ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Lưu Xuân Hòa
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH)
NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI
BIỂN VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Lưu Xuân Hòa
1.1.1.
Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH 2
1.1.2.
Trình tự đích và đầu dò trong phép lai huỳnh quang tại chỗ 6
1.1.3.
Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang 9
1.1.4.
Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong vi tảo biển độc hại 13
1.2.
Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam 17
1.3.
Các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH 18
1.4.
Đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu 19
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ 25
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27
3.1.
Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái 27
3.1.1.
Loài Alexandrium affine 27
3.1.2.
Loài A. pseudogonyaulax 28
3.2.
Ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu 29
3.3.
Kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu 31
3.4.
Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang tại chỗ 35
3.5.
4.
FISH Fluorescent in situ hybridization Phép lai huỳnh quang tại chỗ
5.
FITC Fluorescein isothiocyanate Chất phát tín hiệu huỳnh quang
6.
ISH In situ hybridization Phép lai tại chỗ
7.
ITS Internal transcribed spacer Vùng đệm phiên mã
8.
LSU Large subunit Tiểu phần lớn
9.
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
10.
PSP Paralytic shellfish poisoning Chất độc gây liệt cơ
11.
rADN Ribosomal deoxyribonucleic
acid
Trình tự ADN mã hóa
ribosome
12.
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang
Hình 1.1. Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dò 12
Hình 1.2. Các bước cơ bản của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH 19
Hình 2.1. Sơ đồ phản ứng PCR nhân vùng D1-D2 của rADN 23
Hình 3.1. Một số đặc điểm hình thái của A. affine 27
Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của A. pseudogonyaulax 28
Hình 3.3. Ảnh hưởng của độ mặn tới sự sinh trưởng của tảo A. affine 30
Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ mặn tới sự sinh trưởng của tảo A.
pseudogonyaulax
nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, công tác nghiên cứu phân loại vi tảo biển
trong nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian. Những điều này đã gây
cản trở đối với công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá và quản lý nguồn lợi
sinh vật biển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm loài nói riêng.
Kế thừa các đặc tính ưu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và trên nền
tảng của kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang
tại chỗ (fluorescence in situ hydridization - FISH) đã được phát triển. Kể từ khi ra
đời, nó đã trở thành một công cụ mạnh trong nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ
các lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, mà cả trong các nghiên cứu về sinh thái
học, môi trường, trong chẩn đoán và nghiên cứu phát sinh loài. Kỹ thuật FISH ra
đời đã khắc phục được nhiều trở ngại trong nghiên cứu phân loại sinh vật. Các trở
ngại, như các vấn đề khó khăn do phân loại bằng hình thái, nhược điểm về thời gian
phân tích kéo dài, các yêu cầu đòi hỏi về lượng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi
trường nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc loài… có thể được khắc phục bằng kỹ thuật
FISH. Bên cạnh đó, bằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu không chỉ phân tích định
tính mà còn có thể định lượng chính xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân
bố hay mối tương quan với môi trường của các vi sinh vật. Kỹ thuật FISH đặc biệt
hữu ích trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du trong môi trường biển nói chung
và các loài tảo độc hại nói riêng.
Nhằm từng bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải quyết những khó khăn trong
phân loại các loài vi tảo độc hại biển, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật
phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại
biển Việt Nam”. Kết quả mong đợi của đề tài sẽ giúp cho việc nghiên cứu đánh giá,
quan trắc biến động các loài vi tảo độc hại, cảnh báo các hiện tượng ô nhiễm môi
trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh chóng và hiệu quả hơn.
2
3
bào hay tính toàn vẹn của các bộ phận bên trong tế bào. Trên cơ sở đó, một số cải
tiến kỹ thuật đã tiếp nối như việc ứng dụng các chất chỉ thị (reporter) dựa trên cơ sở
các enzym [33] hay sử dụng hệ thống đầu dò bằng vàng quan sát bằng kính hiển vi
điện tử [55]. Sau khi ra đời, ISH không ngừng được cải tiến nhằm nghiên cứu sự
tiến hóa của nhiễm sắc thể, phân tích các nhiễm sắc thể của các khối u, tế bào ung
thư bạch cầu và nghiên cứu di truyền học tế bào ở các loài.
Tuy nhiên, một số nhược điểm dễ nhận thấy của phương pháp ISH cũng đã
bộc lộ. Đầu tiên, rất nhiều vật liệu phóng xạ tự nhiên sử dụng cho đầu dò là kém
bền. Do các đồng vị phân rã theo thời gian nên hoạt động của đầu dò dễ bị thay đổi.
Thứ hai, mặc dù thông thường độ nhạy của phóng xạ tự ghi là cao nhưng mức độ
phân giải lại bị hạn chế. Thứ ba, để tạo ra tín hiệu có thể đo được trên film chụp X
quang thì mẫu cần phải có thời gian phơi nhiễm dài. Điều này làm chậm tiến trình
thí nghiệm, phân tích kết quả, gia tăng nguy cơ phơi nhiễm với người sử dụng.
Ngoài ra, vì kỹ thuật này đòi hỏi sử dụng nguyên liệu là các đồng vị phóng xạ nên
các đầu dò phóng xạ có giá thành cao; mặt khác đòi hỏi chúng phải được vận
chuyển, thao tác, lưu trữ và loại bỏ theo những quy trình rất nghiêm ngặt, phức tạp.
Vì những lý do đó, dù có nhiều ưu điểm nổi trội nhưng những hạn chế cơ bản trên
đã yêu cầu các nhà nghiên cứu cần phải tìm ra một biện pháp hiệu quả hơn. Có lẽ vì
vậy mà kỹ thuật ISH (với các đầu dò mang đồng vị phóng xạ) sau đó đã nhanh
chóng được thay thế bởi một kỹ thuật mới có nhiều ưu điểm hơn mang tên kỹ thuật
lai tại chỗ sử dụng các đầu dò axit nucleic có gắn tín hiệu huỳnh quang
(Fluorescence in situ hybridization - FISH). Với kỹ thuật FISH, các trở ngại về thời
gian thí nghiệm, độ phân giải và tính an toàn được giải quyết khá triệt để, mở đường
cho sự phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu, phân tích định lượng và cho những hình
ảnh tế bào sống động.
Những nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng tín hiệu huỳnh quang đầu tiên trong
phương pháp lai tại chỗ bắt đầu từ những năm 1980. Trong một nghiên cứu, các nhà
nhau trong tự nhiên, Llobet (1998) đã sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ như
một công cụ để các nghiên cứu về hệ vi sinh vật có trong trầm tích biển. Kết quả
cho thấy, gần 45% số tế bào vi khuẩn có trong đó thuộc nhóm ngành đã biết với
nhóm Cytophaga-Flavobacterium có trong hầu hết các lớp trầm tích [45]. Hay các
nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn bằng kỹ thuật FISH trong đại dương [31], trong 5
các tầng nước khác nhau tại vịnh Mariager Fjord, Đan Mạch [53], những nghiên
cứu hệ vi khuẩn ở trong sông [42], trong thủy vực trên núi cao có băng bao phủ
quanh năm [11], hay các nghiên cứu về Bacillus trong đất [26]…
Bên cạnh đó, kỹ thuật FISH cũng được ứng dụng rộng rãi trong y học.
Gersdorf (1993) đã tiến hành nghiên cứu hỗn hợp vi khuẩn phổ biến trong khoang
miệng người bằng phương pháp FISH qua đó đã tìm thấy có hơn 300 loài vi khuẩn
khác nhau, trong đó có nhiều loài rất phức tạp khi tiến hành nuôi cấy hoặc chưa
từng được nuôi cấy. Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên
quan đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này. Trong khi một số kỹ thuật nuôi cấy
chuyên biệt chỉ thu được rất ít thành phần loài trong sự đa dạng nhóm vi sinh vật
này. Những lợi ích khi sử dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện rõ trên những vi
khuẩn kị khí gram âm, như Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythus và
Prevotella intermedia có trong thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng
[28, 29]. Cũng thông qua kỹ thuật FISH, các phân tích sâu hơn đã cho thấy một số
lượng lớn và đa dạng về hình thái của các loại xoắn khuẩn trên các vết bẩn của
mảng bám răng có trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển
nhanh chóng của bệnh viêm răng [21, 52]. Trong một thử nghiệm lâm sàng với các
mẫu đờm và mẫu gạc họng, một tập hợp các đầu dò oligonucleotit được thiết kế để
dò tìm đặc hiệu đối với các mầm bệnh phân lập từ tế bào xơ gan của bệnh nhân
được tiến hành. Kết quả cho thấy, các đầu dò đã phát hiện nhanh chóng và chính
xác các vi khuẩn gây cấp tính ở bệnh nhân xơ nang, bao gồm Pseudomonas
từng locut gen, chúng được tạo ra từ một phần của gen. Do vậy, khi lai, chúng sẽ
kết hợp bổ sung với phần đặc hiệu đó của gen trên nhiễm sắc thể. Từ đó người ta có
thể xác định được chính xác vị trí trên nhiễm sắc thể mà gen đó tồn tại. Đối với các
trình tự đích là những đoạn lặp vùng tâm động hay vùng Alphoid, đầu dò được thiết
kế sẽ cho phép chúng ta tìm thấy vùng tương ứng bổ sung tại tâm động của các
nhiễm sắc thể. Trong nhiều trường hợp, các nhiễm sắc thể được đánh dấu bởi các
màu huỳnh quang khác nhau của đầu dò. Từ đó người ta có thể xác định được cá thể
có mang đúng số lượng các nhiễm sắc thể hay không. Đối với phép lai toàn bộ
nhiễm sắc thể, tập hợp những đầu dò nhỏ được sử dụng để lai cho từng đoạn ngắn
trình tự đích dọc trên nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể phát quang với các màu sắc 7
khác nhau của đầu dò giúp người ta có thể phân biệt được dễ dàng các nhiễm sắc
thể khác nhau thay vì phải căn cứ vào các vạch sáng tối trên nhiễm sắc thể theo các
phương pháp truyền thống. Mặt khác, chúng cũng giúp cho việc nhận biết dễ dàng
những bất thường trong cấu trúc của nhiễm sắc thể.
Trong một nghiên cứu của mình về bệnh bạch cầu (ABL), Michael đã tiến
hành thử nghiệm hệ thống tổ hợp các đầu dò oligonucleotit (COMBO) thông qua kỹ
thuật FISH nhằm nhận diện vùng ABL (gây bệnh bạch cầu) thuộc nhiễm sắc thể số
9 của người. Kết quả cho thấy hệ thống COMBO hoạt động rất hiệu quả và có thể
coi đây như một cách tiếp cận mới trong việc gắn nhãn đặc hiệu tại những vị trí cần
quan tâm của hệ gen người [48]. Các kết quả nghiên cứu thử nghiệm khác cũng chỉ
ra rằng để quá trình lai bổ sung được hiệu quả thì thông thường các trình tự này phải
ở giai đoạn chuẩn bị của nhiễm sắc thể trong nguyên phân hoặc trong giai đoạn gian
kỳ của tế bào [18, 19].
Mở rộng nghiên cứu, các nhà khoa học cũng đã sử dụng các tiểu phần ARN
ribosome (5s, 16s, 23s hoặc 28s) như các trình tự đích trong các thí nghiệm sử dụng
kỹ thuật FISH. Năm 1994, Trebesius cùng các đồng nghiệp của mình đã ứng dụng
haemolyticus, A. junii, A. radioresistens, A. lwoffii, A. johnsonii cũng dễ dàng được
ứng dụng thông qua kỹ thuật FISH [39].
Bên cạnh đó, các đoạn oligonucleotit với kích thước chỉ khoảng 15 - 30
nucleotit có gắn các nhãn tín hiệu khác nhau cũng được nghiên cứu thiết kế và sử
dụng làm đầu dò tìm các thành phần đích là phân tử mARN, rARN đặc hiệu trong
nhiều nghiên cứu [25, 65]. Xét về tính hiệu quả, trong kỹ thuật lai huỳnh quang tại
chỗ nguyên vẹn tế bào, các đầu dò oligonucleotit với trình tự ngắn lại có hiệu quả
tốt hơn trong khả năng xâm nhập vào tế bào và lai đặc hiệu với trình tự đích. Đối
với các trình tự đích thuộc các tiểu phần ribosome 5s, 16s, 23s hoặc 28s của vi
khuẩn, các loài thông thường được nhận diện bằng các đầu dò oligonucleotit. Chính
vì vậy mà các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH với đầu dò oligonucleotit cho các
mục đích xác định vi khuẩn, phân tích cấu trúc nhóm vi khuẩn, xem xét các mối
quan hệ tương tác về không gian và thời gian của các quần thể vi sinh vật trong môi
trường sống của chúng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm trong thời gian qua.
Trên thế giới, kỹ thuật FISH cũng đã được các nhà khoa học áp dụng trên các đối 9
tượng là những sinh vật phù du nước ngọt cũng như các loài phù du sống ven biển,
ngoài khơi và cả những loài thu được từ trầm tích đáy biển. Kỹ thuật FISH đã cho
thấy được ưu thế trong khả năng xác định nhanh chóng và chính xác số lượng rất
nhỏ các tế bào vi khuẩn cũng như có khả năng phát hiện được sự đa dạng phong
phú của các quần thể sinh vật này [11, 18, 31, 46].
1.1.3. Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang
Trong lịch sử phát triển kỹ thuật FISH, nhiều biến thể của tín hiệu (thuốc
nhuộm) gắn trực tiếp hoặc gián tiếp đã được đưa ra. Điều này cho phép các nhà
nghiên cứu có thể lựa chọn, tùy theo độ đặc hiệu, độ nhạy, độ phân giải, màu sắc
phát quang của đầu dò để thiết kế các đầu dò phù hợp với các điều kiện thí nghiệm
khác nhau. Đồng thời, việc đa dạng hóa các loại tín hiệu đánh dấu (đa dạng màu
Alexa488 Xanh lá cây 493 517
AMCA Xanh da trời 399 446
CY3 Đỏ 552 565
CY5 Đỏ 649 670
CY7 Tím 743 767
DAPI Xanh da trời 350 456
Fluoresscein Xanh lá cây 494 523
Rodamine Đỏ 555 580
TAMRA Đỏ 543 575
Texas Red Đỏ 590 615
TRITC Đỏ-cam 550 580
Trong kỹ thuật FISH người ta có nhiều cách để đánh dấu đầu dò. Tuy vậy,
việc đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò là cách thông dụng,
nhanh và rẻ nhất. Đồng thời, đầu dò được chuẩn bị theo cách này dễ dàng được phát
hiện vì không cần phải tiến hành các bước dò tìm sau quá trình lai. Trong đánh dấu
đầu dò, một hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp
với chuỗi polynucleotit/oligonucleotit trong suốt quá trình tổng hợp thông qua liên
kết amino ở đầu 5’ của đầu dò. Một cách khác, người ta cũng có thể sử dụng enzym
Terminal transferase để gắn các nucleotit đã được đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’
của đầu dò [52]. Ngoài ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate
(FITC) nếu được gắn vào đầu dò theo một dải thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu
so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp [23]. Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh
quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn chất huỳnh quang trên cả
hai đầu 3’ và 5’ [62]. Trong nghiên cứu của mình, Trebesius cùng các đồng nghiệp
(1994) đã sử dụng các đầu dò polynucleotit cho các trình tự đích 23s ARN ribosome 11
của vi khuẩn. Các đầu dò này không gắn tín hiệu phóng xạ mà được thay bằng dẫn
12
dấu với digoxygenin, song song với việc sử dụng hệ thống TSA là một giải pháp
tốt. Sự kết hợp này đã được ứng dụng thành công khi dò tìm và phát hiện trực quan
các loài Listeria gây độc [65]. Về khía cạnh khác, các đầu dò oligonucleotit với
trình tự ngắn lại có hiệu quả tốt hơn trong khả năng xâm nhập vào tế bào và lai đặc
hiệu với trình tự đích so với các đầu dò polynucleotit.
Để tăng độ nhạy của đầu dò trong kỹ thuật FISH, việc tính toán đến số lượng
bản sao của trình tự đích cũng là một giải pháp được tính đến nhằm khuếch đại tín
hiệu để có được hình ảnh rõ nét hơn. Trong nhiều trường hợp, các trình tự đích là
các rARN hay các mARN (thường có nhiều trong tế bào) được lựa chọn để sử dụng
với các đầu dò oligonucleotit mang được ít tín hiệu đánh dấu [18]. Hình 1.1. Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dò [18].
Gắn nhãn trực tiếp (a, b) và gián tiếp (c–e) của đầu dò sử dụng 1 phân tử chỉ
thị như digoxygenin (DIG) mà nó sau đó được phát hiện bởi kháng thể huỳnh
quang, horseradish peroxidase (HRP) sử dụng phức hợp fluorescein–tyramide như
một cơ chất cho sự khuếch đại tín hiệu bằng enzym theo hệ thống TSA, hoặc sự kết
hợp sử dụng các đầu dò polyribonucleotit với hệ thống TSA.
Như vậy, bằng kỹ thuật FISH, các nhà nghiên cứu không chỉ có thể phân biệt
được các vi sinh vật quen thuộc mà còn xác định được các vi sinh vật mới, chưa biết
Gắn nhãn vào đầu 5’ (a)
Gắn nhãn vào đầu 3’ (b)
Pseudo-nitzschia. Đây là những chi tảo biển có phân bố rộng, có thể bắt gặp ở nhiều
vùng biển khác nhau ở Việt Nam và trên thế giới. Chúng có khả năng sản sinh các
độc tố gây liệt cơ (PSP) và có thể gây chết người [45]. Mặt khác, rất nhiều loài vi
tảo có cấu tạo phức tạp và rất giống nhau về hình thái ngoài, do vậy thường dẫn đến
sự lẫn lộn về danh pháp giữa các loài trong cùng một chi. Điều này dẫn đến những 14
khó khăn rất lớn cho việc quan trắc, cảnh báo nguy cơ bùng phát và hạn chế những
tác hại của chúng trong tự nhiên. Tuy nhiên, kỹ thuật FISH ra đời và ngày càng
hoàn thiện đã phần nào giúp các nhà khoa học dễ dàng hơn trong việc rà soát và
phát hiện nhanh tảo độc hại và quan trắc, cảnh báo môi trường một cách hiệu quả
hơn. Phương pháp này thường được sử dụng trong các nghiên cứu quan trắc môi
trường biển cho các loài vi tảo độc hại, đặc biệt khi có những biến động bất thường
về môi trường và sự nở hoa vi tảo biển [59].
Một trong những thử nghiệm đầu tiên sử dụng các đầu dò phân tử như một
công cụ để phân loại các loài tảo độc hại được tiến hành bởi Anderson (1995). Kết
quả nghiên cứu này cho thấy độ nhạy của đầu dò lai huỳnh quang trong việc phát
hiện Pseudonitszchia pungens là rất tốt. Sự kết hợp giữa 2 loại đầu dò huỳnh quang
và đầu dò kháng thể làm tăng đáng kể hiệu quả hình ảnh thu được [15]. Năm 1996,
Adachi và đồng nghiệp đã sử dụng các kỹ thuật phân tử để phân loại hai loài A.
tamarense và A. catenella thuộc chi Alexandrium. Đầu dò ADN được thiết kế đối
với trình tự của ADN mã hóa ribosome (rADN) tại vùng ITS. Nhóm đối tượng được
tiến hành thử nghiệm bao gồm A. affine, A. insuetum, A. pseudogonyaulax, A.
lusitanicum, A. fraterculus, Gymnodinium mikimotoi, Prorocentrum micans,
Amphidinium carterae, Heterocapsa triyuetra, Heterosigma akashiwo, Chattonella
antiyua và Skeletonema costatum. Kết quả cho thấy, hai đầu dò cCAT-F1 và
cTAM-F1 chỉ bắt cặp tương ứng với các chủng khác nhau thuộc hai loài
Alexandrium catenella và A. tamarense. Ngoài ra, chúng không hề có phản ứng với
và một số điều kiện bảo quản của mẫu trước khi thí nghiệm. Đối với các mẫu sau
khi lai với đầu dò huỳnh quang được lưu giữ ở 4
o
C sẽ duy trì được sự phát quang
trong thời gian dưới 1 tuần [49]. Trong những nghiên cứu khác, các các tiểu đơn vị
của ribosome cũng đã được lấy làm các trình tự đích cho việc quan trắc Pseudo-
nitzschia thu thập từ vịnh Chinhae Bay (Hàn Quốc). Kỹ thuật FISH với các đầu dò
đặc hiệu đã được sử dụng gồm muD1, puD1, auD1, heD2-2, frD1, deD1, amD1.
Nghiên cứu này cũng cho thấy, một số đầu dò cho tín hiệu huỳnh quang yếu hơn
các đầu dò khác. Điều này được giải thích là liên quan đến trạng thái sinh lí của tế
bào [20].
Sau này, việc sử dụng các đầu dò phân tử phát huỳnh quang trong kỹ thuật
FISH để nhận dạng và phát hiện các loài tảo độc hại ngày càng phổ biến hơn. Đầu 16
dò được thiết kế dựa trên trình tự đích thuộc vùng D1- D2 của tiểu đơn vị lớn LSU
rADN của các loài vi tảo đã được thử nghiệm trong phép lai FISH đặc hiệu trên tế
bào nguyên vẹn. Các đầu dò ADN đặc hiệu cho 6 loài Alexandrium: A. tamarense,
A. catenella, A. affine, A. fraterculus, A. insuetum và A. pseudogonyaulax đã cho kết
quả tốt và không biểu hiện ở các phản ứng lai với các loài Alexandrium khác [43].
Cũng nghiên cứu về một số loài thuộc chi Alexandrium, một số nhà khoa học khác
cũng đã thành công trong việc phát triển phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ với
các đầu dò được thiết lập từ các trình tự đích thuộc rARN có trong tế bào A.
tamarense và A. catenella với cả mẫu nuôi cấy và mẫu tảo thu ngoài tự nhiên [63].
Một số thử nghiệm lai tại chỗ trên Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae) với các
đầu dò thiết kế các trình tự ARN và ADN đích đã cho thấy: đối với đầu dò rARN,
kết quả là các ARN trong tế bào chất được lai với đầu dò và làm cho toàn bộ tế bào
bắt màu xanh; còn với đầu dò ADN, đầu dò lai với ADN trong nhân nên chỉ có
17
khác nhau [17]. Với những ưu thế về độ chính xác, độ nhạy và tiết kiệm thời gian,
kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ vẫn được xem là một công cụ rất hữu hiệu cho
nhiều nghiên cứu sinh học.
1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam
Cho đến nay, tại Việt Nam, kỹ thuật FISH chủ yếu được nghiên cứu ứng dụng
trong lĩnh vực y học. Một số nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh
bằng kỹ thuật FISH đã được tiến hành. Các nghiên cứu này được dựa trên các trình
tự ADN đích thuộc các nhiễm sắc thể nhằm phát hiện một cách chính xác các bất
thường trên các nhiễm sắc thể (NST) tương ứng với các bệnh di truyền được quan
tâm [4]. Trong một số nghiên cứu khác, ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
được dùng để chẩn đoán trước sinh hội chứng Đao, hội chứng Tớc-nơ cũng đã cho
kết quả thành công. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật lai
huỳnh quang tại chỗ đã cho kết quả rất chính xác khi so sánh với phương pháp phân
tích nhiễm sắc thể của tế bào ối [1, 2]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật FISH trong việc phát hiện các lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y từ tế
bào dịch ối bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ cũng đã thành công. Trên cơ sở
phân tích các mẫu thu từ các phụ nữ mang thai giai đoạn 17 - 25 tuần có nguy cơ
cao bị dị tật, kỹ thuật FISH đã giúp phát hiện 1 trường hợp mắc hội chứng Patau
(trisomy 13), 1 trường hợp mắc hội chứng Đao (trisomy 21), 1 trường hợp bất
thường cánh dài của NST 16. Kết quả cũng cho thấy 100% mẫu kết quả FISH phù
hợp với kết quả phân tích về NST liên quan đến các NST số 13, 18, 21, X, Y. Quy
trình chuẩn nhằm chẩn đoán trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm FISH an toàn
cũng đã được hoàn thiện [6]. Sử dụng kỹ thuật FISH nhằm phát hiện sự khuếch đại
gen NMYC trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đã được tiến hành tại các
bệnh viện Nhi trung ương và cho kết quả tốt đẹp. Một số biến đổi di truyền trong u
nguyên bào thần kinh có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và
tiên lượng bệnh, trong đó sự khuếch đại gen NMYC được xem là yếu tố quan trọng
nhất đã được tìm thấy. Kết quả thành công này có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ các bác
- Bước 3: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào của mẫu. 19
- Bước 4: Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai (đầu dò tự do).
- Bước 5: Hiển thị, quan sát và phân tích kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang. Hình 1.2. Các bước cơ bản của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH
1.4. Đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu
Alexandrium affine được xác định là một trong số 31 loài tảo độc hại thuộc
phân chi Alexandrium nom. nud của chi Alexandrium (chi tảo Hai roi) trên thế
giới. Chúng được xác định có phân bố phổ biến ở vùng biển Việt Nam. Các kết quả
nghiên cứu trước đây cho thấy rằng chúng phát triển mạnh vào thời gian từ tháng 12
đến tháng 2 hàng năm và bắt gặp nhiều trong các thủy vực Thừa Thiên Huế. Loài
này cũng đã bắt gặp phát triển mạnh tại các vịnh Văn Phong, Cam Ranh (Khánh
Hòa) vào mùa khô thuộc các tháng 3 và 4. Một kết quả phân tích độc tố của loài này
Copyright: Tài liệu đại học ©