phẩm từ sữa, men bia, thịt, gan, trứng, rau xanh và các sản phẩm từ cá.
Các phương pháp định lượng vitamin B
2
hầu hết chỉ tiến hành bằng
phương pháp hóa học, vì phương pháp sinh học phụ thuộc một cách đáng kể
vào tính chất của động vật và tương đối ít chính xác. Trong các phương pháp
lý học có thể dùng chủ yếu là phương pháp quang phổ trong vùng tia tím tử
ngoại và phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B
2
.
Xuất phát từ những vấn đề trên và được sự phân công của giáo viên
hướng dẫn, em đã tiến hành tìm hiểu “ Phương pháp xác định hàm lượng
vitamin B2 trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang”.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
1


1.2.1. Lịch sử
Vitamin B2 được khám phá vào năm 1920 và lần đầu tiên vitamin B2
được tách từ trứng vào năm 1933. Lúc đầu, nó có tên là ovoflavin, sau đó
được các nhà khoa học Booher, Elliger, Koschara tách được viboflavin từ
casein. Vì vậy nó mang tên là lactoflavin. Tới năm 1935 Karrer và các cộng
tác viên đã tổng hợp được hàng loạt các dẫn xuất có cấu tạo 6,7 dimetyl-9-
isoaloxazin tương ứng đúng với lactoflavin tách được từ các nguyên liệu
thiên nhiên.
1.2.2. Cấu tạo và tính chất
1.2.2.1. Cấu tạo
Trong cấu tạo của vitamin B2, có 2 phần tách biệt : một hợp chất
đường Ribose và một công thức 3 vòng nhân.
Công thức thô của riboflavin : C
17
H
20
N
4
O
6

Tên khoa học là : 6,7 di metyl-9-isoaloxazin
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
3
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.2.2.2. Tính chất
- Phân tử khối : 367,4
- Nhiệt độ nóng chảy : 274-282

4
, TiCl khử nó một cách thuận
nghịch thành hợp chất leuco.
- Môi trường kiềm phần lớn tạo ra lumiflavin, môi trường axit tạo ra
lumicrom.
- Vitamin B
2
được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và một số vi sinh vật.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
4
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.2.3. Vai trò của vitamin B
2
đối với sức khoẻ con người
- Vitamin B2 tham gia vào cấu trúc của enzym dehydrogenase hiếu
khí (men vàng) ở dạng flavinmononucleotid (FMN) và flavin
adenozindinucleotid ( FAD). Hai dẫn xuất này chính là xúc tác cho phản ứng
chuyển vị hydro trong quá trình hô hấp của tế bào. Vì vậy thiếu vitamin B2
thì khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào biểu bì ruột bị rối loạn dẫn
đến chảy máu đường ruột. Các quá trình sinh lý, sinh hóa trong cơ thể xấu đi
và xuất hiện các triệu chứng rối loạn dẫn đến tình trạng nở miệng, long
móng, thiếu máu, rụng tóc.
- Vitamin B2 cần thiết để nâng cao sức đề kháng cơ thể sống đối với
bệnh nhiễm trùng, để làm tăng tốc độ tái tạo máu cũng như ảnh
hưởng đến sự phát triển của bào thai.
- Ngoài ra, cùng với vitamin PP, vitamin A, vitamin B2 tham gia
quá trình cảm nhận ánh sáng của mắt.
1.2.4. Nhu cầu
Nhu cầu vitamin B

Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin B
1
là một lĩnh vực rất quan
trọng và được ứng dụng rộng rãi trong y học, dược, công nghệ thực phẩm
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học và các nghiên cứu về
phương pháp xác định hàm lượng vitamin B
1
. Dưới đây là một số phương
pháp đã được ứng dụng rộng rãi.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
6
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
7
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.3.3.Phương pháp cực phổ
Phương pháp cực phổ được dùng có hiệu quả để định lượng riboflavin
trong dược phẩm. R.Brdicka và E.Kno-bloch là người đầu tiên đã nghiên
cứu phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B2 và nghiên cứu sự phụ
thuộc của vitamin B2 vào pH. Sóng cực phổ của riboflavin có tính khuếch
tán, chiều cao của sóng phụ thuộc theo đường thẳng vào nồng độ, vì thế
sóng này rất phù hợp để định lượng.
Để định lượng riboflavin, trước tiên ta lập đường chuẩn của mẫu chuẩn
với các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5mg trong 10ml dung dịch đệm
phosphat 0,1M, pH =6,8. Sau đó ta hút các thể tích tương ứng 0,25; 0,5;
0,75; 1,0; 1,25 ml dung dịch riboflavin chuẩn và đổ đầy dung dịch đệm
phosphate đến thể tích 10ml. Ta tiến hành đo cực phổ và ghi đường chuẩn.
Chuẩn bị dung dịch thử: Hút 2ml mẫu thử và 8ml dung dịch đệm

tiến hành tính cả mẫu thử có cho thêm mẫu chuẩn và mẫu thử chính không
cho thêm mẫu chuẩn. Tính trung bình cả hai lần đo. Định lượng mẫu trắng
sau khi cho 20mg natri hidro sunfit vào từng ống nghiệm.Từ đó tính ra nồng
độ của riboflavin trong mẫu thử.
Phương pháp huỳnh quang có nhược điểm là sự phân tích bằng ánh
sang không xảy ra hoàn toàn được và các sản phẩm phân tích lumicrom và
lumiflavin sẽ bị phân hủy tiếp khi tiếp xúc với ánh sáng.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
9
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.3.5.Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Kuhn và đồng nghiệp là người đầu tiên đã đo quang phổ hấp thụ của
riboflavin và tìm thấy trong dung dịch nước riboflavin bốn cực đại hấp thụ ở
các bước sóng 223nm ; 375nm ; 267nm ; 444nm. C.Daglish, M.Baxter xác
định rằng quang phổ hấp thụ tia tím tử ngoại của riboflavin phụ thuộc đáng
kể vào pH. Và khi xác định về định lượng cần phải đo quang phổ hấp thụ
của mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng một chất đệm như nhau.
Tiến hành định lượng trong điều kiện tránh ánh sáng. Cân chính xác
một lượng bột viên tương ứng với khoảng 10mg riboflavin, thêm hỗn hợp
gồm 5ml axit axetic kết tinh và 100ml nước. Đun cách thủy 1 giờ, lắc liên
tục. Thêm 500ml nước, để nguội, thêm 30ml dung dịch natri hidroxyd 1N và
lắc liên tục, pha loãng với nước thành 1000,0ml, lắc đều. Lọc loại bỏ dung
dịch đầu. Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở bước song 444nm, trong cốc
dày 1cm, so với mẫu trắng là nước. Tình hàm lượng riboflavin trong mẫu
theo giá trị A(1%,1cm) ở 444nm là 328.
Phương pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại được dùng như một
phương pháp thử đặc hiệu để xác định các nguyên liệu riboflavin và dược
phẩm.
Theo sự phân công của giáo viên hướng dẫn, em xin trình bày về

a
là phần cường độ bị hấp thụ
I
r
là phần cường độ bị phản xạ
I là cường độ ló ra
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
11
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Định luật hấp thụ ánh sáng :
Nếu chiều một chùm sáng đơn sắc có cường độ I
o
qua một dung dịch có
bề dày là b(cm) thì sau khi ra khỏi dung dịch nó bị hấp thụ một phần, nên
cường độ chỉ còn lại là I
t
với điều kiện I
t
< I
o
.
Biểu thức : T = I
t
/I
o
= 10
-
ε
bC

I
I
I
I
I
D
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
D
++++=
++++=








++++==
−
−

màu với thuốc thử R. Sau đó tiến hành khảo sát mật độ quang của dung dịch
ở các bước sóng khác nhau từ 380 – 800nm. Đo bước sóng từ 380 – 600nm,
khoảng cách mỗi lần đo là 10nm. Từ giá trị mật độ quang lớn nhất thu được
ta suy ra bước sóng cực đại.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
13
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

2.2.2.Chọn pH tối ưu
Nếu thuốc thử là một axit yếu thì nồng độ H
+
có ảnh hưởng lớn tới sự
tạo phức, làm ảnh hưởng đến giá trị mật độ quang . Vì vậy trước khi phân
tích ta cần phải khảo sát lại giá trị pH tối ưu. Cách xác định : Lấy một lượng
tiêu chuẩn chất cần phân tích chế hóa với các thuốc thử để tạo màu. Sau đó
thay đổi các giá trị pH của phức màu bằng cách thêm axit hoặc bazo. Tiến
hành đo giá trị mật độ quang của dung dịch phức màu. Tại giá trị pH nào mà
giá trị mật độ quang lớn nhất chính là giá trị pH tối ưu.
2.2.3.Chọn khoảng thời gian tối ưu
Thời gian tối ưu được xác định đối với phức, là khoảng thời gian mà mật
độ quang đạt giá trị lớn nhất và ổn định. Các xác định : Cho một lượng chất
tiêu chuẩn cần phân tích được chế hóa với thuốc thử để tạo phức màu, sau
đó khảo sát giá trị mật độ quang của phức trong khoảng thời gian khác nhau
(1p,3p,5p,10p ). Tại khoảng thời gian nào mà phức đạt giá trị mật độ quang
ổn định và lớn nhất thí đó là khoảng thời gian tối ưu.
2.2.4.Chọn các điều kiện khác
- Chọn kính lọc : màu của kính lọc và màu của dung dịch phải phụ
nhau
- Chọn khoảng nồng độ thích hợp : Khoảng nồng độ có quan hệ
tuyến tính với độ hấp thụ.

thạch anh.
- Đêtectơ là loại thiết bị có khả năng thu những thông tin : cơ, điện,
quang thành những tín hiệu, thường là tín hiệu điện. Trong máy UV-VIS thì
đêtectơ là các tế bào quang điện với hiệu ứng quang điện ngoài hay các nhân
quang điện.
- Bộ phận chỉ thị kết quả :là một máy tính hoặc bộ phjận giống máy tính
có chức năng thu nhân và hiển thị kết quả phân tích(các dãy phổ phân tích)
2.4.Các phương pháp định lượng trong quang phổ hấp thụ phân
tử.
2.4.1.Phương pháp tỉ lệ so sánh
Theo định luật Lambert-Beer, sau khi đo độ hấp thụ của dung dịch
chuẩn so sánh (S) và dung dịch mẫu thử (X) ta có:
A
s
= ε.b.C
s
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
16
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

A
x
= ε.b.Cx
Trong đó : A
s
: là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn có nồng độ C
s
A
x
: là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử có nồng độ C

2.4.2.Phương pháp thêm chuẩn so sánh
Trong phương pháp quang phổ, để loại trừ các yếu tố ảnh hưởng gây sai
số cho quá trình định lượng : Xử lý mẫu ( chiết xuất), sai lệch do thiết bị và
hóa chất thuốc thử , người ta đã áp dụng phương pháp thêm.
Nguyên tắc tiến hành: Lấy hai lượng giống nhau của một mẫu thử. Thêm
một lượng chất chuẩn đã biết vào một mẫu. Tiến hành xử lý cá hai mẫu
trong cùng điều kiện, thu được 2 dung dịch: dung dịch thử và dung dịch thử
đã thêm chuẩn. Đo độ hấp thụ của cả 2 dung dịch thu được :
A
x
: Độ hấp thụ của dung dịch thử
A’
x
: Độ hấp thụ của dung dịch thử đã thêm chuẩn
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
17
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Với C
s
là nồng độ của dung dịch chuẩn, ta tính được nồng độ C
x
theo
phương trình :
A
x
/A’
x
= C
x

,C
4
,C
5,
C
6
và 1 mẫu trống,
pha vào bình định mức, đánh số thứ tự từ 1 dến 7. Dùng thuốc thử thích hợp
để đưa về dạng phức màu.
- Đo mật độ quang các dung dịch chuẩn tại bước sóng đã khảo
sát(đã xác định λmax,đã xác định khoảng tuyến tính )
- Tương ứng với D
1
,D
2
,D
3
,D
4
,D
5
,D
6
dựng đường chuẩn D=f(C), xác
định được đường thẳng D=aC+b.
Bước 2:Chuẩn bị mẫu phân tích :
-Chuẩn bị như dãy chuẩn,trong cùng điều kiện như dung dịch
chuẩn.
Bước 3:Xử lý mẫu:
-Đo mật độ quang Dx

C
6
Nồng độ
Ưu điểm :
- Đường chuẩn được dùng trong thời gian dài, khi dùng có thể điều chỉnh
lại.
- Xác định hàng loạt mẫu.
- Chính xác,dễ thực hiện.
Nhược điểm
- Sự hấp thụ ánh sáng phải tuân thủ theo định luật Lambert-Beer
- Thành phần mẫu phức tạp (ta có thể loại bỏ nhưng không thể hoàn
toàn…) đường chuẩn bị sai số.
- Điều kiện mẫu chuẩn không thể giống hoàn toàn mẫu phân tích. Dễ dẫn
đến sai số.
- Kết quả chính xác của phép đo phụ thuộc vào máy.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
19
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

2.4.4 Phương pháp thêm chuẩn :
* Nguyên tắc chung:
- Lấy ngay dung dịch phân tích làm dung dịch nền
- Có 2 phương pháp thêm chuẩn :
+ Thêm một mẫu chuẩn
+ Thêm một dãy chuẩn
a.Thêm một mẫu chuẩn:
- Pha dung dịch chất phân tích với nồng độ Cx, thêm thuốc thử, môi


- Vẽ đồ thị D=f(C),từ đó xác định Cx
 So với phương pháp thêm 1 mẫu thì phương pháp thêm dãy chuẩn độ
chính xác cao hơn ,song đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian.Vì thế khi yêu cầu
độ chính xác cao thì ta nên dung phương pháp thêm dãy chuẩn.
Ưu điểm :
- Quá trình lấy mẫu dễ dàng ,không cần phải dùng hóa chât tinh
khiết cao để chuẩn bị mẫu chuẩn.
- Không chú ý đến ảnh hưởng về thành phần hay cấu trúc vật lý
của các chất.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
21
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

2.4.5. Kỹ thuật đo vi sai theo bước sóng
Trong kiểm nghiệm các dạng thuốc bào chế, trước hết ta phải qua công
đoạn chiết hoạt chất ra khỏi tá dược. Dịch chiết khó tránh khỏi mang theo
tạp chất. Tạp chất này có thể gây sai số cho quá trình định lượng bằng
phương pháp đo quang.
Để loại trừ sai số này, người ta thường sử dụng kỹ thuật đo quang vi sai :
Trên phổ của chất nghiên cứu, chọn hai bước sóng λ
1
và λ
2
. Ở đó hiệu số độ
hấp thụ ∆A là lớn nhất.
∆A
max
= A
λ

- Các loại pipet thủy tinh có dung tích 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 50ml
- Máy quang phổ thích hợp cho việc đo phổ ở vùng tử ngoại và khả
kiến bao gồm một hệ quang học có khả năng tạo ánh sáng trong
vùng từ 200 đến 800nm và một thiết bị thích hợp để đo độ hấp thụ.
+ Nguồn sáng cho vùng tử ngoại : đèn dotecti hoặc hidro
+ Nguồn sáng đo vùng khả kiến : đèn tungsten
+ Hai cốc đo (cuvet) dùng chứa dung dịch thử và dung dịch so
sánh phải có đặc tính quang học như nhau
+ Cuvet thạch anh : dùng đo vùng tử ngoại và khả kiến
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
23
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

+ Cuvet thủy tinh : chỉ đo ở vùng khả kiến.
Hiệu chỉnh máy quang phổ
Trong định tính và định lượng các chất bằng phương pháp quang phổ
UV-VIS, việc chuẩn hóa máy đóng vai trò quan trọng, đặc biệt là trong kỹ
thuật định lượng bằng đo phổ trực tiếp. Sau đây là 6 yêu cầu kiểm tra chỉ
tiêu kỹ thuật của máy quang phổ tử ngoại khả kiến:
 Kiệm tra độ dài sóng:bằng cách sử dụng cực đại hấp thụ của dung
dịch holmium perchlorate, vạch phổ của đèn nguồn hydro, đèn deuteri
hoặc vạch phổ của đèn hơi thủy ngân được chỉ ra dưới đây với dung
sai cho phép ở vùng tử ngoại là ± 1nm, ở vùng khả kiến là ±3nm :
Các cực đại hấp thụ của dung dịch holmium perchlorat khi dùng
- Đèn hydro : 379,79; 456,13 và 625,28nm.
- Đèn deuteri : 486,02 nm ; 656,10 nm.
- Kính holmium : 279,4 ; 287,5 ; 333,7 ; 360,9 ; 460,0 ; 484,5 ;
536,2 ; 637,5nm.
 Kiểm tra độ hấp thụ : để kiểm tra độ hấp thụ ta dùng dung dịch
kalidicromat trong acid sulfuric. Đo độ hấp thụ của dung dịch kali

±0,005cm. Khi được nạp đầy với cùng một dung môi, các cuvet có ý
định để chứa dung dịch thử và dung dịch so sánh phải có độ truyền
qua như nhau. Nếu điều này không được đáp ứng thì phải có sự hiệu
chỉnh thích hợp. Các cuvet phải được làm sạch và chăm sóc cẩn thận
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
25