Application of fluorescent in situ
hybridization (FISH) to identify quickly some
marine toxic algae species in Vietnam

Luu Xuan Hoa

Hanoi University of Science,VNU; Faculty of Biology
Major: Genetics; Code: 60 42 70
Supervisors: Ass. Prof. Dr. Dinh Doan Long
Date of Presenting Thesis: 2011

Abstract. Tổng quan về kỹ thuật FISH: khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ
(FISH); tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam; các bước cơ bản
của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ FISH; đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo
biển độc hại nghiên cứu. Nghiên cứu về vật liệu và phương pháp nghiên cứu: địa điểm
thu mẫu và đối tượng nghiên cứu; phương pháp thu và lưu giữ mẫu; phương pháp phân
loại hình thái; phương pháp kiểm tra phân loại bằng AND và thiết kế đầu dò; phương
pháp lai huỳnh quang tại chỗ. Trình bày các kết quả nghiên cứu: kết quả phân lập và
phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái; ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh
khối vi tảo tạo nguyên liệu; kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên
cứu; tối ưu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò

Keywords. Di truyền học; Kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang; Tảo độc; Biển Content
MỞ ĐẦU
Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung và vi tảo biển độc hại nói
riêng, nhiều nhóm loài sinh vật rất khó hoặc hoàn toàn không thể phân loại đến loài nếu chỉ
bằng phương pháp so sánh hình thái. Sự giống nhau về nhiều đặc điểm hình thái bên ngoài và
khó nhận biết những đặc điểm khác nhau của chúng rất dễ dẫn đến nhầm lẫn trong nghiên cứu

vị các tế bào sinh vật trong mẫu môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh phẩm
Quy trình này bao gồm các bước cơ bản sau:
- Bước 1: Chuẩn bị mẫu và đầu dò có trình tự nucleotit bổ sung đặc hiệu với trình tự đặc hiệu
cần nhận biết.
- Bước 2: Cố định mẫu nghiên cứu.
- Bước 3: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào của mẫu.
- Bước 4: Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai (đầu dò tự do).
- Bước 5: Hiển thị, quan sát và phân tích kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang.
1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam
Cho đến nay, tại Việt Nam, kỹ thuật FISH chủ yếu được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh
vực y học. Một số nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật FISH đã
được tiến hành. Các nghiên cứu này được dựa trên các trình tự ADN đích thuộc các nhiễm sắc
thể nhằm phát hiện một cách chính xác các bất thường trên các nhiễm sắc thể (NST) tương ứng
với các bệnh di truyền được quan tâm (Đặng Thị Hồng Nhung và cộng sự, 2008). Trong một
số nghiên cứu khác, ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang được dùng để chẩn đoán trước
sinh hội chứng Đao, hội chứng Tớc-nơ cũng đã cho kết quả thành công. Kết quả nghiên cứu
cũng cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đã cho kết quả rất chính xác khi
so sánh với phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối (Trần Thị Thu Hương và cộng
sự, 2005; 2006). Bên cạnh đó, các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong việc phát hiện các
lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y từ tế bào dịch ối bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại
chỗ cũng đã thành công. Trên cơ sở phân tích các mẫu thu từ các phụ nữ mang thai giai đoạn
17 - 25 tuần có nguy cơ cao bị dị tật, kỹ thuật FISH đã giúp phát hiện 1 trường hợp mắc hội
chứng Patau (trisomy 13), 1 trường hợp mắc hội chứng Đao (trisomy 21), 1 trường hợp bất
thường cánh dài của NST 16. Kết quả cũng cho thấy 100% mẫu kết quả FISH phù hợp với kết
quả phân tích về NST liên quan đến các NST số 13, 18, 21, X, Y. Quy trình chuẩn nhằm chẩn
đoán trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm FISH an toàn cũng đã được hoàn thiện (Nguyễn
Thị Tân Sinh và cộng sự, 2011). Sử dụng kỹ thuật FISH nhằm phát hiện sự khuếch đại gen
NMYC trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đã được tiến hành tại các bệnh viện Nhi
trung ương và cho kết quả tốt đẹp. Một số biến đổi di truyền trong u nguyên bào thần kinh có ý
nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh, trong đó sự khuếch

2.3. Phân lập các chủng vi tảo
Theo phương pháp thu tế bào đơn lẻ bằng micropipet của Richmon (2004) và Andersen
(2005): Môi trường nuôi được sử dụng là môi trường IMK (Daigo IMK – mua từ hãng Nihon
Pharmaceutical Co., Ltd.) dành cho nhóm tảo giáp (Alexandrium).
2.4. Phƣơng pháp nuôi giữ các chủng vi tảo biển
Theo Shoko và cộng sự (2005); Nguyễn Văn Nguyên và cộng sự (2011):
- Cường độ chiếu sáng: 2.500 lux, bằng hệ thống ánh sáng trắng (đèn neon);
- Chế độ chiếu sáng: 13h sáng liên tục/11h tối liên tục, được điều khiển bởi đồng hồ đóng
ngắt tự động;
- Nhiệt độ nuôi: ổn định ở 24
o
C liên tục trong buồng có điều hòa nhiệt độ;
- Môi trường nuôi: IMK.
2.5. Phƣơng pháp phân loại hình thái
Phân loại các mẫu tảo giáp được thực hiện chủ yếu dựa vào công thức tấm vỏ tế bào đã
được nhuộm Calco - fluor, quan sát dưới kính hiển vi quang học. Các tài liệu chính để phân loại
là: Balech (1995), Abe (1967a,b), Larsen và cộng sự (2004).
2.6. Phƣơng pháp chuẩn bị ADN khuôn cho PCR
Các ống mẫu chứa tế bào được sốc nhiệt qua lại 3 lần giữa -20
o
C và 90
o
C trong thời
gian mỗi 20 giây ở mỗi điều kiện, nhằm làm vỡ tế bào và dung giải ADN ra ngoài. Các mẫu
được lắc rung (votex) và ly tâm trở lại (5.000vòng/phút) chuẩn bị cho phản ứng PCR (Sebastián
và cộng sự (2001).
2.7. Phƣơng pháp Singel cell PCR
Theo Sebastián và cộng sự (2001); Shoko và cộng sự (2005): Phản ứng PCR được tiến
hành 2 lần để nhân vùng D1 – D2 của gen mã hóa tiểu đơn vị lớn 28s ARN ribosome. Cặp mồi
dùng cho PCR lần 1: S1R (5’-TACCTGG TTGATCCTG CCAG-3’) và 28-1483R (5’-Hình dạng ngoài của tế bào (A); Tấm
1' với lỗ bụng và tổ hợp lỗ đỉnh (B, C); Tấm
S.a hình thang, không có phần phụ (D).

3.1.2. Loài A. pseudogonyaulax

3.2. Ảnh hƣởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu
Trong điều kiện nuôi có độ mặn 30‰ (cường độ chiếu sáng 2500lux, chế độ chiếu sáng
13 giờ sáng: 11 giờ tối) loài A. affine phát triển tốt nhất trong các chế độ nuôi cấy. Đối với loài
A. pseudogonyaulax, kết quả thí nghiệm cho thấy, điều kiện về độ mặn thuận lợi nhất cho sự
sinh trưởng và phát triển của chúng với những điều kiện phòng thí nghiệm như đã nêu trên là ở
29‰.
3.3. Kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu
Ở mỗi mẫu thí nghiệm, đoạn mồi D1R, D2C đã nhân được một đoạn ADN duy nhất có
kích thước tương ứng với đoạn dự kiến. Vùng D1-D2 của mẫu L3 (xác định hình thái là A.
affine) có kích thước gồm 651bp. Đối với mẫu L4 (xác định hình thái là A. pseudogonyaulax),
vùng D1-D2 có trình tự bao gồm 650 bp. Kết quả phân tích BLAST 2 trình tự nói trên cũng đã
khẳng định hai loài này là A. affine và A. pseudogonyaulax.
3.4. Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang tại chỗ
Phần mềm Bioedit được sử dụng để sắp xếp, so sánh với các trình tự tham khảo (từ
3.6. Thử nghiệm đầu dò với các mẫu vi tảo thu ngoài tự nhiên
Nhằm hoàn thiện ứng dụng kỹ thuật này, thử nghiệm lai huỳnh quang với các mẫu thu
ngoài tự nhiên đã được tiến hành với nhiệt độ lai ở 43°C. Kết quả cho thấy, trong số 32 mẫu thu
từ biển Cát Bà, đầu dò cho loài A. affine đã phát hiện ra 17 mẫu có sự hiện diện của loài này
với mật độ tế bào khác nhau (Hình 3.11). Trong 15 mẫu còn lại, đầu dò không tìm được trình tự
đích nào. Trong khi đó, một số phân tích thành phần của mẫu thì chỉ thu được rất ít thành phần
loài của nhóm Alexandrium.

Quy trình lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) sử dụng đầu dò rARN có gắn tín hiệu FITC
đối với hai loài A. affine và A. pseudogonyaulax được tổng hợp lại và đề nghị như sau:
 Mẫu (5000-7000 tế bào/ml) được đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1
phút, 4
o

bào A. pseudogonyaulax dưới
ánh sáng thường (trái)
và được phát hiện với màu
xanh đặc trưng (phải)

- Thêm 1ml dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào
(3000vòng/phút trong 1 phút, 4
o
C).
- Thêm 1ml dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào
(3000vòng/phút trong 1 phút, 4
o
C).
 Thêm 500µl dung dịch lai (gồm: Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dò có gắn huỳnh
quang (50 pmol)).
 Lai tế bào ở 43°C trong 5 phút.
 Sau khi lai, mẫu được rửa 2 lần:
- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50
o
C trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào
(3000vòng/phút trong 1 phút, 4
o
C).
- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50
o
C trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào
(3000vòng/phút trong 1 phút, 4
o
C).
Sản phẩm lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang

Tài liệu tiếng Việt

1. Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường (2005), “Ứng
dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để chẩn đoán trước sinh hội chứng down”, Tạp chí y học
thực hành, 11, tr. 9-11.
2. Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường, Nguyễn Thị
Quỳnh Thơ (2006), “Chẩn đoán trước sinh hội chứng Down, hội chứng Turner bằng kỹ thuật
lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối”, Tạp chí nghiên cứu y
học, 1, tr. 4-8.
3. Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hòa, Vũ Tuấn Nam, Vũ Minh Hào, Đinh
Thái Bình (2011), “Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh và
chuẩn xác một số loài tảo giáp độc hại”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học và công nghệ
biển toàn quốc lần thứ V, Quyển 4 - Sinh học và nguồn lợi biển, tr. 261-268.
4. Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc (2008), “Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang tại chỗ
trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Nhi Trung ương”, Tạp chí
nghiên cứu y học, 57, tr. 57-62.
5. Vũ Đình Quang, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai, Đinh Thị Hồng Nhung, Phùng
Tuyết Lan, Trần Đức Hậu, Trần Ngọc Sơn, Nguyễn Thanh Liêm (2010), “Đánh giá sự khuếch
đại gen NMYC trên bệnh nhân Neuroblastoma”, Tạp chí Nhi khoa, 3 (3), tr. 358-363.
6. Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu,
Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán
trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”, Tạp chí Y học lâm sàng, số đặc biệt, tháng
2, tr. 253-258.
7. Chu Văn Thuộc (2002), “Nghiên cứu thành phần loài, phân bố và thăm dò khả năng gây hại
của một số loài tảo độc hại (harmful algae) thuộc ngành tảo giáp (Dinophyta) ở vùng cửa sông,
ven biển miền Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sĩ ngành sinh học, Viện nghiên cứu hải sản.

Tài liệu tiếng Anh

8. Abé, T. H. (1967a), “The armoured Dinoflagellata: II. Prorocentridae and Dinophysidae

Hasle using species-specific DNA probes and WGA lectins and abundance of Pseudo-nitzschia
species (Bacillariophyceae) from Chinhae Bay”, Korea. Bot. Mar., 45, pp. 364 - 372.
21. Choi, B. K. (1994), “Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes from a
patient with severe destructive periodontitis”. Infect. Immun., 62, pp. 1889 – 1895.
22. Choong J. K., Yoshihiko S. (2005), “Molecular identification of toxic Alexandrium
tamiyavanichii (Dinophyceae) using two DNA probes”, Harmful Algae, 4, pp. 984 - 991.
23. Deere, D. (1998), “Evaluation of fluorochromes for flow cytometric detection of
Cryptosporidium parvum oocysts labelled by fluorescence in situ hybridization”, Lett. Appl.
Microbiol., 27, pp. 352 – 356.
24. DeLong, E. F. (1989), “Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the
identification of single microbial cells”, Science, 243, pp. 1360 –1363.
25. DeLong E. F., Taylor L. T., Marsh T. L. and Preston C. M. (1999), “Visualization and
enumeration of mMarine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes
and fluorescent in situ hybridization”, Applied and Environmental Microbiology, 65, pp. 5554
- 5563.
26. Felske, A. (1998), “In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in dutch
grassland soils”, Appl. Environ. Microbiol., 64, pp. 4588 – 4590.
27. Fuchs B. M., Syutsubo K., Ludwig W., Amann R. (2000), “In situ accessibility of
Escherichia coli 23S rRNA to fluorescently labeled oligonucleotide probes”, Appl. Environ.
Microbiol., 67, pp. 961 – 968.
28. Gersdorf H. (1993a), “Identification of bacteroides forsythus in subgingival plaque from
patients with advanced periodontitis”, J. Clin. Microbiol., 31, pp. 941 – 946.
29. Gersdorf, H. (1993b), “Fluorescence in situ hybridization for direct visualization of Gram-
negative an aerobes in subgingival plaque samples”, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 6, pp.
109 – 114.
30. Glockner, F. O. (1996), “An in situ hybridization protocol for detection and identification
of planctonic bacteria”, Syst. Appl. Microbiol., 19, pp. 403 – 406.
31. Glöckner F. O., Fuchs B. M. and Amann R. (1999), “Bacterioplankton compositions of
lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization”, Appl.
Environ. Microbiol., 65, pp. 3721 - 3726.Hallegraeff G. M., Anderson D. M., Cembella A. D.,

44. Langendijk P. S, Schut F., Jansen G. J., Raangs G. C., Kamphuis G. R., Wilkinson M. H.
F., Welling G. W. (1995), “Quantitative fluorescence in situ hybridization of Bifidobacterium
spp. with genus-specific 16S rRNA-targeted probes and its application in faecal samples”,
Appl. Environ. Microbiol., 61, pp. 3069 – 3075.
45. Larsen J. and Nguyen N. L. (2004), “Potentially toxic microalgae of Vietnamese waters”,
Opera Botanica, 140, 216p.
46. Llobet B., Rosselló M., and Amann R. (1998), “Microbial community composition of
wadden sea sediments as revealed by fluorescence in situ hybridization”, Appl. Environ.
Microbiol., 64, pp. 2691 - 2696.
47. Manuelidis L., Langer P. R. and Ward D. C. (1982), “High-resolution mapping of satellite
DNA using biotin-labeled DNA probes”, J. Cell Biol., 95, pp. 619 - 625.
48. Michael H., Ralph W., Georg H., Jutta F., Andrea W., Alexander R., Eberhard S., Siegfried
J., Christoph C. (2003), “COMBO-FISH: specific labeling of nondenatured chromatin targets
by computer-selected DNA oligonucleotide probe combinations”, BioTechniques, 35(3), pp.
564 – 577.
49. Miller P. E., Scholin C. A. (2000), “On detection of Pseudo-nitzschia
(Bacillariophyceae) species using whole cell hybridization: sample fixation and stability”, J.
Phycol., 36, pp. 238 – 250.
50. Miller P. E., Scholin C. A. (1996), “Identification of cultured Pseudonitzschia
(Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNAtargeted fluorescent probes”, J. Phycol.,
32, pp. 646 – 655.
51. Miller P. E., Scholin C. A. (1998), “Identification and enumeration of cultured and wild
Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNA-targeted fluorescent
probes and filter-based whole cell hybridization”, J. Phycol., 34, pp. 371 – 382.
52. Moter, A. (1998), “Molecular epidemiology of oral treponemes associated with periodontal
disease”, J. Clin. Microbiol., 36, pp. 1399 – 1403.
53. Niels B. R., Henrik F., Timothy G. F., Finn A., Bo T. (1996), “Distribution of bacterial
populations in a stratified fjord (Mariager Fjord, Denmark) quantified by in situ hybridization
and related to chemical gradients in the water column”, Appl. Environ. Microbiol., 62, pp. 1391
– 1404.

65. Wagner M., Schmid S. J., Trebesius K., Bubert A., Goebel W., and Schleifer K. (1998),
“In situ detection of a virulence factor mRNA and 16s rRNA in Listeria monocytogenes”,
FEMS Microbiology Letters, 160, pp. 159 - 168.
66. Werner M., Rudolf A., Wolfgang L., Marc V., and Karl H. S. (1996), “Application of a
suite of 16s rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the
phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment”, Microbiology, 142, pp.
1097 – 1106.
67. Yamaguchi, N. (1996). “Detection of specific bacterial cells with 2-hydroxy-3-naphthoic
acid-29-phenylanilide phosphate and Fast Red TR in situ hybridization”, Appl. Environ.
Microbiol., 62, pp. 275–278.
68. Ylmaz L. S., Hatice E. O., Noguera D. R. (2005), “Making all parts of the 16S rRNA of
Escherichia coli accessible in situ to single DNA oligonucleotides”, Appl. Environ.
Microbiol., 72, pp. 733 – 744.
69. Zarda, B. (1991), “Identification of single bacterial cells using digoxigeninlabelled,
rRNA-targeted oligonucleotides”, J. Gen. Microbiol., 137, pp. 2823 – 2830.