MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
Phần 1 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI
1.1. Chất thải nguy hại
1.2. Quản lý chất thải nguy hại tại Việt Nam
1.3. Xử lý sinh học chất thải nguy hại
Phần 2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ XỬ LÝ SINH HỌ CHẤT THẢI
NGUY HẠI
2.1. Vi sinh vật và kỹ thuật phân tử ứng dụng trong sử lý sinh học chất thải nguy hại
2.2. Tiềm năng sử dụng các phương pháp sinh thái học vi sinh vật mức độ phân tử để
xử lý sinh học chất thải nguy hại
Phần 3 KẾT LUẬN
TAI LIỆU THAM KHẢO
MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học có thể được định nghĩa là “ứng dụng nguyên lý kỹ thuật và
khoa học trong việc xử lý các vật liệu bằng tác nhân sinh học để cung cấp sản phẩm
và phục vụ”. (Cator,2000). Trong lịch sử, công nghệ sinh học đầu tiên sử dụng nấm
men để lên men bia, rượu, váuwr dụng vi khuẩn để tạo sữa chua. Năm 1972, là năm
sinh ra công nghệ DNA tái tổ hợp đã đưa công nghệ sinh học tới một tầm cao mới và
hình thành một nền công nghiệp mới. sự tiến bộ trong công nghệ sinh học đã thực sự
được ghi nhận. Trong vòng 4 năm khám phá ra kỹ thuật DNA tái tổ họp, các vi sinh
vật chuyển gen (GMOs) đã tạo ra insulin nguời, interferon, và hocmon sinh trưởng
người. Ngày nay, công nghệ DNA tái tổ hợp và các sản phẩm của nó như GMOs được
ứng dụng rông rãi trong công nghệ sinh học môi truờng (Glick và Pasternark,1988;
Cowan,2000). Xử lý sinh học chất thải nguy hại là một trong những lĩnh vực phát
triển mạnh nhất trong công nghệ sinh học môi trường. Sử dụng xử lý sinh học chất
thải nguy hại để làm sạch môi trường rất được phổ biến nhờ chi phí thấp và được con
người chấp nhận. Thực sự, xử lý sinh học chất thải nguy hại đạt hiệu quả cao, nhanh
hơn nữa khi được hỗ trợ bởi kỹ thuật phân tử vốn đã được phát triển trong nhiều lĩnh
vực khác nhau trong công nghệ sinh học. Những năm 1990 là thập kỷ cho sinh thái vi
sinh vật phân tử phát triển. Việc áp dụng kỹ thuật phân tử giúp các nhà khoa học nhận

(khoản 1, điều 2, chương 1 Thông Tư 12/2006/TT-BTNMT).
1.1.2.Đặc tính của chất thải nguy hại
- Chất có khả năng gây cháy: chất có nhiệt độ bắt cháy <60
0
C, chất có thể cháy
do ma sát, tự thay đổi về hóa học. Những chất gây cháy thường gặp là xăng,
dầu, nhiên liệu, ngoài ra còn có cadmium, các hợp chất hữu cơ nhu benzen,
etybenzen, toluen, hợp chất hữu cơ có chứa clo…
- Chất có hoạt tính hóa học cao: Các chất dễ dàng chuyển hóa hóa học; phản ứng
mãnh liệt khi tiếp xúc với nước; tạo hỗn hợp nổ hay có tiềm năng gây nổ với
nước; sinh các khí độc khi trộn với nước; các hợp chất xyanua hay sunfit sinh
khí độc khi tiếp xúc với môi trường axit, dể nổ hay tạo phản ứng nổ khi có áp
suất và gia nhiệt, dễ nổ hay tiêu hủy hay phản ứng ở điều kiện chuẩn; các chất
nổ bị cấm.
- Chất có tính ăn mòn: Là những chất trong nước tạo môi trường pH < 3 hay pH
> 12,5; chất có thể ăn mòn thép. Dạng thường gặp là những chất có tính axit
hoặc bazo…
- Chất có tính độc hại: Những chất thải mà bản thân nó có tính độc đặc thù được
xác định qua các bước kiểm tra. Chất thải được phân tích thành phần trong các
pha hơi, rắn và lỏng. Khi có thành phần hóa học nào lớn hơn tiêu chuẩn cho
phép thì chất thải đó được xếp vào loại chất thải nguy hại. Chất độc hại gồm:
Các kim loại nặng như thủy ngân, cadmium, asenic, chì và các muối của chúng;
dung môi hữu cơ như toluen, benzen, axeton, cloroform…; Các chất có hoạt
tính sinh học (thuốc sát trùng, trừ sâu, hóa chất nông nghiệp…); Các chất hữu
cơ rất bền trong điều kiện tự nhiên nếu tích lũy trong mô mỡ đến một nồng độ
nhất định thì sẽ gây bệnh (PCBs: Poly Chlorinated Biphenyls).
- Chất có khả năng gây ung thư và đột biến gen: Dioxin (PCDD), Asen,
cadmium, benzen, các hợp chất hữu cơ chứa clo…
1.1.3.Nguồn gốc phát sinh chất thải nguy hại
Theo khoảng 2, Quyết định số 23/2006/QĐ-BTNMT, ngày 26/12/2006, Chất

TT
Mã số
BASEL
Nhóm loại Mô tả tính chất nguy hại
1
1.1
1.2
1.3
1.4
H 3
H 4.1
H 4.2
H 4.3
Chất thải dễ bắt lửa, dễ cháy (C)
Chất thải lỏng dễ cháy
Chất thải dễ cháy
Chất thải có thể tự cháy
Chất thải tạo ra khí dễ cháy
Chất thải lỏng có nhiệt độ bắt cháy dưới
60
o
C
Chất thải không là chất lỏng, dễ bốc cháy
khi bị ma sát trong điều kiện vận chuyển,
khi bị ẩm, bị ướt thì xảy ra tự phản ứng và
bốc cháy, cháy ở nhiệt độ và áp suất khí
quyển.
Chất thải có khả năng tự bốc cháy do tự
nóng lên trong điều kiện vận chuyển bình
thường, hoặc tự nóng lên do tiếp xúc với

khác khi tiếp xúc với không khí, tích lũy
oxy thì kích thích cháy các chất hoặc vật
liệu khác.
Chất thải hữu cơ có cấu trúc phân tử - O –
O - không bền với nhiệt độ nên có thể bị
phân hủy và tạo nhiệt nhanh.
5
5.1
5.2
5.3
H 6.1
H 11
H 10
Chất thải gây độc cho người và
sinh vật (Đ)
Chất thải gây độc tính cấp
Chất thải gây độc chậm hoặc
mãn tính
Chất thải sinh ra khí độc
Chất thải có chứa chất độc có thể gây tử
vong hoặc tổn thương trầm trọng khi tiếp
xúc qua đường tiêu hóa, hô hấp hoặc qua
da với liều nhỏ.
Chất thải có chứa các chất gây ảnh hưởng
độc chậm hoặc mãn tính, hoặc gây ung thư
do tiếp xúc qua đường tiêu hóa, hô hấp
hoặc qua da.
Chất thải chứa chác thành phần mà khi tiếp
xúc với không khí hoặc tiếp xúc với nước
thì giải phóng ra khí độc đối với người

H
2
SO
3
> H
+
+ HSO
3
-
> 2H
+
+ SO
3
2-
SO
3
2-
+ H
2
O > H
2
SO
4
+ Hơi axit gặp lạnh sẽ ngưng tụ thành sương mù axit, chúng tồn tại lơ lửng
trong không khí hoặc hấp thụ thêm hơi nước tạo thành những giọt axit
loãng H
2
O - H
2
SO

vật nuôi và làm giảm lượng sữa.
 Các hợp chất hữu cơ
+ Các hợp chất hữu cơ thường rất độc với cơ thể người và vật. Một số hợp
chất hữu cơ như Bezen và PAH (hợp chất cacbuahydro thơm đa nhân) có
thể là nguyên nhân gây bệnh ung thư.
+ Một số chất hữu cơ halogen là xúc tác cho quá trình phân hủy ozon ở tầng
bình lưu. Một số chất hữu cơ hoạt tính khác, lại xúc tiến cho quá trình phân
hóa vật chất và đặc biệt một số chất hữu cơ gây ô nhiễm do mùi như các
mecaptan và alđêhyt. Mùi này gây cảm giác khó chịu và đôi khi còn kèm
theo cả nhiễm độc và là nguyên nhân gây bệnh cho người.
+ Dioxin và furan là những chất rất độc. Ở hàm lượng thấp cũng gây các bệnh
về da, phụ nữ có thai khi tiếp xúc với với các chất này sẽ sinh con thiếu
tháng hoặc quái thai. Nhiễm độc nặng sẽ gây nên các bệnh về gan, máu, kể
cả ung thư và dẫn đến tử vong. Động vật bị nhiễm Dioxin và Furan sẽ giảm
trọng lượng tới 50% và sẽ chết trong vòng 2 – 3 tuần.
 Kim loại nặng
+ Kim loại nặng là khái niệm để chỉ các kim loại có nguyên tử lượng cao,
thường có độc tính đối với sự sống, và thường có liên quan đến vấn đề ô
nhiễm môi trường. Nguồn gốc phát thải của kim loại nặng có thể là tự nhiên
(như asen-As), hoặc từ hoạt động của con người, chủ yếu là từ công nghiệp
(các chất thải công nghiệp) và từ nông nghiệp, hàng hải (tràn dầu)…
+ Việc sử dụng nhiều loại chế phẩm trong công nông nghiệp làm nước và đất
ở nhiều vùng, nhất là trong cặn lắng của các dòng sông, bị nhiễm kim loại
nặng ở mức độ rất cao.
+ Có một số hợp chất kim loại nặng thụ động và đọng lại trong đất, song có
một số hợp chất có thể hoà tan dưới tác động của nhiều yếu tố khác nhau,
nhất là do độ chua của đất, của nước mưa. Điều này tạo điều kiện để các
kim loại nặng có thể phát tán rộng vào nguồn nước ngầm, nước mặt và gây
ô nhiễm đất.
+ Một số chất tẩy rửa gia dụng có chứa các tác nhân tạo phức mạnh (như

(V)
X
Lead – Pb – Chì XXX
Trẻ em: Chậm phát triển thể chất, trí tuệ và tinh
thần
Người lớn: Gây hại thận và tim mạch
Cadmium – Cd –
Cadmi
XXX
Ngắn hạn: Tiêu chảy, tổn thương gan
Dài hạn: Gây bệnh thận, tim mạch, gan
Nickel – Ni –
Niken
XX Dài hạn: Giảm cân, hại tim, phổi, gan
Nickel – Ni –
Niken
XX Dài hạn: Giảm cân, hại tim, phổi, gan
Selenium – Se XX
Rụng tóc, móng tay chân, ngón tay, ngón chân
và vấn đề tim mạch
Antimony – Sb XX
Tăng Cholesterol trong máu và giảm đường
huyết
Barium – Ba –
Bari
XX Tăng huyết áp
Cyanide (free) –
Syanua
XX Nguy hại hệ thần kinh
Chromium –

hóa của nước ta, gia tăng dân số và công nghiệp hóa như trên thì lượng chất thải nói
chung và chất thải nguy hại nói riêng sẽ tăng lên nhanh chóng. Việc xử lý chất thải
nguy hại này sẽ là một áp lực rất lớn với công tác bảo vệ môi trường ở nước ta hiện
nay và trong tương lai.
Theo số liệu điều tra của Cục Môi trướng, riêng tổng lượng chất thải rắn nguy
hại (CTRNH) phát sinh hàng năm chủ yếu tại 3 khu vực kinh tế trọng điểm chính là
Hà Nội, Hải Phòng, Quảng Ninh ở phía Bắc, thành phố Hồ Chí minh, Đồng Nai, Bà
Rịa - Vũng Tàu ở phía Nam và Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi ở miền Trung.
Trong đó, CTRNH phát sinh ở khu vực kinh tế trọng điểm phía Nam khoảng 80.332
tấn/ năm, lớn gấp 3 lần khu vực phía Bắc và lớn gấp 20 lần lượng phát sinh ở khu vực
miền Trung.
Theo Thống kê của Cục Môi trường, tổng lượng CTRNH phát sinh hàng năm
trên toàn quốc là 152.000 tấn, bao gồm chất thải của các ngành công nghiệp nhẹ
(60.000 tấn), hóa chất (45.000 tấn), cơ khí luyện kim (26.000 tấn), y tế (10.000 tấn),
chất thải sinh hoạt đô thị (5.000 tấn) và chất thải chế biến thực phẩm, điện - điện tử có
số lượng ít nhất trong số các ngành trên (2.000 tấn) nhưng lại chứa các chất hữu cơ
khó phân hủy như PCB và kim loại nặng, đó là các chất đặc biệt nguy hại tới sức khỏe
con người và môi trường.
Bên cạnh các chất thải của các ngành trên còn có chất thải từ thuốc bảo vệ thực
vật (BVTV) tồn lưu. Theo số liệu của Cục Môi trường và các sở công nghiệp địa
phương, chỉ trong 2 năm 2000 - 2001 , tổng lượng thuốc BVTV tổn lưu trên phạm vi
61 tỉnh/ thành phố là khoảng 300 tấn, trong đó thuốc BVTV dạng lỏng là 9.7.374 lít
thuốc BVTV dạng bột là 109.145 kg; các bao bì chứa thuốc BVTV 2.137.850 (bao
gồm cả hộp, chai và lọ).
Lượng chất thải rắn y tế phát sinh trên phạm vi toàn quốc theo ước tính của Bộ
Y tế năm 2001 là khoảng 12.500 tấn/ năm. Theo số liệu điều tra của Bộ Y tế cho thấy,
hiện nay có khoảng 61 lò đốt chất thải y tế được lắp đặt trên toàn quốc, trong đó có 41
lò đã đăng ký thẩm định và có 20/41 lò đạt đủ các yêu cầu về mặt kỹ thuật. Tính đến
tháng 6 năm 2002, tổng công suất xử lý của các lò là 30 tấn/ ngày. Tuy nhiên, tại
nhiều cơ sở y tế, CTRNH vẫn còn bị để lẫn với các chất thải khác tại khu vực chôn lấp

Và đây chỉ là một biện pháp tình thế. Vì vậy việc xây dựng các khu xử lý tập trung
các CTRNH đã và đang trở thành một trong những vấn đề rất cấp bách của công tác
quản lý chất thải.
Theo ông Phạm Khôi Nguyên – Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường, việc
xử lý CTRNH có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp như: xử lý cơ học, xử lý hóa
lý, xử lý nhiệt, chôn lấp Hiện nay một số nước như Na Uy, Thụy Điển, Nhật Bản,
Hàn Quốc , ngoài việc áp dụng các phương pháp trên đã nghiên cứu áp dụng phương
pháp thiêu đốt chất thải bằng lò nung clinke. Qua khảo sát của Cục Môi trường và Dự
án VCEP cùng một số cơ quan liên quan , đây là một phương pháp có một số ưu điểm
về mặt kinh tế và kỹ thuật. Phương pháp này đã tận dụng được nhiệt độ rất cao và thời
gian lưu cháy dài của lò nung clinke để phá vỡ các cấu trúc bền vững của CTRNH.
Hầu hết các loại chất thải hữu cơ dạng rắn và lỏng, kể cả các chất thải có chứa PCB
đều có thể thiêu đốt trong lò nung clinke. Tuy nhiên các chất thải này cần phải qua
cung đoạn chế thành nhiên liệu, chất phụ gia đạt các tiêu chí nhất định trước khi đưa
vào lò nung clinke. Việc thiêu đốt CTRNH trong lò cklinke có thể áp dụng cho rất
nhiều loại chất thải nguy hại như: các dung môi hữu cơ, dầu thải chứa PCB, sơn, keo,
dán vecni, plastic kể cả PVC, lốp cao su Quá trình cháy trong lò clinke sẽ phá hủy
cấu trúc của các chất nguy hại, tro xỉ còn lại tham gia vào cấu trúc thành phần xi măng
mà không gây ảnh hưởng tới thành phần của xi măng.
Ngoài ra, còn có các phương pháp xử lý CTRNH như trung hòa để xử lý chất
thải có tính axit hay kiềm ; xử lý nước thải để loại bỏ các chất vô cơ kim loại, xyanua,
sunfit trong nước thải và cả các chất hữu cơ; xử lý chất thải nguy hại lỏng/rắn bằng
cách rửa đất, chiết dung môi, lọc, hỏa luyện kim, thủy luyện kim, chưng cất. Hoặc
phương pháp cố định hóa: ổn định hóa/ hóa rắn. Quy trình này áp dụng cho CTRNH
chứa kim loại nặng hay kim loại trong chất thải phải được gắn với một chất nền không
rò rỉ. Người ta cũng có thể dùng công nghệ xứ lý sinh học: dùng vi sinh vật gây xúc
tác phản ứng hóa học định trước để chuyển hóa chất nguy hại, độc hại sang dạng đỡ
nguy hiểm hơn.
Chi phí cho xử lý chất thải nguy hại tùy thuộc vào thành phần, nồng độ chất
thải, phương pháp, công nghệ và thiết bị xử lý. Vì vậy, đối với từng loại CTNH khác

2
và H
2
, N
2
, H
2
S,
NH
3
.
Thông thường biện pháp sinh học ít và khó áp dụng để xử lý chất thải nguy hại do
tác động độc hại của độc thất đến cơ thể sinh vật. Tuy nhiên, ở hàm lượng và loại
thuốc BVTV nhất định, có thể sử dụng vi sinh để xử lý.
Xử lý thuốc bảo vệ thực vật bằng phương pháp sinh học là quá trình dùng vi sinh
vật để khử các chất thải độc hại nhờ các quá trình phân huỷ do sinh vật thực hiện, biến
đổi các chất ô nhiễm thành các sản phẩm ít độc hại như: CO2, H2O và một số chất
khác. Tuy nhiên, hiệu suất, tốc độ phân huỷ chất ô nhiễm thường thấp, thời gian xử lý
kéo dài. Để tăng tốc độ xử lý các chất ô nhiễm, người ta đã tối ưu hoá các điều kiện
sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật như: độ ẩm, nhiệt độ, pH, nồng độ oxy, và
một số cơ chất cần thiết
Điều kiện môi trường tối ưu cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển tất, tạo điều
kiện cho quá trình tiêu huỷ thuốc bảo vệ thực vật trong đất đạt hiệu quả cao là:
- pH của môi trường ủ vi sinh giới hạn trong khoảng 4 - 10; các vi khuẩn nấm mốc ưa
môi trường axit.
- Dinh dưỡng trong đất ủ đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và
phát triển của sinh vật, hàm lượng Nhỏ đạt từ 100 - 1000 mg/kg đất thì gây cản trở
phát triển của vi sinh. Ngược lại hàm lượng Nào từ 0 - 110 mg/kg lại thúc đẩy quá
trình phân huỷ của vi sinh.
- Nồng độ thuốc bảo vệ thực vật nhiễm trong đất cũng phải nằm trong giới hạn cho

số đa dạng trao đổi chất hiện có trong môi trường với lượng cơ chất đã định trước có
thể bị trao đổi (Juck và cộng sự, 2000). Những nghiên cứu như vậy có thể không đạt
được, tuy nhiên phản ánh được sự đa dạng vi sinh vật và các hoạt động diễn ra. Thực
sự, ít hơn 1% tất cả các vi sinh vật đã từng hoặc có thể được nuôi cấy trong phòng thí
nghiệm (Trevors,1997; Watanable và Baker,2000). Tập hợp vi sinh vật bao gồm công
nghệ sinh học môi trường như bùn hoạt tính và đất/trầm tích, là phức hệ, cho phép
chúng tác động lên đa dạng chất ô nhiễm. Vào đầu những năm 1990, khi kỹ thuật
phân tử được phát triển để tìm hiểu sinh thái vi sinh vật, các nhà nghiên cứu bắt đầu
phân tích các cộng đồng vi sinh vật thích hợp cho sự phân hủy chất ô nhiễm trong môi
trường (các vi sinh vật thân thiện với môi trường- ERMs) (Watanable và Baker,2000).
Vì vậy bắt đầu nghiên cứu tập hợp vi sinh vật sử dụng sinh học phân tử , như tách
AND đích từ mẫu môi trường và sau đó khuyếch đại xác định trình tự gen đặc hiệu.
Sau khi nhận diện, trình tự gen có thể đem so sánh với một dữ liệu lớn gồm rRNA
16S, trình tự các sinh vật được phân lập ban đầu. Hình 1 tổng kết các bước chính
trong việc mô tả tập hợp vi sinh vật trong mẫu môi trường bằng kỹ thuật phân tử,
nhưng ở hình 1 là kết quả có được khi sử dụng các phương pháp phân rử này để xác
định mối quan hệ phát sinh loài trong quần thể vi khuẩn phân hủy hydrocacbon.
Để phân tích các quần thể vi sinh vật, một số sự kết hợp các kỹ thuật phân tử đã
được áp dụng, như: Điện chuyển gel gradient biến tính (DGGE), PCR, TRFLP, lai
acid nucleic (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA) (Hazen và Jimenez,1988; Harry và
cộng sự, 2000). Những kỹ thuật này có những thuận lợi hơn những phương pháp
truyền thống vốn thiếu tính đặc hiệu và nhạy cảm cần thiết trong việc điều khiển xử lý
sinh học chất thải nguy hại. Các phương pháp dựa trên phân lập và xác định acid
nucleic của các cá thể mục tiêu khắc phục được những vấn đề này. Chúng có tiềm
năng có ích cho việc phát hiện và điều khiển sự duy trì thường xuyên và phân tán của
các vi sinh vật tự nhiên và các vi sinh vật phóng thích vào môi trường (Atlas và cộng
sự,1992). Sự kết hợp các phương pháp phụ thuộc vào nuôi cấy ( phương pháp truyền
thống) và không phụ thuộc vào nuôi cấy cũng như các kỹ thuật phân tử, hóa sinh cho
ta một con đường linh động để thiết lập đa dạng vi sinh vật trong mẫu môi trường.
Tính đặc hiệu cao, nhạy của phương pháp PCR phát hiện ra những trình tự DNA đặc

được trên gel agarose và so sánh với ngân hàng DNA. Nồng độ DNA được biểu thị
bằng nanogram/ gram trầm tích (đất) khô hoặc nanogram/ml nước (Pickup,1991). Kỹ
thuật phân tích trực tiếp này thuận lợi cho việc thu hồi DNA từ vi sinh vật hấp thụ
mạnh và ít bị đào thải bằng phương pháp tách chiết tế bào. Kỹ thuật phân tích trực tiếp
này cũng gặp phải trở ngại do mùn và độ pH trong đất được tách chiết.
Tất cả các phương pháp đều có mục đích thu được lượng DNA cao và đủ độ tinh
khiết cho việc phân tích phân tử bằng phương pháp lai DNA-DNA, phương pháp phân
tích đa dạng chiều dài các đoạn giới hạn cuối (TRFLP) hoặc phương pháp khuyếch
đại bằng phản ứng chuỗi polymerase. Các hợp chất mùn và đất sét trong nhiều mẫu
đất ức chế quá trình phân tích, và sự có mặt của chất keo collid làm cho việc tách chiết
DNA gặp vấn đề. Vì lý do này, thêm một bước tinh sạch trong sơ đồ quy trình phân
lập DNA là rất cần thiết (Sambrook và cộng sự,1989; Dijkmans và cộng sự,1993;
Volossionk và cộng sự,1995).
Việc phân lập DNA điển hình gồm các bước sau (Sambrook và cộng sự,1989;
Pickup,1991): 1. Phá hủy tế bào; 2. Tách DNA từ các thành phần tế bào như
polysaccharit và protein; 3. Tinh sạch DNA chiết rút từ các phần đất và các thành
phần như các axit humic, đất sét, hoặc ion; 4. Kết tủa DNA.
Như đã từng công bố 300ng DNA và gần 100 ng DNA có thể chiết rút từ 10 g
đất (Saano và Lindstrom,1995). Một vài phương pháp thu hồi DNA và kết quả chuyển
đổi của nó được chỉ ra trong bảng 4. Quá trình tinh sạch có thể kết hợp siêu li tâm
CsCl-EtBr , hydroxylapatite, hoặc sắc ký ái lực, chiết tách chloroform/ phenol, kết tủa
etanol, thẩm tách, hoặc xử lý bằng polyvinylpoly-pyrrolidone (PVPP) (Sambrook và
cộng sự,1989; Pickup,1991). Trong nhiều trường hợp, sơ đồ tinh sạch tiêu chuẩn
không thao tác được với mọi mẫu môi trường, và điều kiện yêu cầu phải thích ứng với
một cách phân tích riêng biệt. Một số tạp chí gần đây đã cho thấy tiến bộ của của sự
phát triển các phương pháp phân lập DNA (Holben và cộng sự,1988; Sayler và
Layton,1990; Pickup,1991).
Bảng 4:
PCR- phản ứng chuỗi polymerase
Sử dụng phương pháp PCR trong vi sinh học môi trường được công bố bởi Bej

3
lần so với mẫu không
được khuyếch đại. Chaudhry và cộng sự . (1989) cũng đã sử dụng phương pháp PCR
để phát hiện các vi sinh vật được thao tác gen như Pennisetum purpureum. Kết quả
phát hiện ra GMOs trong mẫu môi trường nhờ kỹ thuật PCR có trong nghiên cứu của
Jansson (1995) và Prosser (1994).
Vai trò quan trọng khác khi sử dụng kỹ thuật PCR là phân tích chuỗi RNA
ribosom để nhận diện và mô tả đặc điểm phát sinh loài của các vi sinh vật. Điều này
rất thuận lợi trong quá trình nghiên cứu sinh thái vi sinh vật. Xác định phát sinh loài
và tìm ra các vi sinh vật quan tâm ngay tại chỗ mà không cần nuôi cấy, công bố bởi
Amam và công sự (1995). Số lượng thông tin thu được hiện nay mà liên quan đến các
vùng khác nhau và được duy trì cao giữa rRNA 5S và 16S cho phép sự lựa chọn khá
đơn giản vị trí mục tiêu của các primer để khuyếch đại chuỗi gen rRNA mong muốn
(Olsen vầ cộng sự,1986; Lin và cộng sự,1997; Laupara và cộng sự,2000). Manz và
cộng sự (1994) đã chỉ ra làm thế nào các mẫu dò oligosachrit đặc hiệu có thể ứng
dụng xử lý tại chỗ các quần thể vi sinh vật trong mùn hoạt tính của 2 cây xử lý nước
thải . Trong bài báo khác, các tế bào vi khuẩn trong đất và mùn được phát hiện nhờ
phương pháp PCR (Tsai và Olson,1991). Jansson và cộng sự (2000) đã tổng kết sự
phát triển mà sử dụng các maker sinh học ( một trình tự DNA đưa vào cơ thể sinh vật
vốn khác nhau ở kiểu gen và kiểu hình để quản lý hiệu quả xử lý sinh học chất thỉa
nguy hại.
Một ví dụ khác sử dụng kỹ thuật phân tử trong xử lý sinh học chất thải nguy hại
là nhờ đặc tính của quần thể vi khuẩn trao đổi metan có tại vị vị bề mặt nước bị nhiễm
trichloroethylene (Bowman và công sự, 1993). Các vị trí bị nhiễm hydrocacbon
chlororinate, trichloroethylene (TCE), tetrachloroethylene (PCE) có thể đe dọa đến an
toàn nguồn nước uống. Sự khoáng hóa hoàn toàn TCE tạo ra CO2 có thể đạt được nhờ
kết hợp hoạt động trao đổi metan và trao đổi dị dưỡng của quần thể vi sinh vật. Từ lúc
vi sinh vật trao đổi metan được đưa vào tự nhiên, chúng được xem là phương tiện xử
lý sinh học chất thải ngay tại chỗ bị ô nhiễm. Đặc điểm của vi khuẩn trao đổi metan
bao gồm phân hủy TCE thực hiện nhờ tách chiết DNA và giải trình tự đầu dò của gen

được sử dụng trong xử lý sinh học tại chỗ.
Phát hiện và giám sát vi khuẩn đích
Sự phát hiện và giám sát các vi khuẩn đích, liên quan trực tiếp đến sự suy thoái
của các chất gây ô nhiễm, là rất cần thiết để theo dõi và tối ưu hóa của quá trình xử lý
sinh học. Các phát hiện ở mức độ đơn bào của các vi sinh vật cụ thể cũng được công
nhận là một kỹ thuật hiệu quả để phái hiện và liệt kê các vi khuẩn xác định trong một
phức hợp các quần thể vi sinh vật (45- 47). Các kỹ thuật phát hiện ở mức độ đơn bào
gồm:
Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ
Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ (FISH) với RNA ribosom (rRNA) được
gắn các đầu dò oligonucleotide (oligonucleotide probes) đã được sử dụng thành công
trong các nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật.
Các phân tử rRNA bao gồm các vùng bảo tồn cao xen kẽ với các vùng biến đổi
(48,49). Do đó các chuỗi rRNA thường được sử dụng để xây dựng các cây phân loại,
các trình tự của một số nhóm và loài vi khuẩn nhất định từ đó được xác định (50-52)
FISH liên quan đến sư lai hóa của tín hiệu huỳnh quang – các đầu dò
oligonucleotide đã được đánh dấu nội bào rRNA. Những tế bào có sự lai hóa đặc biệt
với các đầu dò có thể được nhận diện và đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang. Hiệu
quả hơn nữa, phân tích bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy cho phép xác định và
đếm một lượng lớn các các tế bào trong một thời gian ngắn (1.000 tế bào/giây) (45).
Tuy nhiên,vể độ nhạy của kỹ thuật FISH, khi sử dụng chuẩn FISH với FITC
đơn (mono-FITC) – các đầu dò được đánh dấu phát tín hiệu mạnh chỉ khi các tế bào
hoạt động trao đổi chất và do đó chứa một lượng lớn các rRNA (53-55).
Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ HNPP - FISH, sử dụng 2-hydroxy-3-
naphthoic axit 2’-phenylanilide phosphate (HNPP) và Fast Red TR. Kỹ thuật này có
tín hiệu huỳnh quang gấp 8 lần so với FITC - FISH
Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ sử dụng các đầu dò oligonucleotide được
đánh dấu ở Cy3 cũng có hiệu quả để làm tăng độ nhậy(59,60).
Hình 3: Nguyên tắc của các kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ.
Kỹ thuật PCR tại chỗ.

PCR - khuếch đại các phần 16S rDNA từ một quần thể vi sinh vật, về cơ bản có
cùng kích thước, có thể tách thành các dải đơn riêng rẽ trong quá trinh điện di trên gel