VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM CHÂU TẤN PHÁT
ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR
VÀ DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN
MÙI THƠM TRÊN CÂY LÚA
(Oryza sativa L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

1. GS.TS. Nguyễn Thị Lang
2. GS.TS. Bùi Chí Bửu

Cần Thơ - 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
ii

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu:”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR
và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” này là
của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án
Châu Tấn Phát

- Ban giám hiệu và tập thể thầy cô giáo trường đại học Nộng Nghiệp I -
Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều
trong suốt thời gian tôi theo học chương trình cao học tại đây.
- Phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu
Long, đã theo dõi, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như
thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- Bộ môn Di Truyền và Chọn Giống – Viện Lúa đồng bằng sông Cửu
Long, đã giúp đỡ về trang thiết bị cũng như hướng dẫn chuyên môn trong
suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
iv

- Bộ môn Công Nghệ Hạt Giống - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã
động viên và tạo điều kiện về thời gian giúp tôi có thể hoàn thành luận án
trong thời gian qui định.
- TS. Bùi Thị Thanh Tâm, TS. Phạm Trung Nghĩa đã đóng góp nhiều ý
kiến quí báu để hoàn thiện cho các môn học chuyên đề và luận án.
- Sau cùng, xin cảm thông sự hy sinh, chia sẽ và động viên của cha mẹ, em
gái, vợ và người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp góp phần
không nhỏ vào sự thành công của luận án.

Tác giả luận án
Châu Tấn Phát
v

MỤC LỤC Trang

Trang phụ bìa


3.2. Ý nghĩa thực tiễn 2

4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC
CỦA ĐỀ TÀI
4

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 4

1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm và một số yếu tố môi
trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa
4

1.1.2 Nguyên lý và yêu cầu trong chọn giống bằng MAS 9

1.1.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn BAC (Bacterial
Artificial Chromosome)
9

1.2 Ứng dụng thành tựu di truyền 15

1.2.1 Nghiên cứu di truyền gen mùi thơm trên cây lúa 15

1.2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng PCR
trong chọn lọc gen mùi thơm
19

1.2.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng BAC


3.1.1 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên bộ lúa mùa địa phương

47

3.1.2 Đánh giá kiểu gen mang gen mùi thơm bằng chỉ thị SSR
trên các giống lúa mùa
65

3.1.3 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên bộ lúa cao sản 68

3.1.4 Đánh giá kiểu gen mang gen mùi thơm trên các giống lúa
cao sản thử nghiệm
72

3.2 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen mùi thơm trên các giống sử dụng
làm vật liệu lai và quần thể con lai sau khi được lai tạo
76

3.2.1 Đánh giá mùi thơm trên các giống lúa bố mẹ 76

3.2.2 Phát triển quần thể của 20 tổ hợp lai 78

3.2.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình của các
giống lúa bố mẹ và các tổ hợp lai thế hệ F1
79

3.2.4 Phân tích sự biểu hiện di truyền mùi thơm ở quần thể cây
lai F1
82


Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
112

4.1 Kết luận 112

4.2 Đề nghị 113

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC viii DANH SÁCH BẢNG Số thứ tự Nội dung Trang

Bảng 2.1 Các chỉ thị phân tử đã sử dụng để nghiên cứu trong đề tài
luận án và trình tự mồi tương ứng
28

Bảng 2.2 Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống lúa được sử
dụng làm bố
29


Bảng 3.6 Một số giống lúa mùa chỉ thể hiện mùi thơm trên hạt và
thân
54

Bảng 3.7 Các giống lúa mùa thể hiện mùi thơm toàn diện trên cả
thân, lá và hạt
55

Bảng 3.8 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên lá, thân và hạt của 30
giống lúa cao sản thuộc bộ cao sản
69

Bảng 3.9 So sánh kiểu hình và kiểu gen trên 30 giống thuộc bộ lúa
cao sản
75

ix

Bảng 3.10 Cấp độ mùi thơm trên lá, thân và hạt của các giống lúa bố
mẹ
77

Bảng 3.11 Cấp độ mùi thơm trên lá và thân của các tổ hợp lai thế hệ
F1
78

Bảng 3.12 Mùi thơm trên thân, lá và hạt của quần thể F3 từ cặp lai
OM2517/OM3536
83

Bảng 3.20 So sánh kiểu gen và kiểu hình trên quần thể BC2F2 của tổ
hợp lai OM2517/OM3536 sau khi đánh giá bằng 2 chỉ thị
phân tử 25D10 và 31F5
111x

DANH SÁCH HÌNH

Số thứ tự Nội dung Trang

Hình 1.1
Bản đồ vật lý của Xa4 locus.
12

Hình 2.1 Thao tác khử đực bông lúa được thực hiện vào buổi
chiều trong nhà lưới
32

Hình 2.2a Thao tác thụ phấn 33

Hình 2.2b Thao tác gắn thẻ lai 33

Hình 2.2c Hạt lai thu được sau khi bông lúa đã được thụ phấn
thành công
33

Hình 2.3 Đánh giá mùi thơm trên lá 34


52

Hình 3.5 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên hạt
58

xi

Hình 3.6 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên lá
60

Hình 3.7 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên thân
62

Hình 3.8 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên thân, lá và hạt
64

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose
0.9%
66

Hình 3.10 Sản phẩm PCR với mồi RM223 67

Hình 3.11 Tỷ lệ các giống có mùi thơm trên thân, lá và hạt của
các giống lúa cao sản
71


OM2517/OM3536 có mùi thơm trên lá, thân và hạt
87

xii

Hình 3.20 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên quần thể BC2F2
của tổ hợp lai OM2517/OM3536 với chỉ thị RM223
88

Hình 3.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên quần thể BC2F2
của tổ hợp lai OM2517/OM3536 với chỉ thị SP6
89

Hình 3.22 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên quần thể BC2F2
của tổ hợp lai OM2517/OM3536 với chỉ thị
RG28FL-RB
90

Hình 3.23 Ba trăm tám mươi tư (384) dòng BAC phát triển
trong đĩa petri tương đương với 1 đĩa (plate)
92

Hình 3.24 Môi trường LB tại thời điểm 0 giờ (hình A) và 20
giờ (hình B) sau khi đã được chuyển dòng BAC
93

Hình 3.25 Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA BAC trên gel
agarose 0.9%
94



Hình 3.31 Bản đồ liên kết gen tại locus mùi thơm trên quần thể
BC2F2 từ tổ hợp lai OM2517/OM3536
106

Hình 3.32 Sản phẩm PCR của chỉ thị 25D10 trên quần thể
BC2F2 từ cặp lai OM2517/OM3536
107

Hình 3.33 Sản phẩm PCR của chỉ thị 31F5 trên quần thể
BC2F2 từ cặp lai OM2517/OM3536
108

BAC Bacterial Artificial Chromosome
BC Lai hồi giao (Backcross)
BES BAC-Ends Sequence
bp base pair
CHEF Contour-clamped Homogeneous Electric Field
cM centimorgan
cm centimeter
ctv cộng tác viên
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
E.coli Escherichia coli
EAP External Antisense Primer
EDTA Ethylene diamine tetra acetate
ESP External Sense Primer
ETS Expressed Tagged Site
F Forward
F1 Filial 1
F2 Filial 2
F3 Filial 3
fgr fragrant gene
FISH Flourescence in situ hybridization
FPC Fingerprinting Contig
FSTs Flanking Sequence Tags
I/E Integration/Excision
xv

IFAP Internal Fragrant Antisense Primer
INSP Internal Non-fragrant Sense Primer
IPTG Isopropyl thiogalactoside
IRRI International Rice Research Institute


SNPs Single Nucleotide Polymorphism
SSCP Simple Strand Conformation Polymorphism
SSR Single Sequence Repeat (microsatellite)
STRs Short Tandom Repeats
STS Sequence Tagged Site
TAE Tris Acetate EDTA
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris base, Boric acid, EDTA
TE Tris/EDTA
µl Microliter

1

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính nuôi
sống hơn 50 % dân số thế giới [62]. Trước đây, với điều kiện vật chất còn thiếu
thốn, lương thực không đủ ăn người ta chỉ có nhu cầu là ăn no. Nhưng ngày nay do
mức sống của người dân ngày càng nâng cao thì nhu cầu ăn no đã thay đổi, việc ăn
ngon, có dinh dưỡng cao dần dần trở thành nhu cầu quan trọng không thể thiếu đối
với con người. Mặt khác, ngày nay nước ta đã qua thời kỳ thiếu lương thực chuyển
sang thời kỳ sản xuất phải có lời và đang xuất hiện những mô hình sản xuất vừa có
lời, vừa bền vững trong môi trường sinh thái trong lành. Một trong những mô hình
này là làm lúa thơm đặc sản, do đó chất lượng gạo được xem như là một trong
những mục tiêu hàng đầu, trong đó mùi thơm được đánh giá rất cao trên thị trường
xuất khẩu gạo của thế giới. Sản lượng gạo thơm từ các giống lúa thơm cổ truyền
như: Tám Thơm, Nàng Thơm Chợ Đào, Séng Cù, Nếp Cái Hoa Vàng, Khao Dawk
Mali, Basmati, thì có rất ít không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường và khó mở rộng

- Đề tài đã góp phần bổ sung những dòng lúa có triển vọng biểu thị mùi thơm
thông qua ứng dụng những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết chặt với gen “fgr”
phục vụ cho việc phát triển những giống lúa thơm cao sản ở ĐBSCL.
- Với những kết quả đạt được từ việc khai thác thư viện BAC, đề tài đã tìm
và phân tích chỉ thị mới từ đó chuyển sang chỉ thị chứa đoạn gen mùi thơm phục vụ
cho chọn giống lúa.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu trên các đối tượng là các giống lúa mùa và các giống lúa cao
sản hiện đang được duy trì và nhân giống.
- Khai thác thư viện BAC DNA để xác định những dòng BAC chứa gen mùi
thơm.
- Phạm vi nghiên cứu:
+ Chỉ xác định nội dung có liên quan đến các chỉ thị phân tử liên kết
với gen “fgr” trên nhiễm sắc thể số 8 và ứng dụng kết quả trên để chọn giống lúa
cao sản có gen mục tiêu.
3

+ Phân lập được đoạn phân tử mang gen mục tiêu.
+ Chưa phân tích phổ chức năng (gene profile).
+ Chưa nghiên cứu được điều kiện để gen thể hiện (gene expression)
ở các qui mô khác nhau.
4
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài
1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm và một số yếu tố môi trường ảnh
hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa
1.1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm và sự thể hiện của chúng trên các bộ

giữ một vai trò quan trọng trong việc hình thành mùi thơm của cơm khi nấu. Mũi
của người có thể phát hiện được hợp chất thơm 2-acetyl-1-pyrroline ở nồng độ
0,007ppm. Do đó, đánh giá bằng cảm quan trong điều kiện nhất định và với những
người có khứu giác bình thường kết quả có thể tin tưởng được.[47]
Các tác giả Ahmed và ctv [31], Lin và ctv [74] đã khẳng định lại báo cáo của
Buttery và ctv [40], Paule và ctv [84] rằng 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính
tạo nên mùi đặc trưng cho các giống lúa thơm.
Bên cạnh đó, Buttery và ctv [38] đã phân tích lá của cây lá dứa (Pandabases
amaryllifolius) nhận thấy rằng thành phần bay hơi chính cũng là 2-acetyl-1-
pyrroline (2AP) và có một sự liên hệ rất mật thiết giữa chất 2-acetyl-1-pyrroline
trong lá của cây lá dứa và lúa thơm. Nồng độ của chất 2-acetyl-1-pyrroline trong lá
của cây lá dứa cao hơn gấp 10 lần trong lúa thơm và cao hơn gấp 100 lần trong lúa
không thơm.
Tóm lại, hiện nay có hai quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo.
Quan điểm thứ nhất cho rằng chất thơm được tạo ra từ các hợp chất aldehyde
(CHO) và keton (C=O) và các hợp chất với lưu hùynh. Quan điểm thứ hai cho rằng
chất thơm lúa gạo, do vòng ryrrol kiểm sóat tính thơm của chất 2-acetyl-1-pyrroline
[34]. Tác giả Kader và Delseny [59] cho rằng có sự khác nhau trong việc thể hiện
mùi thơm trên các bộ phận của cây lúa, hợp chất 2AP được thể hiện một cách tự
nhiên từ giai đoạn mạ cho đến khi chín và đặc biệt là trong giai đoạn hạt trưởng
thành trên các bộ phận của cây lúa ngoại trừ rễ, mùi thơm được tích lũy nhiều nhất
6

trên bộ phận hạt lúa. Bên cạnh đó, các tác giả Chen và ctv [42], Vanavichit và ctv
[102] cũng khẳng định mùi thơm không thể hiện hoặc thể hiện rất thấp không đáng
kể trên bộ phận rễ lúa.
1.1.1.2 Gen thơm
Li và Gu [71] cũng nghiên cứu về sự di truyền và vị trí của gen thơm trên
lúa. Sự lai thuận nghịch giữa các giống lúa thơm đã cho thấy rằng các gen của
chúng có alen với nhau.

cặp bazơ, nhưng sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline vẫn được xác định trong cả dạng
gạo và dạng cơm của những giống này. Sự mất đi 8 cặp bazơ trong locus fgr không
chỉ là nguyên nhân qui định mùi thơm mà còn có một đột biến khác đã điều khiển
sự tích lũy sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline. Protein tổng số 2-acetyl-1-pyrroline được
mã hóa bởi những gen đồng dạng fgr không biểu thị khác biệt có ý nghĩa so với
kiểu gen n-fgr. Một vài kiểu gen fgr, đặc biệt từ Nam Á mã hóa protein này với sự
tích lũy số lượng lớn 2-acetyl-1-pyrroline như Basmati. Sự đột biến tạo ra 2-acetyl-
1-pyrroline trong các giống lúa thơm n-fgr có thể được tạo ra một vài lần trong quá
trình thuần hóa và tiến hóa. Gen fgr và các alen khác liên quan tới 2-acetyl-1-
pyrroline đã qui tụ lại trong các giống lúa thơm ở Nam Á tạo ra các giống lúa đặc
sản cổ truyền có mùi thơm cao. Sự xác định nhiều đột biến đối với 2-acetyl-1-
pyrroline có thể xảy ra trong các chương trình chọn giống lúa để đa dạng nguồn di
truyền của 2-acetyl-1-pyrroline nhằm phát triển giống lúa có mùi thơm cao và chất
lượng tốt.
1.1.1.3 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi
thơm trên lúa
+ Nhiệt độ
Theo tác giả Juliano [57b] việc hình thành mùi thơm trong hạt tăng lên ở
nhiệt độ thấp trong suốt giai đoạn vào chắc của hạt. Giống lúa Basmati yêu cầu
nhiệt độ thấp (25
o
C ban ngày, 21
o
C ban đêm trong suốt quá trình trưởng thành) thì
tốt cho việc hình thành mùi thơm.

8

+ Đất
Nhân tố đất cũng ảnh hưởng đến mùi thơm và các tính trạng chất lượng khác