TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

KHOA KỸ THUẬT Y HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH
LÂM SÀNG

Sinh viên thực tập: Nguyễn Văn Thành
Tổ 35 – Lớp Y4K
Hà Nội, Tháng 12 năm 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
KHOA KỸ THUẬT Y HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH
LÂM SÀNG Địa điểm thực tập :Khoa xét nghiệm – Bệnh viện Nhiệt đới
Trung Ương

 Tham gia 1 số công việc của phòng xét nghiệm, tự đánh giá khả năng của
mình và chất lượng sau khi hoàn thiện công việc
 Viết báo cáo thu hoạch sau khi đi thực hành bệnh viện.

PHƯƠNG PHÁP HOC TẬP
Kiến tập, thực tập tại khoa xét nghiệm bệnh viện Nhiệt Đới Trung Ương 2
PHẦN A
Tổ chức phòng xét nghiệm BV Nhiệt Đới
Trung Ương.

1. Nguồn nhân lực:Gồm 49 cán bộ y tế
Khoa xét nghiệm được chia thành 1 phòng chức năng quản lý chất lượng và 5
phòng chuyên môn: Vi khuẩn- Lao- Môi trường- Hấp rửa, kí sinh trùng, sinh
học phân tử, miễn dịch. Được bố trí như sau:



KTV trưởng:
CN. Nguyễn Thị Thu Hà
Phòng QLCL:
Ths Nguyễn Thị Thúy Hằng;
CN Nguyễn Thị Hòa.
Phòng ký sinh
trùng
CN. Nguyễn Thị Lan
CN. Đỗ Thị Lê Na
CN. Nguyễn Thị
Huyền Trang,
Phòng Miễn dịch-
HIV
Ths. Nguyễn Thị Như
Hà
KTV. Nguyễn Thị Hà
KTV.Vương khánh
Hoan
CN. Nguyễn Thị Hòa
Ths.Ngô Mai Khanh
KTV. Phạm Đức Quý
CN Nguyễn Thị Thu
Hà
CN Bùi Thị Thu
trang

Phòng hóa sinh
Ths.Bs Nguyễn
Thanh Bình

Lao- Môi trường-
Hấp rửa
Ths Đào Tuyết Trinh,
Ths Văn Đinh Tráng,
CN Trần Thị Vân
Dung, Ktv Nguyễn
Thị Hà, CN Nguyễn
Thị Tho, Ths Nguyễn
Thị Hằng, Ktv Lê
Trung Toàn, Yc Đặng
Hồng Yến, Yc Đoàn
Thị Hằng, Ktv Nguyễn
Thị Tươi, CN Ngô Thị
Thu Hằng Phó trưởng khoa 2:
Ths,bs Nguyễn Thanh Bình 3
 Khoa Xét nghiệm là khoa cận lâm sàng, có chức năng: Thực hiện các kỹ
thuật xét nghiệm về huyết học, sinh hóa, vi sinh, ký sinh trùng, sinh học phân
tử, miễn dịch phục vụ cho việc chẩn đoán, xác định nguyên nhân gây bệnh,
theo dõi diễn tiến của bệnh nhân trong quá trình điều trị.
 Khoa xét nghiệm hoạt động dưới sự lãnh đạo của trưởng khoa, người giám
sát toàn bộ hoạt động của khoa cùng với một đội ngũ cán bộ có chuyên môn,
với sự trợ giúp của phó trưởng khoa. Khoa xét nghiệm đã bổ sung hai nhân
viên Quản lý chất lượng(QLCL) Quản lý kỹ thuật(QLKT) có trách nhiệm
đảm bảo mọi hoạt động của khoa.

-Máy ly tâm
-Tủ 80- VIP

-kính hiển vi
-máy ly tâm
Hitachi
-Bốc vô trùng
-Tủ ấm memmert
-Tủ lạnh
-dàn ELISA
-Máy facscount
-máy cobas
6000
-máy ly tâm, tủ
lạnh, tủ âm sâu,
máy lắc, nhiệt
kế…
-bốc vô trùng, -
máy PCR,
-thiết bị điện di
-RT PCR
-tủ lạnh, tủ âm
sâu
-máy vortex,
spindown
-máy ly tâm

4
Dụng
cụ, vật

phẩm,
hóa chất
-Bột môi trường
nuôi cấy, môi trường
xác định tcsvhh
-Cồn, nước cất,
NaCl….
-Bộ thuốc nhuộm:
Gram, ziehl
neelsen,…
-test miễn dịch
sốt rét, card định
danh nấm AST
-bộ nhuộm gram,
giêmsa, mực tàu,
lao
-thang định danh
nấm, KSĐ nấm

-hóa chất đếm
CD4, dụng dịch
đệm, dd rửa,
hóa chất đối
chứng,
-nước cất, cồn,
buffer làm test
-nước cất,
master mix,
buffer, hóa chất
PCR, Hóa chất



có hành động khắc phục các kết quả sai sót. 7
Bảng tổng kết về công việc xét nghiệm của khoa: Tên xét nghiệm
Yêu cầu bệnh phẩm Phòng
vi
khuẩn
1. Nuôi cấy, phân lập các VK từ dịch não
tủy
2. Nuôi cấy, phân lập các VK từ máu
3. Nuôi cấy lao từ máu
4. Nuôi cấy, phân lập các VK từ đường
hô hấp
5. Nuôi cấy, phân lập các Vk từ đường
tiết niệu
6. Nuôi cấy, phân lập các VK từ da, niêm
mạc
7. Nuôi cấy MGIT từ các loại BP
8. Nuôi cấy, phân lâp VK từ các BP khác
9. Định danh VK bằng kỹ thuật thông

Phòng
sinh
học
phân
tử
1. Định lượng HBV (Cobas)

2. Định lượng HBV (Realtime)

3. Định lượng HIV (Cobas)
4. Định lượng HCV (Cobas)
5. Định lượng HIV (Realtime)
6. Định lượng HCV (Realtime)
7. PCR lao

8. PCR-CMV
9. PCR Herpes
-2 ống chống đông EDTA,
2ml/ống.
-Đủ 3ml máu không chống
đông.
-2 ống chống đông EDTA,
2ml/ống.
-Đủ 3ml máu không đông.

2. Cấy tổn thương da

3. Nhuộm soi và làm test miễn dịch kst
sốt rét.
4. Soi tìm KST đường ruột
5. Nhuộm soi tìm nấm
6. Soi tìm ấu trùng giun chỉ

7. Kháng sinh đồ nấm
-Bp lấy mẫu để trong ống
nghiệm vô trùng có nắp đậy.

-Dựa vào chỉ định, lấy đúng
vị trí.
-2ml máu chống đông
EDTA.
-Bp lấy mẫu
-Bp lấy mẫu
-Lấy máu tĩnh mạch 2ml máu
chống đông EDTA.
-Bệnh phẩm cấy nấm dương
tính.
Phòng
miễn
dịch
1. HIV 3 phương pháp, HbsAg, A-HBs,
Hbe/A-Hbe, A-HBc total/A-HBc IgM, A-

Thời gian Bệnh phẩm

Ngày 16/11

Tuần từ 15-22/11

Tháng 11

Cấy máu
16
133
549
Nước tiểu
4
30
128
Phân
2
19
70
Đờm
4
22
104
Mủ
1
9

 Test nhanh
 Ns1-Ag:21
 Dengue IgM-IgG:10
 Ricketia:18
 Leptospida IgM:3
 HBsAg:194
 Anti HBsAg:124
 HCV:224
 EV71:5
 HIV:49
 HIV 3 phương pháp:57
 CD4:189
 HBsAg định lượng: 87
 Elisa:16
4 phòng sinh học phân tử ngày 18/11/2014
 Định lượng HBV (Cobas) :30
 Định lượng HBV (Realtime):35
 Định lượng HIV (Cobas):10
 Định lượng HCV (Cobas):21
 Định lượng HIV (Realtime):3
 Định lượng HCV (Realtime):4
 PCR lao:4
11
PHẦN C:
Quy trình của 1 số xét nghiệm thông thường trên vi sinh
lâm sàng
I. Một số quy trình phân lập, xác định vi khuẩn gây bệnh:

- Đổi mặt que cấy, ria tiếp vùng thứ 2, các đường cấy vùng 2 cắt 3, 4 đường cấy
cuối của vùng nguyên ủy, diện tích ria cấy của vùng 2 khoảng 1/3 đĩa thạch.
- Lấy que cấy mới ria cấy vùng thứ 3, các đường cấy của vùng thứ 3 cắt 3, 4
đường cấy cuối cùng của vùng thứ 2. Diện tích ria cấy của vùng 3 khoảng ¼ đĩa
thach.
- Nếu cấy 4 vùng thì đổi mặt que cấy, cấy tiếp vùng thứ 4 cho đến hết bề mặt
thạch, các đường cấy của vùng thứ 4 cũng cắt 3, 4 đường cấy cuối của vùng thứ 3.
 Chú ý:
- Các đường cấy càng sát nhau càng tốt
- Diện tích ria cấy của vùng 2 là lớn nhất vì thường khuẩn lạc mọc riêng
rẽ bắt đầu từ vùng thứ 2, đến vùng thứ 3, thứ 4 có những bệnh phẩm
không bắt được khuẩn lạc riêng rẽ nữa.
- Khi cấy hết vùng 1 chú ý đổi mặt que cấy hoặc đổi que cấy khác hoặc
tiệt trùng que cấy rồi mới tiếp tục cấy tiếp. Đây là yêu cầu bắt buộc và
phải thực hiện đúng, vì thực hiện sai thì ý nghĩa của kĩ thuật là phân vùng
sẽ không được đảm bảo.
2. Nhuộm Gram:
-

Đánh số tiêu bản: Đánh số xét nghiệm vào đầu mờ của lam kính,sô thứ tự
này trùng khớp với nhau trong giấy yêu cầu xét nghiệm, dụng cụ chứa
bệnh phẩm và trên lam kính.
-

Lấy bệnh phẩm và dàn đồ phiến: dàn bệnh phẩm ra lam kính sạch, hình ô
van, chiều dài 2cm và chiều rộng 1 cm.
-

Để khô tự nhiên
-

Tiêu bản đạt yêu cầu
-

Mật độ vi khuẩn vừa phải, đều
-

Hình thể vi khuẩn rõ rang, không bị biến dạng

13
-

Vi khuẩn bắt màu đúng
-

Tiêu bản không có cặn bẩn, sáng, dễ xem. 2. Quy trình cấy phân:
2.1. Cách lấy bệnh phẩm:
-Lấy phân từ trực tràng: Dùng tăm bông vô trùng dã tẩm ướt bằng nước muối sinh
lý, xoay tăm bông lấy được một lượng phân nhỏ dính vào sau đó gửi ngay tới
phòng xét nghiệm vi sinh.
-Lấy phân đã đi ra ra ngoài dụng cụ sạch: Dùng một chiếc bô sạch, khô, cho bệnh
nhân đi ra ngoài vào rồi dung tăm bông lấy phân ở những vùng có biểu hiện bệnh
lý, sau cho vào ống nghiệm vô trùng gửi tới phòng xét nghiệm.
-Ghi tên, tuổi, phòng, chẩn đoán,giờ nhận bệnh phẩm vào sổ cấy phân
2.2. Quy trình:

Macconkey,
37ºC, 24h
Dựa vào màu sắc
hình dạng khuẩn
lạc→ bắt khuẩn
lạc nghi ngờ
Xđ tính
chất sinh
vật hóa
hóc, định
danh

KSĐ+
thạch
thường, lưu
giữ chủng

14
- Thông báo ngay cho nhân viên trực cấy máu trong ngày, phải lấy máu trong
vòng 15 phút sau khi có giấy xét nghiệm tới;
- Lấy máu để cấy
►Chú ý
+Kiểm tra dụng cụ và chai cấy máu trước khi cấy máu, nếu chai máu hoặc môi
trường dùng cho cấy máu bị bẩn thì phải loại ngay.
+Không cấy máu khi: bệnh nhân đang truyền dịch, truyền máu, huyết thanh,
đang dùng kháng sinh, vừa sau khi ăn.
+Đảm bảo nguyên tắc vô trùng
+Đảm bảo đúng thể tích. (máu:canh thang=1:10)
- Ghi tên, tuổi, khoa phòng, số giường, chẩn đoán, mã bệnh phẩm, ngày cấy
vào sổ cấy máu

Nhuộm soi
Dựa vào hình dạng
khuẩn lạc, màu sắc
khuẩn lạc
Trực khuẩn gram âm
Cầu khuẩn gram dương
xếp đám
- đặt opt
- chạy giá
đường strep
Uri+ thạch mềm
Oxydase
Vitek 2
KSĐ+
Thạch
thường
xếp chuỗi
- Đông huyết tương
Bình báo dương

16
4.2. Một số vi khuẩn thường gặp:
-A.pseudomonas -S.aureus
-A.Baumanii -P.mirabilis
-K.pneumonia
4.3. Quy trình cấy đờm:
5. Quy trình cấy dịch não tủy:
5.1 Nguyên tắc lấy bệnh phẩm:
Dựa vào hình dạng
khuẩn lạc, tính chất

17
- Đảm bảo vô trùng
- Lấy đủ số lượng
- Điền đầy đủ thông tin vào ống đựng bệnh phẩm
- Cần gửi sớm đến phòng xét nghiệm vi sinà
5.2 Quy trình kỹ thuật:

Bệnh phẩm
Nhuộm soi: tìm
bạch cầu, vi khuẩn
Thạch máu,
soco(37ºC,24h)
Hình dạng khuẩn
lạc, tính chất tan
máu→chọn
khuẩn lạc nghi
ngờ
Nhuộm soi
Cầu khuẩn gram dương
trực khuẩn gram âm
cầu trực khuẩn
gram âm
xếp
chuỗi
xếp
đám
Catalase
Opt
Lên men
đường

cho vào ống nghiệm vô trùng mang đến phòng xét nghiệm.
- Ghi tên, tuổi, phòng, chẩn đoán, giờ nhận bệnh phẩm vào sổ cấy mủ.
6.2. Các vi khuẩn thường gặp.
-S.aureus -P.Aeroginosa
-Streptococcus -A.Baumanii
-Vi khuẩn đường ruột: E.coli… -Lậu cầu
6.3. Quy trình nuôi cấy:
Bệnh phẩm
Quan sát tính chất bệnh
phẩm, nhuộm soi (vi
khuẩn, bạch cầu…)
Canh thang
Glucose(37ºC, 24h)

- Thạch máu+
soco(37ºC,5% CO2,
24h)


 Trải huyền dịch vi khuẩn trên mặt thạch.
- Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng một que tăm bông
vô khuẩn vào huyền dịch rồi ép và xoay nhẹ que tăm bông lên thành ống
nghiệm. Động tác này sẽ bớt được lượng huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que
tăm bông.
Nhuộm soi
Xác định tính chất sinh
vật hóa học
Định danh, kháng sinh
đồ

20
- Ria vi khuẩn từ que tăm bông lên mặt thạch Mueller- Hinton đã để tủ ấm trước
đó 30 phút bằng máy tự tạo: Đặt ngửa đĩa thạch vào vị trí để đĩa trên máy, đặt
tăm bông từ tâm đĩa thạch, bật máy, kéo từ từ tăm bông từ tâm ra ngoài rìa đĩa
thạch, vừa kéo vừa xoay đều tăm bông.
 Đặt khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch đã ria vi khuẩn.
- Tuỳ theo chủng vi khuẩn làm kháng sinh đồ, chọn bộ kháng sinh thích hợp để
đặt lên mặt thạch. Khi đặt phải ép nhẹ mỗi khoanh giấy để đảm bảo chúng tiếp xúc
với mặt thạch.
- Trong 15 phút sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh phải để sấp hộp thạch trong
tủ ấm 35ºC.
► Chú ý: Không ủ hộp thạch ở khí trường quá 5% CO2.(thay đổi pH MT)
7.2. Kĩ thuật làm kháng sinh đồ xác định MIC bằng E- test.
a. Bệnh phẩm.
- Chủng vi khuẩn tươi đã được định danh, nuôi cấy qua đêm (18-24 giờ)
b. Nguyên lý.
- Kháng sinh tẩm trong thanh E- test sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch
và ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Do nồng độ kháng sinh giảm dần từ đầu
đến cuối thanh E- test nên vùng càng xa phía đầu thanh E- test khả năng ức chế

điểm hơn huyết tương vì huyết thanh trong hơn ít bị thay đổi các yếu tố
hơn và không cần chống đông.
 Để thực hiện được các kỹ thuật trên cần phải có các KIT của các hãng
khác nhau. Mỗi một bộ KIT khác nhau sẽ có một quy trình khác nhau
nhưng tất cả đều dựa trên một nguyên tắc chung là phản ứng kết hợp
kháng nguyên kháng thể.
 Trước khi làm xét nghiệm cần làm thủ tục hành chính:
 Đối chiếu tên, tuổi, khoa, phòng, giữa ống và giấy yêu cầu, ghi giờ
nhận vào sổ.
 Kiểm tra máu lấy có đúng ống không, chất lượng bênh phẩm.Ly tâm
mẫu, chuẩn bị hóa chất, dụng cụ làm xét nghiệm. 22
1. Quy trình chẩn đoán HIV:
1.1. Quy trình xét nghiệm HIV 1/2 - Test nhanh:
a. Nguyên lý:
Thử nghiệm SD Bioline HIV-1/2 3.0 gồm các vạch được gắn kháng nguyên bắt giữ
tái tổ hợp của HIV1 (gp41, p24) (vạch 1) và kháng nguyên bắt giữ tái tổ hợp của
HIV2 (gp36) (vạch 2) và vùng cộng hợp chứa kháng nguyên HIV-1/2 tái tổ hợp
(gp41, p24 và gp36) gắn colloid. Vạch C gắn kháng kháng thể được dùng để kiểm
chứng, vạch này sẽ xuất hiện khi KTV thao tác đúng quy trình và dung dịch thử
nghiệm còn tốt. Nếu mẫu thử âm tính, không chứa kháng thể thì kháng kháng
nguyên đơn dòng ở vùng cộng hợp sẽ kết hợp với kháng kháng thể gắn ở vạch C
và xuất hiện màu ở vạch này. Nếu mẫu thử dương tính, có chứa kháng thể sẽ hình
thành phức hợp kháng thể-kháng kháng thể và xuất hiện màu ở vạch 1 và/hoặc 2,
đồng thời kháng kháng nguyên đơn dòng ở vùng cộng hợp sẽ kết hợp với kháng
kháng thể gắn ở vạch C và cũng xuất hiện màu ở vạch này.
b.Quy trình :
- Lấy thanh thử nghiệm ra khỏi túi.

- Cho 1 giọt(25µl) dung dịch có hạt không gắn kháng nguyên(hạt kiểm chứng) vào
giếng số 2.
- Đậy phiến kính bằng tấm nhựa đặt lên máy lắc trong 5’, ủ ở nhiệt độ phòng sau
2h đọc kết quả.
c.Nhận định kết quả:
- Dương tính khi xuất hiện ngưng kết ở giếng số 3 và không có ngưng kết ở giếng
số 2.
- Âm tính chỉ khi không xuất hiện ngưng kết ở cả 2 giếng.
 Lưu ý: khi đọc kết quả thì bao giờ cũng đọc ở giếng số 2 trước.Giếng số 2
âm tính mới đọc sang giếng số 3.Nếu giếng số 2 dương tính(xuất hiện ngưng
kết) thì hóa chất không đảm bảo hoặc làm sai quy trình phải làm lại xét
nghiệm.
 Đây là một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho kết quả chính xác
cao.
1.3. Kỹ thuật Elisa HIV 1/2 (Murex):
Đây là một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho kết quả chính xác cao.
Nguyên lý của kỹ thuật ELISA ở phòng được thực hiện theo nguyên lý
“sandwich”

kháng nguyên được gắn ở đáy giếng và phức hợp tạo thành là phức
hợp miễn dịch KN

pha rắn – Kháng thể kháng HIV – KN gắn men, KT pha rắn –
KNHIV – KT gắn men .
Kỹ thuật này cũng được sử dụng theo nhiều KIT khác nhau và mỗi KIT của
một hãng

thì đều có một quy trình khác nhau.
Kết quả xét nghiệm HIV 3 phương pháp chỉ được trả dương tính khi cả 3
phương pháp đều cho kết quả dương tính.Nếu 1 trong 3 phương pháp dương