BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRẦN THỊ YẾN CHI
NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE VÀ
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA
CÁC RUTIN ESTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRẦN THỊ YẾN CHI
NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE VÀ
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA
CÁC RUTIN ESTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
Thầy hướng dẫn: PGS. TS. TRẦN CÁT ĐÔNG
ThS. VŨ THANH THẢO
Thành phố Hồ Chí Minh – 2012
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược,
Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp. HCM, dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS. Trần Cát
Đông và ThS. Vũ Thanh Thảo
Kính gửi đến PGS. TS. Trần Cát Đông và Th.S. Vũ Thanh Thảo lời biết ơn chân
thành vì sự quan tâm, kiên nhẫn và tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành khóa luận này.
Kính gửi đến Quý Thầy Cô trường Đại học Y Dược Tp. HCM lòng biết ơn về
những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho em, là nền tảng để thực hiện khóa luận.
Xin cảm ơn các thầy cô trong hội đồng đã đóng góp cho em những ý kiến quý báu
để khóa luận của em thêm hoàn chỉnh.
Gửi đến các anh chị em ở Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược đặc biệt là
anh Văn Sơn, anh Minh Thái, chị Quỳnh Hương, bạn Kim Uyên lời cảm ơn về sự nhiệt

kém hơn rutin ở 2 phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH và khử ion sắt III. Ngược lại, trong
phương pháp bảo vệ màu hệ nhũ tương, rutin ester lại có tiềm năng ngăn chặn peroxyd hóa
lipid gấp đôi rutin.
Kết luận
Qua thực nghiệm, đã xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng acyl hóa rutin với xúc
tác lipase. Và các rutin ester tạo thành vẫn giữ được hoạt tính chống oxy hóa theo nhiều cơ chế
khác nhau.
Final assay for the degree of BS Pharm – Academic year: 2011 - 2012
ACYLATION OF RUTIN BY LIPASE AS BIOCATALYST AND ANTIOXIDANT
PROPERTIES OF RUTIN ESTERS
Tran Thi Yen Chi
Supervisor: Assoc. Prof. Tran Cat Dong Ph.D.
Vu Thanh Thao M.A.
Introduction
Rutin, a flavonoid, has many biological properties such as blood vessel protection,
antioxidation … However, the use of rutin was strongly limited due to their low solubility and
stability in both lipophilic and aqueous media. The acylation of this molecule can improve it’s
lipophilic properties. We, therefore, carried out the research: “Acylation of rutin by lipase as
biocatalyst and antioxidant properties of rutin esters”
Material and methods
1. Initial investigation the reaction conditions: determine the solvents and the types of
enzymes.
2. Optimization the reaction parameters of acylation reaction: determine substrate ratio,
reaction time and enzyme ratio.
3. Investigation the effects of carbon-chain length of the fatty acids (C6 to C18) on the
rutin acylation performance.
4. Investigation antioxidant properties of rutin ester in vitro.
Results and discussion
The optimum conditions of acylation reaction in tert-butanol solvent with immobilized
lipase were identified as follows the ratio of rutin and fatty acid is 1:2, the reaction time is

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
RSM Phương pháp đáp ứng bề mặt
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
BHT Butylated hydroxytoluene
Trần Thị Yến Chi
ii
Khóa luận Dược sĩ Đại học Danh mục hình
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức hóa học của rutin 4
Hình 1.2. Một số hình ảnh hoa hòe 5
Hình 1.3. Vị trí acyl hóa đặc hiệu của rutin được xúc tác bởi lipase chiết từ Candida
antarctica 12
Hình 2.4. Sơ đồ quá trình thực hiện phản ứng acyl hóa rutin 23
Hình 2.5. Sơ đồ quá trình chiết tách và tinh chế 24
Hình 2.6. Đường chuẩn rutin 26
Hình 2.7. Công thức gốc tự do DPPH 30
Hình 3.8. Sắc ký đồ của sản phẩm sau phản ứng acyl hóa rutin bằng enzym 35
Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm sau phản ứng acyl hóa bằng xúc tác lipase cố
định 37
Hình 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chiều dài mạchf carbon của acid béo đến
phản ứng acyl hóa 42
Hình 3.11. Kết quả khảo sát khả năng đánh bắt gốc tự do của Rutin, Rutin ester, BHT
43
Hình 3.12. Kết quả đánh giá khả năng khử toàn phần của rutin, rutin ester, BHT 44
Hình 3.13. Thử nghiệm bảo vệ màu hệ nhũ tương β-caroten - acid linoleic 45
Hình 3.14. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rutin, rutin ester, BHT và
vitamin C 46
Trần Thị Yến Chi
iii
Khóa luận Dược sĩ Đại học Danh mục bảng

phân cực, giảm sự hấp thu qua ruột.
Tuy nhiên, ứng dụng của rutin trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm
đang bị giới hạn, bởi độ ổn định và độ tan kém của nó trong cả pha dầu và pha nước.
Vì vậy, hiện đang có nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi cấu trúc của rutin (acyl hóa hoặc
glycosyl hóa), bằng các phương pháp tổng hợp hóa học, tổng hợp sinh học (enzym) …
nhằm tăng độ ổn định và độ tan của rutin [11]. Trong bào chế dược phẩm, glycosyl hóa
flavonoid sẽ khiến chúng tăng tính thân nước, thích hợp để điều chế các chế phẩm
đường tiêm. Mặt khác, dẫn xuất acyl hóa của flavonoid lại có tính thân dầu cao hơn.
Các phương pháp tổng hợp hóa học hay sinh học để tổng hợp các dẫn xuất trên cũng đã
được nghiên cứu nhiều. Trong đó, phương pháp tổng hợp bằng con đường xúc tác sinh
học (enzym) cho thấy có nhiều ưu điểm và thích hợp hơn bởi phản ứng enzym có tính
đặc hiệu cao. Một số nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố như cấu trúc mạch acyl,
Trần Thị Yến Chi
1
Khóa luận Dược sĩ Đại học Đặt vấn đề
khung flavonoid, nguồn gốc enzym, bản chất dung môi hay hàm lượng nước trong môi
trường có ảnh hưởng khá mạnh đến phản ứng acyl hóa flavonoid bằng enzym.
Vì vậy, với mục tiêu cải thiện tính tan của rutin nhằm tăng cường ứng dụng của nó
trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là dược phẩm. Chúng tôi thực hiện đề tài : “Nghiên cứu
acyl hóa rutin với xúc tác lipase và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các rutin
ester”
Với các nội dung sau:
- Khảo sát sơ bộ điều kiện của phản ứng acyl hóa: xác định dung môi và loại
enzym thích hợp cho phản ứng acyl hóa rutin.
- Tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl hóa: tỷ lệ cơ chất, thời gian phản
ứng và lượng enzym.
- Khảo sát ảnh hưởng chiều dài mạch carbon của acid béo đến phản ứng acyl hóa.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các dẫn xuất acyl hóa của rutin.
Trần Thị Yến Chi
2

Ngoài ra rutin còn có nhiều trong một số cây khác như Bạch đàn (Eucalyptus
macrorhyncha F. Muell, Myrtaceae), Lúa mạch ba góc (Polygonum fagopyrum L.,
Trần Thị Yến Chi
4
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Polygonaceae), Táo ta (Zyzyphus jujuba Lank., Rhamnaceae) Ích mẫu (Leonurus
heterophyllus L., Lamiaceae) … [5]
Ở Việt Nam, Hòe được trồng nhiều ở Thái Bình, Nam Hà, Hà Bắc, Hải Hưng, Hải
Phòng, Nghệ An và một số vùng thuộc tây nguyên. Hòe còn được trồng ở Trung Quốc,
Nhật, Brazil.
Nụ hoa Hòe là nguyên liệu giàu rutin so với các nguyên liệu khác (Dược điển Việt
Nam qui định hàm lượng rutin phải đạt 20%). Với nụ hoa Hòe Việt Nam, hàm lượng
rutin có thể đạt tới 34%, 4 – 11% ở vỏ quả, 5 – 6 % ở lá … [1]
Hình 1.2. Một số hình ảnh hoa hòe
1.1.3. Đặc tính lý hóa
1.1.3.1. Vật lý
Rutin là những tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, để lâu ngoài không khí có thể chuyển
sang vàng đậm hay vàng nâu. Rutin ngậm 3 phân tử nước, được làm khan ở 95- 97
o
C,
khan tuyệt đối ở 110
o
C khi sấy ở 10 mm Hg trong 12 giờ [2, 34].
Độ tan: Một phần rutin tan trong 7 phần methanol nóng, 200 phần nước sôi, 650 phần
cồn lạnh, 60 phần cồn nóng và 8000 phần nước ở nhiệt độ thường. Rutin dễ tan trong
methanol, pyridin, formamid, dung dịch kiềm loãng, tan chậm trong aceton, acetonitril.
Rutin không tan trong benzen, cloroform, ether etylic, dung dịch acid [1, 34].
Trần Thị Yến Chi
5
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu

giảm nguy cơ chứng xơ vữa động mạch.
-Tác dụng tăng cường sức đề kháng, giảm tính thấm của mao mạch (tác dụng kiểu
vitamin P): Rutin làm bền thành mạch, chống xuất huyết mao mạch, chống xơ cứng
mạch máu. Rutin có tác dụng tăng cường sức đề kháng, giảm tính thấm của mao mạch,
phục hồi tính đàn hồi của mao mạch đã tổn thương.
Một số nghiên cứu chứng minh rằng trong cơ thể rutin tham gia vào quá trình oxy hóa
– khử, làm giảm hiện tượng oxy hóa adrenalin bằng cách ức chế cạnh tranh với enzym
catecholamine-o-methyltransferase, do đó lượng adrenalin bị phá huỷ trong tuần hoàn
giảm, mà adrenalin chính nó lại có tác dụng tăng cường sức đề kháng của mao mạch.
Ngoài ra, rutin có khả năng gây co mạch trực tiếp hệ mao quản.
Trần Thị Yến Chi
6
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Ở người cao tuổi, rutin có khả năng duy trì tình trạng bình thường của mao mạch, bảo
đảm cho mao mạch làm được chức năng trao đổi chất, tăng trương lực của tĩnh mạch,
củng cố sức bền của thành mạch, do đó hạn chế được hiện tượng suy tĩnh mạch lúc tuổi
già [1].
-Tác dụng chống viêm: Thí nghiệm trên chuột cống trắng, rutin có tác dụng ức chế phù
bàn chân chuột do albumin, histamin, serotonin gây ra cũng như ức chế sưng khớp
khuỷu do enzym hyaluronidase gây ra. Trên thỏ, rutin tiêm tĩnh mạch có thể phòng
ngừa viêm da dị ứng và hiện tượng Arthus (Arthus phenomenon) trên động vật đã được
gây mẫn. Trên chó bị viêm tắc tĩnh mạch thực nghiệm bằng cách tiêm dầu thông, dùng
rutin điều trị có tác dụng thúc đẩy quá trình hồi phục [1].
-Tác dụng bảo vệ cơ thể chống chiếu xạ: Rutin tiêm dưới da với liều 2 mg/kg có tác
dụng làm giảm tỉ lệ tử vong của chuột nhắt trắng bị chiếu xạ với liều lớn và chuột nhắt
trắng tiêm nitromin với liều gây chết.
-Tác dụng hạ huyết áp, hạ cholesterol-máu: Tiêm tĩnh mạch dịch chiết từ nụ hòe trên
chó đã được gây mê, có tác dụng hạ huyết áp rõ rệt. Trên chuột cống trắng cao huyết
áp di truyền, tiêm tĩnh mạch rutin với liều 1 mg/kg cũng có tác dụng hạ huyết áp.
-Tác dụng chống kết tập tiểu cầu: Trên thỏ thí nghiệm rutin tiêm phúc mạc với liều 0,2

vitamin P [33].
Mặt khác, dẫn xuất acyl hóa của flavonoid lại có tính thân dầu cao hơn. Đã có nhiều
nghiên cứu về phương pháp tổng hợp các dẫn xuất trên, đặc biệt là phương pháp sinh
học. Ardhaoui và cộng sự đã tiến hành acyl hóa một số flavonoid (quercetin,
hesperidin, rutin và esculin) với xúc tác lipase cố định chiết từ Candida antarctica.
Trần Thị Yến Chi
8
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Trong nghiên cứu này, acid béo sử dụng là acid palmitic, thì hiệu suất phản ứng đạt
80%, 71% và 38% lần lượt đối với esculin, rutin và hesperidin [11].
Ngoài ra, tiềm năng ứng dụng của các dẫn xuất rutin thân dầu như là một chất chống
oxy hóa, bảo vệ các thực phẩm từ dầu, chất béo cũng đã được đánh giá bằng các mô
hình thí nghiệm khác nhau. Kết quả cho thấy rằng các rutin ester thân dầu là những
hợp chất hữu ích trong việc bảo vệ các thực phẩm từ dầu/chất béo chống lại sự oxy hóa
trong suốt quá trình bảo quản và sử dụng [35]. Nghiên cứu khác trên sự ức chế quá
trình oxy hóa LDL ở người còn cho thấy rằng, các dẫn xuất rutin ester có tác dụng
chống oxy hóa hiệu quả. Trong đó, khả năng ức chế quá trình oxy hóa của rutin laurat
cao hơn rutin palmitat, rutin và cả chế phẩm chống oxy hóa tổng hợp hiện đang có trên
thị trường là butylated hydroxytoluene (BHT) [24].
1.2. LIPASE
1.2.1. Khái quát
Lipase (EC 3.1.1.3) là enzym thuộc nhóm enzym thủy giải. Enzym này tham gia quá
trình xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol thành acid béo tự do và glycerol.
Chúng xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết chứ không cắt đứt cả 3 liên
kết cùng một lúc. Lipase xúc tác phản ứng thủy giải triglycerid thành diglycerid,
monoglycerid hay glycerol và acid béo nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân cách hai
pha dầu nước.
Lipase còn có khả năng xúc tác phản ứng ester hóa, transester hóa, thủy giải amin, thủy
giải oxim và thiotransester hóa trong dung môi hữu cơ [19, 32].
Trần Thị Yến Chi

Hoạt tính chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, hàm lượng nước và mặt
phân cách giữa chất béo và nước. Tốc độ phản ứng sẽ tăng lên gấp đôi khi nhiệt độ
tăng lên 10
o
C, sản phẩm phản ứng sẽ tăng lên nhiều lần nếu lipase chịu nhiệt. Trong
một vài trường hợp, nhiệt độ sẽ làm giảm hoạt tính enzym do làm duỗi các nếp xoắn
của chuỗi polypeptide. Các lipase từ vi sinh vật hoạt động mạnh ở pH 4,5 – 8,5. Tỷ lệ
phân giải lipid của lipase cao ở lớp phân cách giữa chất béo và nước. Chất béo được
nhũ hóa tốt sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho lipase hoạt động do làm tăng diện tích tiếp
xúc giữa enzym và cơ chất. Sự hiện diện của các ion Na
+
, Ca
+
cũng ảnh hưởng đến
hoạt động của enzym: Na
+
cần thiết cho hoạt động của lipase từ tụy heo, Ca
2+
cần cho
sự thủy giải triglycerid mạch dài. Các acid mật kìm hãm sự thủy giải lipid, nhưng với
hàm lượng thấp nó có thể làm cho hoạt tính enzym từ tụy tạng ổn định hơn [22].
1.2.4. Lipase cố định
Enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào chất mang bằng các kỹ
thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzym chuyển từ trạng thái hòa tan sang
trạng thái không hòa tan.
Việc sử dụng enzym lipase cố định đem lại lợi ích kinh tế cao hơn so với việc sử dụng
enzym tự do [27]. Các lợi ích của enzym cố định bao gồm: khả năng tái sử dụng, độ
bền lớn hơn enzym tự do nhờ được chất mang bảo vệ, dễ dàng tách enzym ra khỏi hỗn
hợp sau phản ứng, khả năng bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng loại … Vì vậy mà ta
có thể kiểm soát được phản ứng xúc tác của enzym, tiết kiệm chi phí và nâng cao hiệu

). Các gốc này được chuyển thành H
2
O
2
Trần Thị Yến Chi
12
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
với sự xúc tác của superoxid dismutase (SOD). Tuy nhiên các gốc (
°
O
2
-
) và H
2
O
2
chỉ
tồn tại ở nồng độ thấp và vô hại với cơ thể. Nếu các yếu tố này tồn tại ở nồng độ cao,
kết hợp với sự xúc tác của enzym hoặc các ion Fe
2+
, Cu
2+
thì sẽ tạo ra các gốc tự do
như gốc hydroxyl (HO
°
), gốc lipoxyl (LO
°
), gốc alkoxyl (RO
°
), gốc lipoperoxyl

của con người
Gốc tự do sinh ra quá mức sẽ vượt qua hệ thống enzym bảo vệ của cơ thể (enzym
superoxid dismutase, catalase, peroxidase…), và tấn công vào các thành phần tế bào
như ADN, protein, hydratcarbon, lipid
Gốc tự do tấn công vào các phospholipid màng gây ra quá trình peroxy hóa lipid. Hậu
quả dẫn đến tính lỏng, tính thấm của màng bị thay đổi. Quá trình peroxy hóa ở các bao
myelin quanh các sợi thần kinh có thể dẫn đến các dấu hiệu của bệnh thần kinh (bệnh
Alzheimer). Nếu peroxy hóa các chất hoạt động ở bề mặt phế nang sẽ gây ra các rối
loạn chức năng phổi (dấu hiệu suy kiệt hô hấp ở người lớn). Quá trình peroxy hóa lipid
xảy ra mãnh liệt ở cơ quan tổ chức tế bào khiến chúng bị phá hủy nghiêm trọng và dẫn
đến ung thư. Các gốc tự do còn có thể gây ra các tổn thương phân tử ADN cũng dẫn
đến đột biến và ung thư.
Sự tác động vào các yếu tố gây viêm, sự hủy hoại cấu trúc các phân tử peroxy hóa
lipidisaccharid do oxy hóa có thể làm mất tính nhớt của acid hyaluronic - chất làm trơn
ở khớp, ảnh hưởng tới quá trình viêm có thể xuất hiện các bệnh như viêm khớp dạng
thấp, lupus ban đỏ
Gốc tự do có liên quan chặt chẽ với sự điều hòa của các chất tiết ra từ thành trong
mạch (prostacyclin, NO, ) để quyết định sự bám dính của tiểu cầu làm tiền đề cho các
cục máu đông, các mảng xơ vữa là nguyên nhân của các bệnh về tim mạch (nhồi máu
cơ tim, xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não )
Như vậy, việc sử dụng các chất chống oxy hóa thật sự cần thiết để chống lại bệnh tật.
Do đó, người ta không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm các chất chống oxy hóa nhằm mục
đích sử dụng để bảo vệ sức khoẻ con người [7].
Trần Thị Yến Chi
14
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
1.3.2. Các chất chống oxy hóa
1.3.2.1. Khái niệm
Các chất chống oxy hóa là những chất giúp bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do (những
chất là căn nguyên gây tổn hại tế bào) tạo ra trong các quá trình oxy hóa nên ngăn cản

2
O
2
Bổ sung vào cơ thể từ thực
phẩm, thức ăn, thuốc, mỹ
phẩm.
Vitamin E, vitamin C,
vitamin A, selen,
flavonoid, polyphenol,
Tác động trên các gốc tự
do như những chất ngắt
mạch.
Trần Thị Yến Chi
15
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Nguồn gốc Các chất điển hình Cơ chế
carotenoid …
Chất ổn
định trong
dược phẩm
Chất chống
oxy hóa
gián tiếp
EDTA (etylen diamin
tetraacetic aicd)
Tạo phức với ion kim loại
Chất chống
oxy hóa trực
tiếp
Chất khử hóa: các hợp chất

O
2
−
, H
2
O
2
vô cùng ít, các gốc tự do
này đã được một hệ thống các chất khử tự nhiên như: superoxid dismutase (SOD),
glutathion (GSH), glutathion peroxidase (GSHPO), catalase bảo vệ, nên cơ thể chúng
ta vẫn bình thường.
Các chất chống oxy hóa nội sinh bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do bao gồm:
Những chất chống oxy hóa enzym bao gồm: Superoxid dismutase (SOD): xúc tác cho
phản ứng chuyển O
2
°
−
thành H
2
O
2
và H
2
O, Glutathion peroxidase (GSHPO); catalase.
Những chất chống oxy hóa không enzym bao gồm: các vitamin tan trong lipid như
vitamin E và vitamin A hay tiền vitamin A (β-caroten), vitamin C tan trong nước và
GSH. Vitamin E được xem như chất chống oxy hóa ngắt mạch chính yếu trong cơ thể.
Trần Thị Yến Chi
16