am
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN
TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM
SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
***
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
(ðã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 27/01/2010)
 * 
ð
ð
Ề
ỀT
T
À
À
I
IK
K
H
H
O

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ðỀ TÀI

STT

HỌ VÀ TÊN CƠ QUAN GHI CHÚ
01 ThS. Lê Xuân Tiến
BM KT Hữu cơ-Khoa KT Hoá học Chủ nhiệm ñề tài
02 PGS. TS. Trần Thị Việt Hoa 03 ThS. Phan Thị Hoàng Anh

04 KS. ðặng Thị Mỹ Lệ
05 KS. ðỗ Thị XuânVui XÁC NHẬN CHỈNH SỬA BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Theo góp ý của Hội ñồng nghiệm thu ngày 27/01/2010)
Tên ñề tài: Nghiên cứu tổng hợp 2 dẫn xuất imine curcumin và khảo sát hoạt tính
kháng oxi hoá, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư của chúng
Chủ nhiệm ñề tài: ThS. Lê Xuân Tiến
Cơ quan chủ trì ñề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
TT

Góp ý của Hội ñồng Chỉnh sửa của chủ nhiệm ñề tài Trang
1 Bổ sung tổng quan về phương
pháp tổng hợp các dẫn xuất imine.
ðã bổ sung 10
2 Hình 1.4. ðã sửa 12
3 In nghiêng các chữ latinh. ðã sửa 15

TÓM TẮT

Trang 1
TÓM TẮT
Curcumin – thành phần màu vàng chính trong củ nghệ Curcuma longa L. – có nhiều hoạt
tính sinh học như hoạt tính kháng oxi hoá, kháng viêm, kháng ung thư… Nhiều nghiên
cứu gần ñây ñã cải thiện hoạt tính sinh học của curcumin bằng cách biến ñổi cấu trúc của
nó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp 2 dẫn xuất của curcmin - isoxazolcurmin
và 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin (dẫn xuất mới), xác ñịnh cấu trúc và khảo sát hoạt
tính sinh học của hai dẫn xuất này. ABSTRACT
Curcumin, the main yellow constituent of Curcuma longa L. rhizome, possesses a wide
range of pharmacological activities, including antioxidant, anti-inflammatory and
anticancer properties. Recently, numerous studies hoped to achieve improved biological
activities of curcumin by structural modifications. In this study, we synthesized two
curcumin derivatives, including isoxazolcurcumin and 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin
(a novel curcumin derivative), determined their structures and investigated some
biological activities.

MỤC LỤC

Trang 1

Trang 2

3.2. Tổng hợp các dẫn xuất imine curcumin 27
3.2.1. Tổng hợp isoxazolcurcumin (IOZ) 27
3.2.1.1. Tính chất vật lý ñặc trưng của isoxazolcurcumin 27
3.2.1.2. Biện luận cấu trúc của isoxazolcurcumin (phụ lục 1) 28
3.2.2. Tổng hợp HBTC 31
3.2.2.1. Tính chất vật lý ñặc trưng của HBTC 31
3.2.2.2. Biện luận cấu trúc của HBTC (phụ lục 2) 32
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học (phụ lục 3) 35
3.3.1. Hoạt tính kháng oxi hoá 35
3.3.1.1. ðánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH 35
3.3.1.2. ðánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vitro – phương pháp MDA 37
3.3.2. Hoạt tính gây ñộc tế bào 39
3.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Trang 3

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
Cur : Curcumin
HBTC : 2-Hydrazinobenzothiazolecurcumin
IOZ : Isoxazolcurcumin
OD : Mật ñộ quang
HTCO : Hoạt tính kháng oxi hoá

Hình 3.2: Isoxazolcurcumin (A) và TLC của Isoxazolcurcumin (B) 28
Hình 3.3: Isoxazolcurcumin, C
21
H
19
O
5
N

(M=365) 29
Hình 3.4: HBTC (A) và TLC của HBTC (B) 31
Hình 3.5: HBTC, C
28
H
23
SN
3
O
4
(M=497) 33
Hình 3.6: Hoạt tính kháng oxy hoá của IOZ, HBTC, curcumin xác ñịnh theo phương
pháp DPPH 36
Hình 3.7: Hoạt tính kháng oxy hoá của IOZ, HBTC, curcumin xác ñịnh theo phương
pháp MDA 38
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang 5

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư 14

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện: 11/2008-11/2009
Kinh phí ñược duyệt: 80.000.000 VNð
Kinh phí ñã cấp: 80.000.000 VNð

Mục tiêu:
− Nghiên cứu phương pháp và ñiều kiện tổng hợp hai dẫn xuất imine
curcumin.
−
Khảo sát hoạt tính chống oxi hoá, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư
của các dẫn xuất imine curcumin tổng hợp ñược và so sánh với hoạt tính
sinh học của curcumin

Nội dung:
− Cô lập curcumin từ hỗn hợp curcuminoid trích ly từ củ nghệ vàng.
− Nghiên cứu tổng hợp hai dẫn xuất imine curcumin.
PHẦN MỞ ðẦU

Trang 7

−
Tinh chế và xác ñịnh cấu trúc của các dẫn xuất imine curcumin.
−
Khảo sát hoạt tính sinh học của imine curcumin và curcumin như khả năng
quét gốc DPPH, kháng quá trình peroxyde hóa lipid, kháng nấm, kháng
khuẩn, kháng ung thư.

Sản phẩm của ñề tài/dự án:
− Báo cáo khoa học về kết quả nghiên cứu tổng hợp imine curcumin và hoạt
tính sinh học của chúng.

Curcumin (cur): R
1
= R
2
= OMe, M=368
Demethoxycurcumin (DMC): R
1
= OMe, R
2
= H, M = 338
Bisdemethoxycurcumin (BDMC): R
1
= R
2
=H, M=308
Hình 1.1: Các thành phần của curcuminoid trích từ củ nghệ vàng
Curcumin có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, mạnh hơn so với vitamin E [3]. Curcumin
có khả năng ức chế in vitro và in vivo hiệu quả với sự tạo thành các dạng oxygene hoạt
ñộng (ROS) trong cơ thể như các anion superoxide, H
2
O
2
, gốc nitrite [4,5,6]. Các ROS
TỒNG QUAN

Trang 9

tham gia vào các cơ chế gây bệnh khác nhau trong cơ thể [7,8], do vậy thông qua hoạt
tính kháng oxy hóa , curcumin có khả năng khống chế sự phát triển nhiều loại bệnh tật
và các tác nhân gây hại khác nhau. Curcumin thể hiện khả năng ức chế mạnh với


Cấu trúc β-diketon cho phép curcumin thực hiện phản ứng ngưng tụ với các amine tạo
imine. Cơ chế phản ứng như sau:

Trong cơ chế phản ứng này, pH của hỗn hợp phản ứng có ảnh hưởng hết sức quan
trọng ñến hiệu suất imine hoá. Hiệu suất imine hoá kém khi pH hỗn hợp phản ứng quá
acid vì amine bị proton hoá, không tham gia phản ứng ái nhân trong giai ñoạn 1 hoặc
khi pH hỗn hợp phản ứng quá base vì không ñủ H
3
O
+
cho giai ñoạn tách nước ra khỏi
chất trung gian trong giai ñoạn 2. pH phản ứng tối ưu nằm trong khoảng pH=4-6.
Các dẫn xuất dị vòng pyrazole và isoxazole của curcumin ñược tổng hợp bằng phản
ứng giữa curcumin và amine, hydroxylamine tương ứng trong dung môi methanol,
ethanol…, ñiều chỉnh pH bằng các acid yếu hoặc base yếu như acetic acid,
triethylamine, potassium carbonate , phản ứng ñược thực hiện trong khoảng nhiệt ñộ
phòng cho ñến nhiệt ñộ sôi của dung môi [24-26].
Nghiên cứu của Sabari Dutta và các cộng sự [23] cho thấy curcuminsemicarbazone
(hình 1.2) thể hiện hoạt tính kháng quá trình peroxy hóa lipid của microsome gây ra
TỒNG QUAN

Trang 11

bởi bức xạ γ trong thử nghiệm TBARS (Thiobarbiturate reactive substances) tương tự
như curcumin. Cả curcumin và curcuminsemicarbazone ñều thể hiện hoạt tính ức chế
quá trình peroxy hóa này ở mọi liều dùng. Kết quả thử nghiệm khả năng khử proton và
khử electron thông qua phản ứng với các gốc azide (khả năng khử electron), gốc
methyl, peroxyhalocarbon (khả năng khử proton) cho thấy curcumin có tốc ñộ quét các
gốc tự do này nhanh hơn curcuminsemicarbazone. ðiều này có thể là do sự hiện hiện

NHO
O
H
OCH
3
O N
O
H
3
CO
N
NH
2
O
O
H
OCH
3
TỒNG QUAN

Trang 12

Nhóm nghiên cứu của Joong Sup Shim và các cộng sự [24] ñã tổng hợp một số dẫn
xuất hydrazinocurcumin (hình 1.3) và hydrazinobenzoylcurcumin (hình 1.4).
Hình 1.3: Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcuminoid
Hình 1.4: Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcuminoid
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hydrazocurcurcumin có hoạt tính ức chế tế bào BAEC
(bovine aortic endothelial cell), ngăn chặn tiến trình angiogenesis (một trong các tiến
trình phát triển của ung thư) cao hơn 30 lần so với curcumin (curcumin: IC
50

tetrazolium))
Hoạt chất
HA22T/VGH MCF-7 MCF7-R
IC
50
(µ
µµ
µM) IC
70
(µ
µµ
µM) IC
50
(µ
µµ
µM) IC
70
(µ
µµ
µM) IC
50
(µ
µµ
µM) IC
70
(µ
µµ
µM)
Curcumin
(1)

50
=3.25±0.6µM, CQ-R (chloroquine-
resistant: ức chế ký sinh trùng kháng thuốc chloroquine) IC
50
=4.21±0.8µM; pyrazole
curcumin: CQ-S IC
50
=0.48±0.04µM, CQ-R IC
50
=0.45±0.07µM; 3-nitrophenylpyrazole
curcumin CQ-S IC
50
=0.87±0.07µM, CQ-R IC
50
=0.89±0.10µM).
1.1.2. Trong nước
Theo kiến thức của chúng tôi, các nghiên cứu trong nước về curcuminoid chỉ mới dừng
lại ở việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học và ứng dụng của curcuminoid trong y dược
TỒNG QUAN

Trang 15

và thực phẩm, chưa có nhiều nghiên cứu về các dẫn xuất của curcuminoid. ðặt biệt là
dẫn xuất imine của curcuminoid, ñến nay có rất ít nghiên cứu về lĩnh vực này ñược
công bố tại Việt Nam.
Nghiên cứu về việc trích ly curcumin từ củ nghệ vàng có: ðào Hùng Cường, Nguyễn
ðình Anh (ðại học ðà Nẵng): nghiên cứu chiết curcumin thô từ củ nghệ vàng bằng
phương pháp kiềm hóa [34]; Lê Văn Hoàng, ðào Hùng Cường, Nguyễn ðình Anh (ðại
học ðà Nẵng): nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện sấy ñến hàm lượng curcumin của
củ nghệ vàng [35]; ðào Hùng Cường (ðại học ðà Nẵng): chiết tách curcumin từ củ

thư nói chung.
1.3.
Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu một cách ñầy ñủ hơn các hoạt tính kháng oxi hóa của các dẫn xuất imine
curcuminoid. Cung cấp thêm những thông tin mới về khả năng kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng ung thư của các dẫn xuất imine curcuminoid. Kết quả nghiên cứu ñạt ñược
sẽ ñịnh hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về các dẫn xuất curcumin và ứng dụng của
chúng trong y dược.
PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Trang 17

Chương 2:

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung nghiên cứu
- Cô lập curcumin từ hỗn hợp curcuminoid trích ly từ củ nghệ vàng.
- Nghiên cứu tổng hợp hai dẫn xuất imine curcumin.
- Tinh chế và xác ñịnh cấu trúc của các dẫn xuất imine curcumin.
- Khảo sát hoạt tính sinh học của imine curcumin và các dẫn xuất curcumin như khả
năng quét gốc DPPH, kháng quá trình peroxyde hóa lipid, kháng nấm, kháng
khuẩn, kháng ung thư.
2.2.
Cô lập curcumin
Hỗn hợp curcuminoid 3 thành phần (Viện dược liệu, Bộ y tế, Hà Nội) ñược kết tinh lại
3 lần với hệ dung môi nước/methanol 1/5. Phần tinh thể thu ñược sau quá trình kết tinh
ñược sắc ký cột (silica gel, dung môi CH
2
Cl

COONa chỉnh pH ñến 5.0

- ðun sôi hoàn lưu
- Thời gian: 16 giờ

Loại dung môi
Cô giảm áp
Rửa, chiết
Dung môi: ethylacetate + nước
Sắc ký cột
Isoxazolcurcumin

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Trang 19

thô. Sắc ký cột ñối với sản phẩm thô, thu ñược 306mg isoxazolcurcumin. Hiệu suất quá
trình tổng hợp isoxazolcurcumin: 61.71%.
2.3.1.2. Tinh chế isoxazole bằng sắc ký cột
Hoá chất, nguyên liệu: Methanol, dichloromethane (Chemsol Vina), sản phẩm
isoxazole thô (mục 2.3.1.1.).
ðiều kiện sắc ký cột:
- Aluminium oxide 60, 0.063-0.200 mm, trung tính (Merck) ñược hoạt hoá ở 110
o
C, 4
giờ trước khi nhồi cột.
- Cột sắc ký: ñường kính 25mm, chiều cao aluminium oxide trong cột: 15cm.
- Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: CH
2
Cl

Hình 2.2: Quy trình tổng hợp HBTC
Hoá chất sử dụng: curcumin (phân ñoạn curcumin tinh khiết từ sắc ký cột mục 2.2.),
2-
hydrazinobenzothiazole (Sigma, hàm lượng ≥97%), acetic acid (Trung Quốc),
ethanol (Chemsol Vina), nước cất.
Phương pháp thực hiện: Hoà tan 449 mg
2-
hydrazinobenzothiazole trong methanol,
chỉnh pH dung dịch về ~5.0 bằng acetic acid. Cho 500mg curcumin vào hỗn hợp trên.
Thực hiện phản ứng imine hoá trong 24 giờ, 60
o
C có khuấy trộn. Kiểm tra ñiểm dừng
phản ứng bằng bản mỏng silica gel 60G, F254 với hệ dung môi
dichloromethane/methanol 98/2. Sau phản ứng, cô giảm áp loại methanol, rửa sản
phẩm bằng trích ly ethylacetate/nước. Thu lớp ethylacete, cô giảm áp thu ñược cao sản
Cucumin,
2-hydrazinobenzothiazole
Imine hoá
Dung môi methanol
CH
3
COOH chỉnh pH ñến 5.0

- Nhiệt ñộ: 60
o
C
- Thời gian: 24 giờ

Loại dung môi
Cô giảm áp

2
Cl
2
/CH
3
OH 98/2.
- Hiện màu TLC: ñèn UV (254nm/365nm), H
2
SO
4
10% trong ethanol, hơi I
2
.
2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học
2.4.1. ðánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH
(Thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.Hồ Chí Minh)
Ở mức ñộ in vitro, các chất nghiên cứu ñược ñánh giá sàng lọc tác dụng kháng oxy hoá
theo phương pháp thử nghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl).

Trích đoạn Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

---