Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
Trang 1
BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
1.Định nghĩa:
Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều
kiện có oxy phân tử
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí:
Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ
sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư
hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế
biến và bảo quản thực phẩm
Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất
lượng : 10
6
tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư
hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=10
6
tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu
hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 10
5
tế bào/g(ml) sữa bị
chua: 10
6
-10
7
tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;10
8
tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm
có mùi hôi không chấp nhận được;10
9
-10

lấy 1ml từ nồng độ 10
-1
đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc
ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10
-2
.Làm
tương tự với các nồng độ kế tiếp
Lưu ý khi pha loãng mẫu:
Trang 3
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
-Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực
phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm
nghiệm….
-Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải
vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện
tượng sai số
-Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều
Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu
Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp
Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2
đĩa/nồng độ
Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 45
0
C,đổ môi trường vào
các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu .Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đều
dịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môi
trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert
Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A
hoặc N.A
Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặc

).100
=>n=
4.Môi trường sử dụng
(2
0,1.2)
=21045 21000 cfu/g(ml)
4.1.Môi trường Nutrient Agar
Peptone :5.0g
Meat extract :3.0g
Agar :12.0g
Nước cất :1000ml
pH sau thanh trùng : 7.0 0.2
Hấp thanh trùng ở 121
0
C/15 phút
4.2.Môi trường Plate Count agar
Peptone :5.0g
Meat extract :2.5g
D(+) glucose :1.0g
Agar :14.0g
Nước cất vừa đủ :1000ml
pH sau thanh trùng : 7.0 0.2
Hấp thanh trùng ở 121
0
C/15 phút
4.3.Môi trường Sabouraund
Peptone :20g
Glucose :40g
Agar :20g
Nước :1000ml

động vật máu nóng.
*một số hình ảnh về coliform:
Fecal Coliform
375 x 294
Chromocult® Coliform Agar ES
297 x 300
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu
Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chi thị. Số lượng hiện diện
của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chi thi cho khả năng hiện
diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Số lượng coliforms cao thi khả năng
hiện diện của vi sinh vật gây bệnh khác cao.
Colifrorm chịu nhiệt( coliform phân):
Là thành phần trong hệ vi sinh vật đường ruột ơ người và các
động vật máu nóng.
Được xem là vi sinh vật chi thi mức độ vệ sinh trong quá trình
chế biến, bảo quản , vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chi
thi sư ô nhiễm phân trong môi trường.
Lên men đường lactose trong môi trường E.C ơ 44.5
o
C.
Có khả năng sinh indol 24h/44.5
o
C.
Kết quả sinh hóa nghiệm pháp imvic là + + - -
3.Quy trình kiểm tra
Phương pháp MPN :
Nguyên tắc:
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân , 2 nồng độ kế tiếp
nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống
durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sư sinh hơi

-2
. Sau đó lấy 1ml mẫu ơ
nồng 10
-2
cho vào ống nghiệm thư hai + 9ml nước vô trùng thu được ống
nghiệm có nồng độ 10
-3
. tương tư như trên ta thu được các ống nghiệm có
nồng độ 10
-4
, 10
-5
…
Bước 3:
Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ơ 3 nồng
độ liên tiếp(10
-1
,10
-2
,10
-3
) như sau : Mỗi nồng độ lấy 3 ống nghiệm. Cho vào
mỗi ống nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiệm sao
cho ngập ống durham. Ghi 3 nồng độ liên tiếp bên ngoài ống nghiệm(mỗi
nồng độ 3 ống nghiệm). Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ơ nồng độ 10
-1
vào 3 ống nghiệm có ghi nồng độ 10
-1
(chứa môi trường LT),tương tư cho
các ống nghiệm ơ những nồng độ tiếp theo. (hình 1.1) ủ ơ 37

chuông).
+ ống BGBL âm tính: không có hiện tượng gi xảy ra.
Bước 6:
Tính kết quả:
Tổng số coliform (cfu/g hoặc cfu/ml)= số MPN 10
n
n là số nguyên dương của nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy.
Bước 7:
Tư kết quả tính được, so sánh với tiêu chuẩn về an toàn vệ sinh thực
phẩm.
4. Môi trường sử dụng:
Môi trường BGBL 2% : là môi trường dùng để phát hiện và đếm
coliforms, coliforms phân, E.coli trong sữa, thực phẩm, nước.
Nguyên tắc:
Mật bò ( bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn gram
+
và
vi khuẩn gram
–
không phải coliform. Brilliant green có nồng độ đặc hiệu
nhằm ngăn vi khuẩn ki khi lên men lactose sinh trưởng ơ 44
0
C , Tránh được
hiện tượng dương giả, lúc này coliform phát triển làm đục môi trường và
sinh khi trong ống durham do lên men lactose.
5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm
Bình erlen, đèn cồn, que cấy vòng, ống nghiệm ,nồi autoclave, tủ sấy,
ống durham , micropipet, mẫu là tương ơt.
6.Kết quả thí nghiệm
_ _ _

có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột.
- Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai.
- Các chủng gây lây nhiễm đường ruột.
1.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.coli trong mẫu thực phẩm.
Ở đây, nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt.
2. Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ
kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có
ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống. Theo dõi sự sinh
hơi trong từng ống nghiệm. Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha
loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng
hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu.
3.Dụng cụ và hóa chất:
3.1.Thiết bị và vật liệu:
- Tủ ấm
- Bể điều nhiệt
- Máy lắc
- Cân
- Pipet tiệt trùng
- Các bình chứa mẫu vô khuẩn
- Các lọ phục vụ cho mực đích pha loãng, có nút đậy
- Mẫu thực phẩm kiểm tra
- Ống durham
3.2.Môi trường và hóa chất:
- Môi trường E.C broth
- Môi trường Lauryl tryptose( LT)
- Môi trường endo agar
- Môi trường E.M.B agar (eosin methylene – blue lactose sucrose agar).
- Môi trường N.A (nutrient agar)
4.Tiến hành thí nghiệm:
Bước 1: Lấy mẫu

10
-3
10
-4
9ml NaCl 9ml NaCl 9ml NaCl
(nước vô trùng) vô trùng vô trùng vô trùng
10ml 1ml 1ml 1ml
10g mẫu
Stomacher
90
Tiến hành tương tự cho các mẫu pha loãng khác
Những điều lưu ý khi pha loãng mẫu:
- Khi pha loãng mẫu nên dùng nước muối vô trùng nhằm tạo môi
trường dinh dưỡng cho vi sinh vật, nếu chỉ dùng nước cất vô trùng
vi sinh vậy sẽ chết khi để lâu bên ngoài mà không có môi trường
dinh dưỡng.
- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. Các
dụng cụ phải được vô trùng.
- Khuấy trộn đều dung dịch mẫu trước khi pha loãng để vi sinh
vật phân tán đều trong mẫu.
- Tế bào ở các độ pha loãng khác nhau cần được lấy với các pipet
khác nhau nhằm tránh các tế bào ở độ pha loãng trước lẫn với các
tế bào ở độ pha loãng sau.
- Nồng độ pha loãng còn phụ thuộc:
Đặc điểm của thực phẩm(thời hạn sử dụng, điều kiện bảo
quản, quy trình chế biến ).
Người kiểm phẩm ( kinh nghiệm, thao tác ).
Bước 3 : Nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose ( LT)
Tiến hành nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Trytose ở 3 nồng độ
liên tiếp, 3 ống/ nồng độ, 1ml dịch pha loãng/ ống LT. Ủ 37ºC/24h.

Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar
và E.M.B agar:
Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.
Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành phân lập vi khuẩn
trên môi trường endo agar và E.M.B agar
Sau khoảng thời gian trên lấy ra đem nhận diện khuẩn lạc điển hình:
- Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại
- Môi trường E.M.B agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánh
kim.
Bước 5 : Từ các khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A. Ủ
37ºC/24h.
Buớc 6 : làm nghiệm pháp imvic với vi khuẩn đã cấy ở bước 5
I : indol
M :methyl red
V : V.P
C : simon citrat
Phản ứng sinh hóa kiểm tra sự có mặt của trực khuẩn đường ruột Gr–
có khả năng sử dụng simon citrat
Kết quả :
+ + - - : E.coli type I
- + - - : E.coli type II
BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
1. Đặc điểm của Stapylococcus aureus:
1.1. lịch sử:
Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có
mủ.Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu.
1.2. Phân bố:
Được phân bố rộng rãi, có nhiều trong sản phẩm động vật như
thịt, sữa…
Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi.

trong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng. Loại này thường có tính
chất cục bộ, ít có khả năng truyền nhiễm
Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy có
vsv gây bệnh.
Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực
phẩm đó bị ngộ độc).
Bản chất của ngoại độc tố là protein nên chúng kém chịu nhiệt (trừ
độc tố của Staphylococcus aureus) và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc
hiệu(tính kháng nguyên mạnh) do vậy có thể phát hiện được bằng phản ứng
kháng nguyên – kháng thể.
Độc tố gây viêm dạ dày, viêm ruột. Type A và D gây ngộ độc thực
phẩm cho người.
Triệu chứng bệnh:
Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 30’- 6h (phụ thuộc
vào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng đau thắt
bụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h, kiệt sức ở mức nghiêm trọng,
đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn tay chân.Sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72 h, nạn
nhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội.
Ít thấy vi khuẩn trong phân người bị ngộ độc.
Là độc tố bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tố
này. 100
o
C/30’; 137
o
C/9’độc tố này vẫn còn hoạt lực.
Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như Jambon, kem tổng hợp,
nước súp (ít khi được sử lý ở nhiệt độ >40
o
C) và các loại thuỷ sản, thực
phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv này.

màu đỏ. Ủ 37
o
C/ 24h. Sau đó đọc kết quả:
-Ống tăng sinh âm:có môi trường MSB vẫn giữ màu đỏ
-Ống tăng sinh dương: Có môi trường MSB chuyển từ đỏ sang vàng.
Bước 3: từ ống tăng sinh dương, cấy phân lập lên môi trường baird parker
agar (hoặc MSA). Ủ 37
o
C/24h.
Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình.
Trong môi trường Baird Parker: Sta. Aureus có đặc điểm tròn,
lồi, có tâm đen, bóng vun có vòng sáng quanh khuẩn lạc.
Trong môi trường MSA : môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, vi
khuẩn tròn, bóng.
Bước 5: Từ khuẩn lạc điển hình làm phản ứng pastorex, staphylatex, đọc kết
quả.
Bước 6: Kết luận.
3.2 Quy trình kiểm tra định lượng.
Bước 1: đồng nhất mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml
nước vô trùng .stomacher.
Bước 2:pha loãng mẫu tới các nồng độ thích hợp.
Bước 3:nuôi cấy 0.1 ml dịch mẫu /đĩa. 3 đĩa/ nồng độ, tiến hành thao tác
bằng que cấy trang. Nuôi cấy dịch mẫu trên môi trường baird parker. Ủ
37
o
C/ 48h.
Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình. Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình và 5
khuẩn lạc không điển hình rồi cấy chúng từ môi trường BPA sang môi
trường TSA.Ủ 37
o

=số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ số khuẩn lạc điển hình
được thử nghiệm
h
a
=số khuẩn lạc không điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ khuẩn lạc điển
hình được thử nghiệm
Chú ý : nếu số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng 20 – 200, đếm số khuẩn
lạc điển hình và không điển hình, sau đó tính kết quả như công thức trên và
ghi rõ trong biểu mẫu.
3.3 phản ứng sinh hoá Saulatex
Dùng để định danh cả giống và loài Sta.aureus.
Quy trình:
Bước 1:lấy dd muối vào tiêu bản
Bước 2: lấy Sta.aureus vào giọt nước muối trên tiêu bản , trộn đều nhuyễn.
Bước 3: lấy 1 giọt saulatex vào bên cạnh giọt nước muối .
Bước 4: kéo 2 giọt nước lại trộn đều với nhau .
Bước 5: Đọc kết quả:
- phản ứng dương tính:có màu trắng sữa,lợn cợn những hạt nhỏ
-phản ứng âm tính:màu trắng sữa như ban đầu
4. Mở Rộng :
4.1 môi trường sử dụng:
Môi t

rư ờ ng Chap m

an aga r (m

an i t

ol s alt aga r ):