Phương pháp sắc ký khí lỏng
hiệu suất cao (HPLC) và những vấn
đề cần nghiên cứu ứng dụng
Mở đầu
Nước là tài nguyên phổ biến nhất trên trái đất che phủ khoảng 71% bề
mặt trái đất (khoảng 361 triệu m
3
) trữ lượng nước được ước tính khoảng 1,5
tỷ m
3
. Trong đó nước ngọt chỉ chiểm 28,25 triệu km
2
(1,88% thủy quyển).
Nước đồng nghĩa với sự sống,nó là thành phần chính của các vật thể sống. ở
người nước chiếm từ 60 đến 70% trọng lượng cơ thể,ở trong một số loại sinh
vật biển có khi lượng nước lên tới 90%. Nước tham gia vào thành phần sing
quyển và điều hoá các yếu tố khí hậu, đất đai, sinh vật Thông qua chương
trình vận động của nó.
Cùng với sự phát triển của văn minh nhân loại, nhu cầu nước ngày càng
lớn. Hiện tại toàn bộ lượng nước sử dụng trong sinh hoạt, công nghiệp và
nông nghiệp, lượng nước sử dụng cho nhu cầu này thải ra ngày càng lớn,
gây ô nhiễm đáng kể đến nguồn nước và môi trường. Nước thải đưa vào nước
các loại hoá chất khác nhau, từ trạng thái tan hoặc huyền phù, nhò tương đến
các loại vi khuẩn. Mặt khác khi thải vào nước do tương tác hoá học của các
chất mà tạo nên các chất mới ngăn cản quá trình làm sạch nước và ảnh hưởng
đến sự sống của các sinh vật trong nước.
Quá trình đô thị hoá, công nghiệp và nông nghiệp hoá thâm canh càng
phát triển thì tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm đã xuất hiện ở
nhiều nước, nhiều nơi và ngày càng trở nên nghiêm trọng. Sự ô nhiễm nước
không chỉ đơn thuần là do vi sinh vật và các chất hưu cơ dễ phân huỷ, mà còn
do nhiều chất hưu cơ khác, các sản phẩm dầu, các chất tẩy rửa các chất phóng

2.Sử dụng các phương pháp định lượng Sö dông c¸c ph¬ng ph¸p
®Þnh lîng nh:
- Sắc khí lỏng hiệu năng cao với detector quang (uv) và
huỳnh quang (RF).
- Sắc kí khí với detector ion hoá ngọn lửa (FID), Bắt giữ
điện tử (ECD) và khối phổ (MS).
- Phân tích dòng chảy (FIA).
- Trắc quang.
Các quy trình phân tích này đều có thể áp dụng vào điều kiện ở nước ta.
Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi muốn nghiên cứu xây dựng
một quy trình để xác định các clophenol trong nước bao gồm các bước sau:
- Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để tách và làm giầu
các clophenol trong nước.
- Sử dụng kỹ thuật tách sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector
(UV-VIS) để định lượng chúng đồng thời áp dụng để phân tích
một số mẫu thực tế tại một số khu vực thuộc địa bàn Hà Nội.
Tuy nhiên, do điều kiện hạn chế của phòng thí nghiệm nên chúng
tôi chỉ nghiên cứu với 5 clophenol bao gồm (dẫn xuất từ mono
cho đến penta): 2. Clophenol; 2.4 Di clophenol; 2.4.6 Tri
clophenol; 2.3.4.6 Tetra clophenol; Penta clophenol.
Chương I
Tổng quan
1.1 Giới thiệu về các dẫn xuất có clo của phenol
1.1.1Khái niệm Kh¸i niÖm
Các clophenol gồm một dẫy các hợp chất hoá học, chất đại diện đầu
tiên là Hidroxybenzen được Runge tìm thấy năm 1943 khi chưng cất phân
đoạn nhựa than đá. Do mang tính axit nên hợp chất này còn được gọi là
axitcacbolic hoặc axit phelic. Và về sau để thể hiện nó với ancol người ta gọi
nó là "phenol" [4 ]
Các clophenol là hợp chất hữu cơ được tạo thành bằng cách thay thế

Tên hợp chất Ký hiệu Khối lượng
Phân tử
Nhiệt độ
sôi
C
o
(760
mHg)
Nhiệt độ
nóng
chảy C
o
(760
mHg)
1 2-Clophenol 2.CP 128.56 174.9 9
2 2.4 Diclophenol 2.4 DCP 163.00 210.0 45
3 2.4.6 Triclophenol 2.4.6
T
3
CP
197.45 246.0 69.5
4 2.3.4.6 Tetraclophenol 2.3.4.6
T
4
CP

231.89 150
15
70
5 Pentaclophenol PCP 266.34 309->310 190->191

CP lm chut b ri lon
nh run ry, mt phn x t nhiờn, thm chớ b ri lon trm trng vi 2,3,6 -
T
3
CP kốm theo thay i nhit c th. Khi tiờm T
4
CP v PCP thỡ dn n
tỡnh trng ngt th hoc cht sau thi gian ngn do thiu oxi. Khi tiờm
pentaclophenol vi hm lng 10 n 20 ppm cho thy 90% cht c c
thi ra khi c th chut, cũn li ch yu c tớch lu trong thn, gan v
mỏu. Thn b tn thng sau khong thi gian t 20 n 40 giờ, gan b tn
thng sau 3 dn 5 ngy.
Nghiờn cu ó ch ra rng hu nh cỏc mono - , di - , triclophenol cú c
tớnh va phi khong 23-400àg/kg trng lng. Cỏc clophenol cú ít nguyờn
t clo cú c tớnh gn ging phenol. Cũnvi T
4
CP v PCP thỡ c tớnh mnh
hn khong 10-40mg/kg trng lng.
Biểu hiện tác động của các clophenol
nói riêng và phenol nói chung đến
quần thể sinh học
Mất ph!ơng h!ớng
trong chuyển động
Mất phản xạ trong
điều chỉnh cân bằng
cơ thể
Mất tính năng bơi lội
trong n!ớc, ngừng hô
hấp và chết
1.1.4.2. Sự độc hại của clophenol đối với người

Chóng
mặt
Nôn
mửa
Tê liệt
tim
mạch
N!ớc
tiểu có
màu
Tử
vong
Ng!ng
tụ
protein
Ngộ
độc
Qua
đ!ờng
hô hấp
Qua
da
trò nh mét phenomon của một số loài phát ra. Lượng lớn các hợp chất
clophenol được phát hiện trong môi trường có nguồn gốc tự nhiên .
1.2.2. Nguồn nhân tạo
Vào thập kỷ 70, sản lượng hàng năm của clophenol trên toàn thế giới
ước tính khoảng 200 nghìn tấn, và chủ yếu là 2,4 - diclophenol và 2, 3,4, 6 -
tetraclophenol. Các nước sản xuất clophenol chủ yếu là Mỹ, Nhật, Anh, Thuỵ
Điển. Đến cuối thập kỷ 70, khi các nghiên cứu về độc tính của clophenol khá
đầy đủ thì một số nước phát triển đã đề ra quy định về việc hạn chế sử dụng

theo dòng khí mang đi tới bẫy hấp phụ và bị giữ lại tại đây. Sau khi quá trình
sục khí và hấp phụ hoàn thành, bẫy được gia nhiệt nhanh tới khoảng 180
o
C,
sử dụng dòng khí trơ có tốc độ 20-60ml/phút trong thời gian 4 phót để đẩy các
chất hữu cơ hấp phụ trên bẫy vào cột sắc ký (có thể sử dụng thêm bẫy lạnh để
cô đặc mẫu trước khi đưa vào cột sắc ký). Giới hạn phát hiện của phương
pháp phụ thuộc vào hiệu suất của quá trình tách chất bằng kỹ thuật sục khí
bẫy lạnh và độ nhạy của thiết bị phân tích sắc ký.
1.3.2. K thut sc khớ tun hon (Closed - loop stripping tecnique) [15]
K thut sc khớ tun hon c giỏo s Grob gii thiu ln u tiờn vo
nm 1973 xỏc nh cỏc cht hu c d bay hi trong nc. V bn cht,
phng phỏp ny cú nguyờn tc ging nh phng phỏp sc khớ v by gi cht
phõn tớch li.
Hỡnh 4: Thit b sc khớ tun hon CLSA
Vi k thut ny, dũng khớ i qua bm ti bỡnh mu v c phõn tỏn
vo nc di dng bt. Mt phn hi cht hu c c cun theo dũng khớ
ra khi mu di ti by hp th lm bng than hot tớnh v b gi li ti õy.
Dũng khớ sau khi by than li c tun hon qua bm v sc vo mu nc.
Quỏ trỡnh ny c lp i li li t 2 n 4 giờ.
Sau khi quỏ trỡnh sc khớ tun hon v hp ph hon thnh, by than
c ly ra. Cỏc cht hu c hp ph trờn by than c ra gii bng một
1
2
6
4
5
3
Chú thích
1. Bơm tuần hoàn

C
6
với GC và 2,4 - dibromphenol với HPLC. Các phenolat đều được dẫn
xuất hoá dưới tác nhân anhidrit axetic thành dạng phenolaxetat. Độ thu hồi
của phương pháp từ 40-89% và giới hạn phá hiện từ 1-10ng/l [14].
Theo ISO - 8165 -1, các phenol có thể được chiết trực tiếp từ pha nước
(không qua lọc) bằng dietylete, cô cạn, làm giàu và làm sạch qua cột
selicagel. Sau đó, chúng được định tính và định lượng bằng sắc ký khí với
detector FID hoặc FPD [20].
1.3.4. Phương pháp chưng cất
Phương pháp chưng cất là phương pháp nhanh, đơn giản, tốn Ýt dung môi
và có thể áp dụng phân tích đối với mẫu nước thải công nghiệp nhiều tạp chất.
Theo phương pháp chưng cất, mẫu nước dược điều chỉnh tới pH = 1,5
thêm 25% NaCl, và tiến hành chưng cất trực tiếp, hứng phần ngưng, tiêm 1
ml vào máy sắc ký lỏng hiệu suất cao HPLC. Khi nghiên cứu phương pháp
này với 5 clophenol cho thấy độ thu hồi từ 91,9 - 97,3% độ lặp lại cao, và
giới hạn phát hiện từ 7-16µg/l [12].
Phương pháp chưng cất kết hợp với kỹ thuật nội chuẩn và dẫn xuất hoá
các phenolic đã được áp dụng để phân tích mẫu nước thải [9]. Với phương
pháp này, mẫu nước đã được axit hoá tới pH ∼ 1, thêm chất nội chuẩn là 2,6 -
dibromphenol, thêm dung môi và dung dịch NaCl bão hoà, rồi đem chưng cất
thu pha hữu cơ giàu chất phân tích. Sau đó chuyển chất phân tích vào pha hữu
cơ khác phù hợp, tiến hành dẫn xuất hoá các phenolic bằng
pentafluorobenzylbromua 1% trong axeton, rồi làm sạch mẫu bằng cách cho
qua cột florisil và làm khô bằng Na
2
SO
4
khan, đuổi dung môi, tiến hành phân
tích sắc ký khí với detector ECD. Độ thu hồi của phương pháp từ 75,94 -

cho đến khi khô, rồi thêm chính xác 100µl dung môi dietylete. Tiêm
1µl dung dịch này vào máy sắc ký khí với detector ECD để định tính và định
lượng chúng. Độ thu hồi của phương pháp này lớn hơn 70%, với độ lặp lại
cao và độ nhạy khảng µg/l.
1.3.6. Phương pháp chiết pha rắn (chiết láng - rắn)
1.3.6.1. Nguyên tắc chung
Trong phương pháp chiết pha rắn, các chất hấp phụ rắn, có diện tích bề
mặt riêng lớn được sử dụng để chiết, tách và làm giàu các hợp chất hữu cơ từ
pha nước. Theo phương pháp này, mẫu nước được điều chỉnh tới pH thích
hợp được xử lý sơ bộ rồi được dội qua cột (cột được nhồi chất hấp phụ rắn).
Do ái lực mạnh với pha tĩnh nên các chất hữu cơ bị giữ lại trên cột, và sau đó
dùng dung môi hữu cơ thích hợp để rửa giải thu chất phân tích.
Các chất hấp phụ rắn được sử dụng cho chiết pha rắn bao gồm: các
polyme, polyme đồng trùng hợp styren - divinylbenzen, polyme acrylic, tenax
- GC, các pha liên kết C
18
, C
8
, C
6
- Silica và thường được bán trên thị trường
dưới dạng hạt, cột nhồi rắn, dạng phim, dạng đĩa hay dạng màng.
Phương pháp chiết pha rắn thường được áp dụng đối với các chất khó
bay hơi, các chất không chiết được bằng phương pháp chiết láng - lỏng.
1.3 2. Phương pháp sử dụng nhựa hấp phụ polystyren - divinyl - benzen
Theo phương pháp này, nhựa được Ðp dưới dạng đĩa, và áp dụng cho
phân tích các phenol trong nước. Trước khi sử dụng, đĩa được chuẩn bị kỹ
lưỡng bằng cách ngâm trong axeton, trong metanol và cuối cùng rửa bằng
nước cất có điều chỉnh pH tương đương với pH của mẫu. Mẫu nước được
điều chỉnh tới pH ∼ 2, rồi được lọc qua đĩa, sau đó chất phân tích được rửa

giữ trên đĩa được rửa giải bằng axeton. Dịch chiết được cô cạn và được định
tính, định lượng trên thiết bị GC-MS. Độ thu hồi của phương pháp đạt 60-
95%, với giới hạn phát hiện 5-20ppb[13].
Nghiên cứu của S.Dupeyron và các cộng sự cho thấy pentaclophenol
trong nước uống hoặc nước thải công nghiệp được điều chỉnh tới pH∼2,6,
bơm qua đĩa C
18
, được rửa giải bằng hỗn hợp axetonitril + nước + axit axetic,
được định lượng bằng HPLC với detector quang (UV) hoặc huỳnh quang
(RF). Độ nhạy của phương pháp ∼ 0,1µg/l. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi
thêm NaCl vào mẫu nước làm tăng độ phân cực của nước và do đó sẽ nâng
cao được độ thu hồi của pentaclophenol lên từ 87-90% [12, 2].
Theo Goncharov V.V. và các cộng sự, lượng lớn mẫu nước được bơm
qua đĩa C
18
để làm giàu trước mỗi phép phân tích. Các nhà nghiên cứu đã sử
dụng kỹ thuật sắc ký khí kết hợp với khối phổ (GC-MS) để phân tích. Giới
hạn phát hiện của phương pháp này là 1 -10ng/l [5].
Đĩa C
18
còng đựơc Bao M.L. và các cộng sự sử dụng để chiết và làm
giàu các phenol và dẫn xuất của phenol trong nước. Theo nghiên cứu này,
mẫu được axetyl hoá trực tiếp bằng anhydritaxetic thành phenolaxetat, rồi được
chiết bằng đĩa C
18
và được định lượng bằng phương pháp sắc ký khí sử dụng
detector khối phổ. Phương pháp này có độ chính xác và độ nhạy cao được dùng
để phân tích các hợp chất của phenol bao gồm: phenol, ankyl phenol, phenol đã
halogen hoá, nitrophenol trong nước máy, trong đất và các mẫu nước sông. Độ
thu hồi của phương pháp lớn hơn 80% và độ nhạy từ 2-50ng/l [3].

o
thường được sử dụng
làm chất hấp phụ các phenol và dẫn xuất. Nhựa có dung lượng hấp phụ lớn,
do diện tích bề mặt riêng lớn ∼ 750m
2
/g.
Zheng - Liang Zhi và cộng sự đã tiến hành chiết và làm giàu các phenol
trên XAD - 4, sau đó rửa giải chất phân tích trên pha rắn và áp dụng phương
pháp đo mầu sử dụng thuốc thử 4 - amino antipyrin để xác định tổng lượng
các phenol trong nước. Giới hạn phát hiện của phương pháp này tới 0,2ng/ml
và khoảng tuyến tính 0,5-60ng/ml [27].
Trong nghiên cứu của mình. Elina B. Caramao và các cộng sự Brazin
sử dụng XAD - 4 để chiết các phenol từ mẫu nước khí hoá than sau khi đã
được axtyl hoá bằng anhidritaxetic. Chất phân tích được rửa giải và định
lượng trên thiết bị sắc ký khối phổ GC - MS. Qua nghiên cứu này, họ đã phát
hiện ra 20 hợp chất phenol đã được axetyl hoá trong hổn hợp phức tạp của
nước khí hoá than [26].
Một nghiên cứu mới đây đã sử dụng nhựa XAD - 4 để chiết và làm
giàu các clophenol trong nước. Theo quy trình này, mẫu nước được kiềm hoá
tới pH ∼ 13 được lọc sơ bộ loại các tạp chất thô, rồi axit hoá tới pH ∼ 2; tiến
hành chiết các clophenol trên nhựa XAD - 4, sau đó rửa giải bằng dietylete.
Các clophenol sau khi rửa giải sẽ được giải chiết khỏi pha hữu cơ bằng dung
dịch NaOH ∼ 0,2N, rồi axit hoá tới pH ∼ 2 và chiết lại bằng dietylete. Dịch
chiết được làm khô bằng Na
2
SO
4
khan, rồi cô cạn bằng dòng khí nitơ, thêm
dung môi n - hecxan và bơm 1µl vào máy sắc ký khí với detector ECD để
định lượng. Độ thu hồi của phương pháp từ 68-83% với độ nhạy phát hiện

2
S
2
0
8
trong môi trường pH ∼ 10. Sản
phẩm mầu được đo trực tiếp ở bước sóng 500mm hoặc được chiết lên
clorofom và đo mầu ở bước sóng 460mm. Phương pháp này có ưu điểm là xử
lý mẫu nhanh, không phức tạp nhưng chỉ cho phép phân tích hàm lượng các
phenol và dẫn xuất có nồng độ 0,001 - 0,005% [18].
Cải tiến các phương pháp này và sử dụng chất hấp phụ XAD - 4 để tách
và làm giàu các clophenol từ dung dịch nước tại pH ∼ 2 trong hệ thống dòng
liên tục. Chất phân tích được rửa giải bằng cách bơm liên tục dòng dung dịch
nước có pH ∼ 13 qua nhựa, rồi đưa trực tiếp vào dòng thuốc thử 4 -
aminoantipyrin. Sản phẩm của phản ứng được chiết bằng cloroform và đo
mầu. Phép phân tích có độ nhạy khá cao khoảng 0,2ng/ml với khoảng tuyến
tính 0,5-60ng/ml [27]
Hạn chế của phương pháp này là thuốc thử 4 - aminoantipyrin kém
chọn lọc với các phenol Chỉ xác định được lượng tổng các phenol trong
nước.
1.4.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao (HPLC)
Phương pháp sắc khí lỏng hiệu suất cao và phương pháp sắc ký khí đã
được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ và Châu Âu sử dông nh là phương
pháp chuẩn để xác định phenol và các dẫn xuất của phenol. Phương pháp có
độ nhạy rất cao, khoảng ppb.
S. Dupeyron và các cộng sự đã tiến hành chiết pha rắn và sử dụng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao để xác định các phenol trong nước [6].
Theo phương pháp này, cột tách được sử dụng là cột pha đảo có kích thước
(12,5cm x 4,0mm), . Mẫu sau khi đi qua cột tách sẽ được đi qua detector
quang (UV) hoặc huỳnh quang (RF) với chương trình bước sóng của UV là :

ppb [10].
Theo nghiên cứu của Heberer Thomas và cộng sự, khi tiến hành chiết
pha rắn để tách và làm giàu phenol và hơn 50 dẫn xuất của phenol, sau đó sử
dụng phương pháp sắc ký khí khổi phổ với kỹ thuật chọn lọc ion để định tính
và định lượng chúng đã cho độ nhạy khá cao khoảng ng/l. Trong phương
pháp GC - MS - SIM, họ sử dụng hai loại cột mao quản là HP-5 có kích thước
(25m x 0,2mm x 0,33µ) và Rtx - 200 có kích thước (30m x 0,32mm x
0,25µm) [17].
Chương 2
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp sắc ký khí lỏng hiệu suất cao (HPLC) và những vấn
đề cần nghiên cứu ứng dụng
2.2.1.1. Nguyên tắc chung của phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng là quá trình tách một,hoặc hỗn hợp các chất ở trong cột
tách sắc ký ở trạng thái lỏng, mà ở đây thực chất là sự vận chuyển và phân bố
lại liên tục của các chất tan (mẫu phân tích) qua từng líp của cột chất nhồi
(pha tĩnh) từ đầu đến cuối cột tách. Trong những điều kiện sắc ký nhất định
thì chất tan luôn được phân bố giữa hai pha động và pha tĩnh tuân theo định
luật phân bố. Mặt khác, mỗi chất có cấu trúc phân tử và tính chất khác nhau,
nên khả năng tương tác tới pha tĩnh và khả năng hoà tan trong các dung môi
rửa giải (pha động) khác nhau, do vậy tốc độ vận chuyển các chất tan qua cột
là khác nhau. Vì thế tạo ra sự tách của các chất khi qua cột sắc ký.
Trong kỹ thuật HPCL, mẫu phân tích được bơm vào cột qua mét van bơm
mẫu, sau đó nhờ một bơm cao áp bơm pha động chảy qua cột sắc ký với một
tốc độ xác định để thực hiện quá trình tách.Quá trình tách trong cột sắc ký là
sự tương tác của các chất phân tích với pha tĩnh đứng yên trong cột tách và
pha động luôn chuyển động qua cột tách với tốc độ nhất định. Đây là quá
trình chính diễn ra trong cột tách của kỹ thuật HPLC. Sự tương tác của chất
tan với pha tĩnh có thể diễn ra theo:
- Tương tác hấp phụ