TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
  
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

GVHD: BÙI HỒNG QUÂN
LỚP: ĐHTP5 – NHÓM 5
SVTH: Lê Thị Mỹ Vân
MSSV: 09078531
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011
1
BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH
THỰC PHẨM
MỤC LỤC
Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp
tiệt trùng vi sinh vật 3
Bài 2: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật 6
Bài 3: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 10
Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học 16
Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 19
Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật 20
Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật 23
Bài 13: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp 35
Bài 14: Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc 37
Bài 15: Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN 39
Bài 19: Phương pháp định lượng E.coli trong thực phẩm 41
Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp. trong thực phẩm 43
Bài 21: Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm 46
Bài 22: Phương pháp phân tích định lượng Staphilococcus aureus
trong thực phẩm 48

của tế bào vi sinh vật.
- Que trãi: phân lập vi sinh vật theo phương pháp trãi đĩa.
3
- Que cấy:
+ Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vi khuẩn, nấm
men.
+ Que cấy nhón: dùng để cấy sâu trên môi trường rắn.
+ Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm.
- Micro pipette: sử dụng khi cần hút một lượng chính xác môi trường.
4.Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật?
Phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
a. Phương pháp lý học:
Nhiệt khô:
- Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt
trục tiếp trên ngọn lửa đèn cồn.
- Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói và sấy ở 160
0
C trong 1-2 giờ hoặc 180
0
C trong
30 phút.
Nhiệt ẩm:
- Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật
làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Chỉ diệt tế bào sinh dưỡng,
bào tử vẫn còn.
- Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh, không diệt bào tử và vi khuẩn hoại
sinh. Phương pháp này thường dùng ở nhiệt độ 70-75
0
C trong thời gian 10-15 phút.
- Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80

trình trao đổi chất nội bào.
• Phân loại môi trường dinh dưỡng
o Theo nguồn gốc
Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa,
khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám.
Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được
xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen,
EMB
Môi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên,
ví dụ như: PGA, giá đậu đường
o Theo trạng thái vật lý
Môi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được
sử dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật.
Môi trường đặc: cứ 1000ml môi trường có 15 – 20 Agar
Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar
o Theo công dụng
6
Môi trường phân lập
Môi trường tăng sinh
Môi trường nuôi giữ giống: nghèo dinh dưỡng
Môi trường thử nghiệm sinh hóa
2. Trình bày qui trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Bao gồm các bước sau:
• Chuẩn bị dụng cụ
• Cân hóa chất
• Phối chế tạo môi trường nuôi cấy
• Điều chỉnh độ pH của môi trường
• Phân phối môi trường vào dụng cụ
• Khử trùng môi trường
• Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri

5. Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên úp hay ngửa? Tại
sao?
Nên để ngửa bởi vì làm kín khu vực nuôi cấy, tránh lây nhiễm các vi sinh vật
khác và cũng tránh tiếp xúc với hơi nước.
6. Ý nghĩa của việc pha chế môi trường?
Chúng ta phải pha chế môi trường cho vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡng là hỗn
hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa- khử, áp
suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường để vi sinh vật có thể
sinh trưởng và phát triển một cách tối ưu nhất có thể.
Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng
thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng
7. Yêu cầu của một môi trường dinh dưỡng nuôi cấy?
Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH
phù hợp. có độ nhớt nhất định, không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng,
đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật.
8. Nêu ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy?
8
Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao
thịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất
khoáng. Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm B cũng như nguồn nitơ
và cacbon.
9. Có bao nhiêu loại peptone?
Có 3 loại peptone
o Từ động vật: chiết xuất từ thịt, cao thịt bò, dịch thuỷ phân một phần của thịt bò,
cazêin,… dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao thịt bò chứa các
axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất khoáng.
o Từ thực vật: chiết xuất từ đậu nành,….
o Nấm men: cao nấm men, Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm
B cũng như nguồn nitơ và cacbon).
10. Cơ chế làm trong nước của lòng trắng trứng

- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một
trong các kiểu sau:
+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch (hình 3.3a)
+ Theo những đường song song (hình 3.3b)
+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc (hình 3.3c)
Hình 3.1 Các kiểu cấy
trên thạch đĩa
10
Hình 3.2: Cách dàn vi sinh vật lên bề mặt môi trường
A – que gạt B – dàn bằng que gạt; C: Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn đều
bằng que gạt; D : Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn bằng que cấy
1.2. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
- Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.
- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên
- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp
theo:
+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu (hình 3.1)
- Hình chữ chi
- Hình vòng xoắn
- Hình vạch ngang song song
d
Hình 3.2: Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng
1.3. Phương pháp cấy trên thạch đứng: cấy sinh vật kị khí
• Sử dụng que cấy hình kim
• Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ.
• Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát
thành ống tuỳ yêu cầu.
• Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường

sinh vật.
e. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
12
Ưu điểm: thích hợp cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm men, vi
khuẩn, nấm mốc, vỉut, tảo và các dòng tế bào động vật. thời gian bảo quản lâu.
Nhược điểm: đầu tư kinh phí cho thiết bị, điện quá cao, rủi ro cháy nổ, không thích
hợp cho các chủng vi sinh vật hay dùng đến thường xuyên.
3. Trình bày nguyên tắc và mục đích của quá trình phân lập.
- Nguyên tắc: tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trong môi trường dinh
dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ.
- Mục đích: phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô lập chúng
nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau.
4. Muốn phân lập nấm men, nấm mốc, vi khuẩn thì nguồn mẫu cần chọn là gì?
Trả lời:
- Phân lập vi khuẩn: nguồn mẫu là cỏ khô cắt nhỏ.
- Nấm mốc: nguồn mẫu là cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô
- Nấm men: nguồn mẫu là bề mặt trái cây, dịch ép như táo, lê hoặc trong rượu nếp, bia,
nước mía.
5. So sánh sự giống và khác nhau của cách phân lập vi sinh vật hiếu khí và kị khí.
Trả lời:
- Giống nhau: nhằm phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô
lập chúng nhằm chọn lựa những giống vi sinh vật thuần khiết.Khác nhau:
Phân lập vi sinh vật hiếu khí Phân lập vi sinh vật kị khí
- Hút dịch mẫu đã pha loãng cho
vao dĩa petri có môi trường thích
hợp.
- Dùng que gạt thủy tinh phân phối
dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.
- Tiếp tục dùng que gạt mẫu cho
đều khắp mặt thạch đĩa thứ 2 rồi

kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh thô sơ cấp, ốc điều chỉnh
thứ cấp (vi cấp).
- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màng chắn sáng, nguồn
chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng hoặc kính chiếu sáng). Ngoài ra, ở kính dùng nguồn
chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện,
cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng.
b. Nguyên tắc hoạt động
14
Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đại
mẫu vật. Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu
bản có độ phóng đại lớn nhất. Độ phóng đại của kính phụ thuộc vào tiêu cự, tức bán
kính cong của thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng
đại càng lớn.
Có hai loại vật kính
• Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4,x10,x15,x40.
• Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90,x100.
Thị kính cũng có độ phóng đại phức tạp, gồm hai thấu kính, một hướng về phía
mắt người xem, một hướng về vật kính. Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật
kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn.
Độ phóng đại của kính = Độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính.
Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính x100, độ phóng đại của thị kính x10. Như vậy độ
phóng đại của kính : 100x10=1000 lần.
Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để
chọn kính hiển vi.
2. Có bao nhiêu loại kính hiển vi? Đặc điểm của từng loại?
Có 5 loại kính hiển vi.
- Kính hiển vi viền đen
Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào
xung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính.
Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng

16
BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT
Báo cáo thực tập
1. Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm
có màu đỏ vàng hay đỏ tía. Giải thích nguyên nhân?
Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ có màu xanh đen hay tím, còn vi
khuẩn Gram âm có màu đỏ vang (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl). Sở dĩ
có màu như vậy là do vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm có sự khác biệt về
thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương thì
có nhiều peptidoglycan (phức chất protein-đường) và các peptidoglycan này được liên
kết chặt chẽ với nhau từ đó có thể giúp cho tế bào kháng lại chất tẩy màu nên sau khi
rửa bằng cồn thì crystal violet không bị rửa trôi và vẫn giữ được màu tím, sau đó
nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, nhưng không có sự
thay đổi màu nhiều. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid ở nồng độ
cao cho nên chúng có thể hòa tan trong chất khử màu (aceton, alcohol,…) và bị rửa
trôi cùng với crystal violet (màu tím), sau khi nhỏ dung dịch tẩy màu, ta nhuộm them
bằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, lúc này vi khuẩn Gram âm có màu đỏ
vàng hay đỏ tía.
17
2. Nếu không nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn
Gram âm có màu gì? Tại sao?
Nếu không nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm sẽ
không có màu. Bởi vì ở giai đoạn tẩy màu bằng cồn đã rửa trôi crystal violet (có màu
tím) nên sau giai đoạn tẩy màu vi khuẩn Gram âm đã bị mất màu của crystal violet
được nhuộm ở trước đó. Hoặc trường hợp vi khuẩn Gram âm sẽ có màu tím cũng có
thể ở giai đoạn tẩy rửa, ta không tẩy màu cho đến khi giọt dung dịch cuối cùng chảy ra
khỏi phiến kính là không màu.
BÀI 6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT
1. Trình bày nguyên tắc và phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết?
Nguyên tắc:

c. Kỹ thuật hộp đổ:
- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa giống vi
sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri.
- Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguộ đến 45 - 55
0
C vào đĩa petri
đã cấy mẫu.
- Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống
được trộn đều trong môi trường cấy.
- Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên.
19
1.2. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiếu khí:
- Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí
trong môi trường.
- Để nguội môi trường còn 45 - 50
0
C.
- Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục
ống nghiệm.
- Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh nắp
trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí.
- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp.
- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng
que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp.
2. Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy?
Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy: trường hợp số vi khuẩn có trong mẫu ít thì
phải nuôi tích lũy bằng cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng và các điều kiện lý hóa
cần thiết hoặc bổ sung các chất ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật đi kèm.
3. Thế nào là chuẩn vi khuẩn thuần khiết (chủng sạch)?
Chuẩn vi khuẩn thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con,

Cơ chế phép thử: Vi sinh vật tiết enzyme tryptophannase chuyển hóa tryptophan trong
môi trường thành Indol. Indol sẽ kết hợp với para-dimethylaminbenzaldehyd trong
thuốc thử kovac’s tạo thành phức chất có màu hồng cánh sen.
Ý nghĩa:
• Phép thử cho biết các chủng loại vi sinh vật có khả năng tiết enzyme
tryptophannase, giúp ta định danh được một số chủng loại vi sinh vật.
 Là phản ứng giúp phân biệt
◦ E. coli (+) với Klebsiella (-)
◦ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+)
◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)…
 Đối chứng (+) Proteus rettgeri
(-) Serratia marcescens
22
Môi trường MR-VP
Chủng vi sinh vật
Kết quả, màu đỏ (Dương tính), màu vàng: (âm tính)
Chủng
Vi Sinh Vật
Môi Trường
2-4 ngày
Dương tính Âm tính
2. Phản ứng MR (methyl red)
 Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình
lên men glucose.
Cơ chế:
 Cơ sở sinh hóa:
◦ Chất chỉ thị pH: methyl red
◦ MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid
◦ MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị
chuyển hóa – môi trường dần trung tính

Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men
glucose.
24
Quy trình hóa học:
Ý nghĩa: Định danh vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình
lên men glucose, thường là gram (-)
4. Thử nghiệm Citrate
Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn
cacbon duy nhất.
 Cơ sở sinh hóa:
◦ VSV sử dụng citrate, sinh ra CO
2
làm kiềm hóa MT
◦ VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH
3
làm
kiềm hóa MT
25