Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN PHAN THỊ THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY BỤC NÚI
CAO MALLOTUS JAPONICUS MUELL ARG.

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hƣớng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN HOÀI NAM Hà Nội - 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hà Nội - 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lời cảm ơn
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hoá Sinh biển,Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Hoài
Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện
giúp đỡ tôi trong thời gian làm luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Thị Thảo và các anh chị Phòng
Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho
tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thử nghiệm dược lý.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, trường Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và phấn
đấu để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra của luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của tập thể các cán bộ Viện
Hóa Sinh biển đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ phòng Dược liệu biển,
Viện Hóa Sinh biển đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận
án.
Luận án này được hỗ trợ kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ đề tài Hợp
tác Quốc tế theo Nghị định thư Việt Nam Bỉ giai đoạn 2007-2009, do GS.TS Châu
Văn Minh làm chủ nhiệm.

Tác giả luận án

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Mục lục
Danh sách các chữ viết tắt i
Mục lục ii
Danh mục các bảng iv
Danh mục các hình v
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 3
I.1. KHÁI QUÁT VỀ CHI BA BÉT (MALLOTUS) 3
I.2. KHÁI QUÁT VỀ CÂY BỤC NÚI CAO (MALLOTUS JAPONICUS MUELL
ARG.) 4
I.2.1. Thực vật học 4
I.2.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Bục núi cao (Mallotus
japonicus Muell. -Arg.) 5
I.2.3. Hoạt tính chống oxy hóa của cây Mallotus japonicus Muell Arg. 12
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
II.1. MẪU THỰC VẬT 18
II.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 18
II.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 18
II.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế 18
II.2.3. Sắc ký cột (CC) 19
II.3. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT 19
II.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) 19
II.3.2. Phổ cộng hƣởng từ nhân (NMR) 19
II.4. PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 20
II.4.1. Phƣơng pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). 20

Bảng 1. Tổng hợp hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất phloroglucinol trên các dòng
tế bào ung thƣ nuôi cấy khác nhau (IC
50
g/ml) 8
Bảng 2. Kết quả thử hoạt tính chống ôxy hóa của các hợp chất 16
Bảng 3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 29
Bảng 4. Số liệu phổ NMR của 2 31
Bảng 5. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 33
Bảng 6. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 35
Bảng 7. Số liệu phổ NMR của 5 37
Bảng 8. Số liệu phổ NMR của 6 và các chất tham khảo 39
Bảng 9. Kết quả thử nghiệm DPPH 42
Bảng 10. Kết quả thí nghiệm bảo vệ tế bào gan khỏi tác nhân oxi hóa 43
Bảng 11. Kết quả thí nghiệm MDA 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Danh mục các hình

Hình 1. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 28
Hình 2. Các tƣơng tác HMBC (H  C) chính của hợp chất 1 29
Hình 3. Cấu trúc hóa học của 2 30
Hình 4. Cấu trúc hóa học của hợp chất 3, 3a và 3b 32
Hình 5. Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất 3 32
Hình 6. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 34
Hình 7. Cấu trúc hóa học của 5 36
Hình 8. Các tƣơng tác HMBC chính (H  C) của 5 38
Hình 9. Cấu trúc hóa học của 6 38
Hình 10. Các tƣơng tác COSY và HMBC chính của 6 39


này đƣợc dùng chữa nôn mửa, ngoài ra còn có tác dụng sát trùng, nấu cao
dán lên mụn nhọt có tác dụng đỡ mƣng mủ và lên da non [2].
Trên cơ sở đó, chúng tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thành
phần hóa học và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cây Bục núi cao
Mallotus japonicus Muell Arg.”
Luận văn này tập trung nghiên cứu về thành phần hóc học của cây
Bục núi cao (Mallotus japonicus Muell Arg.) và hoạt tính chống oxy hóa
của chúng nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm
kiếm các phƣơng thuốc mới cũng nhƣ giải thích đƣợc tác dụng chữa bệnh
của các cây thuốc cổ truyền.
NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN GỒM
1. Phân lập một số hợp chất hóa học từ cây Bục núi cao (Mallotus
japonicus Muell Arg.)
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập đƣợc.
3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một số hợp chất đã phân lập
đƣợc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
I.1. KHÁI QUÁT VỀ CHI BA BÉT (MALLOTUS)
Chi ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn thuộc họ thầu dầu
(Euphorbiaceae), gồm khoảng 150 loài, phân bố tại các khu vực từ Ấn Độ,
Sri Lanka đến Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam và khắp vùng Malesia.
Về phía Nam, chúng phân bố tới miền Đông Fuji, miền Bắc và Đông
Australia. Lên phía Bắc, có thể gặp khá nhiều loài phân bố tại Trung Quốc,
Triều Tiên và Nhật Bản. Rất nhiều loài Mallotus đã đƣợc sử dụng làm thuốc
để chữa nhiều bệnh khác nhau nhƣ: Bục núi cao M . japonicus đƣợc sử dụng

tâm điều tra và nghiên cứu [2,4]. Phân bố: Cây phân bố chủ yếu ở các khu vực núi cao có điều kiện khí
hậu mát và ẩm. Ở nƣớc ta mới gặp loài này ở Sa Pa (Lào Cai).
Trên thế giới, loài này phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và Nhật Bản [2].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Công dụng: Trong y học dân tộc Trung Quốc, Bục núi cao đƣợc dùng
làm thuốc chữa viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa bộ máy tiêu hóa. Vỏ
thân cây này đƣợc dùng chữa nôn mửa, ngoài ra còn có tác dụng sát trùng,
nấu cao dán lên mụn nhọt có tác dụng đỡ mƣng mủ và lên da non [2].
Các thử nghiệm in vitro gần đây cho biết, một số hợp chất phân lập từ
bục núi cao có tác dụng kháng virus HIV-1, ức chế sự phát triển của tế bào
ung thƣ và kháng khuẩn [2].
I.2.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Bục núi cao
(Mallotus japonicus Muell. -Arg.)
Thành phần hóa học của loài M. japonicus đƣợc các nhà khoa học Nhật
Bản quan tâm và nghiên cứu từ rất sớm, năm 1939 hợp chất bergenin (1) đã
đƣợc phát hiện từ vỏ cây và đến năm 1949 hợp chất rutin đƣợc phát hiện từ
lá của loài này [5]. O
O
HO
H
3
C

1

R
2

2
CHO
H
3
CH
3

OH
4
CH
2
OH
H
5
CH
2
OH
OH

Năm 1975, từ hạt của loài M. japonicus, nhóm nghiên cứu của tác giả
Okabe đã phân lập đƣợc 8 hợp chất glycoside tim (cardiac glycoside) trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

đó có 3-O-α-L-rhamnopyranoside và 3-O-

OH
HO
H
3
C
OCH
3
HO
COCH
3
OH
O
Ac
OH
HO
H
3
C
OCH
3
HO
Ac
OH
R
OH
Ac
OH
HO
H
3

hydroxybut-3-enyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-methoxybenzyl)-
phloroacetophenone (7) từ quả đã bỏ hạt của loài M. japonicus [6]. Đến năm
1985, nhóm nghiên cứu này công bố thêm 2 dẫn xuất phloroglucinol mới
nữa là 3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-
methoxybenzyl)-phlorobutyrophenone (8) và 3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-
acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-methoxybenzyl)-phloroisobutyrophenone
(9) [7]. Cũng trong năm 1985, hai dẫn xuất phloroglucinol mới đƣợc đặt tên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

là mallotophenone (10) và mallotochromene (11), cùng với hai hợp chất đã
đƣợc biết đến là 3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-
6-methoxybenzyl)-phlora-cetophenone và 2,6-dihydroxy-3-methyl-4-
methoxyacetophenone đƣợc phân lập từ vỏ quả loài M. japonicus. Các hợp
chất 10, 11 và 2,6-dihydroxy-3-methyl-4-methoxyacetophenone thể hiện
hoạt tính gây độc tế bào cao trên các dòng tế bào ung thƣ KB và L-5178Y
với giá trị IC
50
tƣơng ứng là 0,58/0,74, 2,40/6,10 và 2,10/1,25 μg/ml [7].

Ac
OH
HO
H
3
C
OCH
3
HO
CO-R

nhóm tác giả này về thành phần hóa học của vỏ quả loài M. japonicus. đã
phân lập thêm đƣợc bốn dẫn xuất phloroglucinol mới là
butyrylmallotochromene (14) and isobutyrylmallotochromene (15),
isomallotolerin (16) and isomallotochromanol (17). Các hợp chất 14, 15, 16
thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao trên dòng tế bào KB với ED
50
tƣơng
ứng là 2,55, 0,4 và 0,84 μg/ml [9,10]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Ac
OH
HO
H
3
C
OCH
3
HO
Ac
OH
O
R
COCH
3
OH
HO
H

>20
>20
>20
>20
>20
>20
2,6-Dihydroxy-3-methyl-
4-methoxyacetophenone
>20
>20
>20
>20
>20
>20
Mallotophenone (10)
2,40±0,17
6,30±0,60
3,75±0.24
4,80±0,23
3,65±0,49
10,08±0,58
Mallotojaponin (18)
0,58±0.03
0,60±0,04
0,54±0,04
0,70±0,06
0,81±0,08
1,14±0,05
Butyrylmallotojaponin
0,72±0,07

1,08±0,21
1,77±0,06
1,44±0,05
2,78±0,16
4,03±0,56
Isomallotochromene
2.20±0,12
-
-
-
-
-
Mallotolerin (12)
1,22±0,12
1,08±0,08
1,53±0,12
1,01±0,23
1,61±0,02
2,18±0,04
Butyrylmallotolerin
0,95±0,11
0,91±0,20
0,63±0,06
2,38±0,24
1,27±0,04
1,22±0,19
Isobutyrylmallotolerin
0,84±0,09
0,93±0.09
1,80±0,43

-
-
-
Mallotochroman
8,90±0,40
-
-
-
-
-
Isomallotochromanol (17)
>20
>20
>20
>20
>20
>20
Isomallotochroman (17a)
16,02±0,64
-
-
-
-
-

Trong số 20 dẫn xuất phloroglucinol đƣợc thử nghiệm, có tới 10 hợp chất
thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao trên tất cả các dòng tế bào thử nghiệm.
Hợp chất mallotojaponin (18) đã đƣợc tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng
u in vivo trên chuột đã bị gây bệnh bạch cầu L5178Y. Kết quả cho thấy, hợp


CO
O
CH
2
O
O
O
OOC
OH
OH
OR
2
CO
OH
OH
O
O
CO
O
O
O
HO
OH
OH
OH
O
H
H
O
OH

O
OH
OHHOOH
HO
HO
OC
CO
O
CH
2
O
OR
1
OOC
OH
OH
OR
2
HO
O
OH
CH
2
HO
O
O
OOC
OH
OH
OR

HO
OH
OH
OH
C
C
OR
1
R
3
O
O
O
HO

O
O
R
2
O
O
O
OH
OH
OH
O CO
R2
R1
G
33
Ela
(R)HHDP
28
(β)G
H
G
34
DHHDP
H, H
29
(β)G
G
G
35
H, H
(R)Val

36
DHHDP
(R)Val

37

HO
OH
OH
OH
O
H
H
H
HO
O
HO
OH
OH
CO
CO
O
HO
H
(R)HHDP:
O
HOOC
OH
OHHO
OH
HO
HO
OC CO
HO OH
OHHO
OH

. Tác dụng giải độc gan của bergenin
cũng đƣợc chứng minh bằng cách đánh giá hoạt lực của các enzym
glutathione S-transferase và glutathione reductase và hàm lƣợng của
glutathione trong tế bào gan đã gây độc bằng CCl
4
[14]. Ngoài ra, tác dụng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

của hợp chất này lên các tế bào chuột đã đƣợc gây độc bằng D-
galactosamine cũng đã đƣợc nghiên cứu. Ở nồng độ 100 M, bergenin làm
giảm sự tiết của các enzym glutamic piruvic transaminase và sorbitol
dehydrogenase ra môi trƣờng trong 14 h với 1,5 mM galactosamine tƣơng
ứng là 50,9 và 45%. Đồng thời, sự suy giảm tổng hợp ARN kích thích bởi
galactosamine (1,5 mM) đƣợc phục hồi bởi bergenin (100 M) cao hơn 2,5
lần so với đối chứng [14].
I.2.3. Hoạt tính chống oxy hóa của cây Mallotus japonicus Muell Arg.
Thời gian gần đây, nhiều cuộc nghiên cứu thƣờng đề cập đến chất
antioxydant (chất chống oxy hóa). Chất chống oxy hóa hiện đã đƣợc chứng
minh mang lại rất nhiều lợi ích cho sức khỏe, từ ngăn ngừa ung thƣ và bệnh
tim, đến việc giúp giảm tình trạng thoái hóa hoàng điểm mắt và bệnh
Alzeimer.
Các chuyên gia cho biết, điều khiến chúng mang lại nhiều lợi ích cho
cơ thể chính là do chất chống oxy hóa có khả năng vô hiệu hóa một nhóm
thành phần có tính chất phản ứng và phá hủy cao, đƣợc gọi là các gốc tự do
gây hại.
Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley,
California, là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong
cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thƣơng cho tế bào. Trƣớc đó, ngƣời ta
cho là gốc này chỉ có ở ngoài cơ thể [15].

H
2
O
2
khi ở nồng độ thấp [18,19].
2H
2
O
2
2H
2
O + O
2

GSHPO là enzym xúc tác cho phản ứng loại bỏ các H
2
O
2
hữu cơ và
vô cơ. H
2
O
2
khi mới tạo ra với nồng độ thấp, xảy ra phản ứng của
glutathione (GSH) với H
2
O
2
nhờ enzym GSHPO xúc tác:
2GSH + LOOH GSSG + LOH + H

của màng. Vì tính chất ƣa lipit nên vitamin E có thể liên kết mật thiết với
phần hydrocarbon của các axit béo chƣa bão hoà nối đôi, do đó có thể tiếp
cận gần vị trí của quá trình peroxy hoá và dập tắt chuỗi phản ứng.
Một điều đáng chú ý là vitamin E chỉ phát huy tác dụng khi cơ thể đủ
selen. Selen có tác dụng hoạt hoá vitamin E. Hoạt tính chống oxy hoá của
vitamin E có liên quan mật thiết với những chất chống oxy hoá hoà tan trong
lipit ở huyết tƣơng và hồng cầu ngƣời trƣởng thành [24].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Vitamin C: Một trong những tác nhân chống oxy hoá của vitamin C
là đƣa vitamin E từ dạng oxy hoá về dạng khử:
Vit E (ox) + Vit C (kh)  Vit E (kh) + Vit C (ox)
Hằng số tốc độ phản ứng khá lớn K = 1,55.10
6
M
-1
giây
-1
. Cơ chế này
giải thích cho sự ít thiếu hụt vitamin E ở ngƣời.
Vitamin C còn có những tính chất chống oxy hoá khác ở môi trƣờng
nƣớc nhƣ loại hydro peroxide. Nhƣng tính chất này chỉ thể hiện nếu không
có mặt của ion sắt. Nếu có mặt ion sắt (nhƣ uống thuốc sắt quá liều, vỡ hồng
cầu gây tổn thƣơng cơ) thì vitamin C sẽ có tính oxy hoá mạnh. Do đó trong
thực nghiệm ngƣời ta dùng hỗn hợp ion sắt và vitamin C làm nguồn sinh gốc
tự do [25-27].
- Các flavonoid: flavonoid là một chất rất phổ biến trong thực vật, có
bản chất là polyphenol. Khi đƣa flavonoid vào cơ thể, chúng sẽ triệt tiêu các
gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý của cơ thể và tạo nên

39
DHHDP
(R)HHDP

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

40
H, H
(R)Val
41
DHHDP
(R)Val

42 43
Bảng 2. Kết quả thử hoạt tính chống ôxy hóa của các hợp chất
Hợp chất
DDPH
 a

O
2
 b

Mallotinic acid
6,2
267
Mallotusinic acid
9,1
299
Corilagin

mạnh. Một điều đáng lƣu ý là tất cả bốn hợp chất tanin đều có hoạt tính
tƣơng đƣơng hay thậm chí cao hơn so với epigallocatechin gallate (EGCG),
một hợp chất đã đƣợc biết đến với hoạt tính chống ôxy hóa rất cao. Hoạt tính
của các hợp chất này có thể liên quan đến mật độ thế cao của các nhóm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

hydroxyl. Gốc tự do O
2

đƣợc tạo ra ở giai đoạn đầu của phản ứng ôxy hóa
trong cơ thể và sẽ sản sinh ra các gốc tự do gây hủy hoại tế bào. Kết quả
đánh giá hoạt tính thu dọn gốc tự do O
2

của các hợp chất cho thấy, các tanin
phân lập từ lá cây M. japonicus. thể hiện hoạt tính mạnh hơn tất cả các chất
khác ngoại trừ EGCG. Hoạt tính thu dọn gốc tự do DDPH và gốc O
2

của
hợp chất 36 tƣơng ứng mạnh gấp 3,4 và 16,6 lần so với quercetin, một hợp
chất đƣợc biết đến nhiều bởi có hoạt tính chống ôxy hóa rất mạnh và đã
đƣợc dùng làm chất chuẩn dƣơng trong một số phƣơng pháp thử nghiệm
đánh giá hoạt tính chống ôxy hóa in vitro. Nhƣ vậy, tƣơng tự nhƣ chè xanh
có chứa EGCG, lá loài M. japonicus chứa các hợp chất chống ôxy hóa rất
mạnh và có thể là nguồn nguyên liệu tự nhiên tuyệt vời để sản xuất các chế
phẩm có tác dụng chống ôxy hóa [29].