I HC M TP.HCM
KHOA CỌNG NGH SINH HC


BẨI BÁO CÁO KHOÁ LUN TT NGHIP

Tên đ tƠi:

NGHIÊN CU QUY TRỊNH TRệCH LY VẨ
KHO SÁT HOT TệNH SINH HC CA
HP CHT ANTHOCYANIN T U EN
(VIGNA CYLINDRICA) KHOA CỌNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGẨNH: CỌNG NGH THC PHM GVHD: Th.S Nguyn Th L Thu
SVTH: Nguyn Th Kim Ngơn
MSSV: 1053010478
Khoá: 2010-2014

Bình Dng, tháng 5 nm 2014
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478]


PHN I: TNG QUAN TẨI LIU
1. Anthocyanin 3
1.1 . Gii Thiu Anthocyanin 3
1.2 . Vai trò ca các hp cht Anthocyanin 15
1.3 . Mt s nghiên cu v Anthocyanin 17
2. Gii thiu v đu đen 18
2.1 . c đim thc vt 18
2.2 . Thành phn cht màu có trong đu đen 21
3. Phng pháp trích ly 22
PHN II: VT LIU VẨ PHNG PHÁP NGHIÊN CU
2. Vt liu nghiên cu 25
2.1 . a đim nghiên cu 25
2.2 . Nguyên liu 25
2.3 . Hoá cht s dng 25
2.4 . Dng c và thit b s dng 25
3. Phng pháp nghiên cu 27
3.1 . Quy trình trích ly Anthocyanin d kin 27
3.2 . S đ nghiên cu quy trình trích ly Anthocyanin 29
3.3 . Ni dung nghiên cu 30
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478]

3.3.1. Kho sát bc sóng hp th cc đi ca dch trích Anthocyanin 30
3.3.2. Kho sát các yu t nh hng đn quá trình trích ly Anthocyanin 31
3.3.3. Kho sát hot tính sinh hc 38
3.3.4. Kho sát mt s đc tính ca Anthocyanin thô 41
PHN III: KT QU - THO LUN
3.1. Kt qu kho sát bc sóng hp th cc đi ca dch trích Anthocyanin 43
3.2. Kt qu kho sát các yu t nh hng đn quá trình trích ly Anthocyanin 44

o
C – 100
0
C 55
Bng 3.9: Màu ca Anthocyanin trong các pH khác nhau 56

Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page ii

DANH MC HỊNH
Hình 1.1: Anthocyanin  dng thng 3
Hình 1.2: Anthocyanin  dng trung tính 3
Hình 1.3: Các Anthocyanin ph bin trong rau qu 4
Hình 1.4: Khung sn c bn ca Anthocyanin 5
Hình 1.5: Cu trúc chuyn hoá ca Anthocyanin trong nc 7
Hình 1.6 : Cây đu đen 19
Hình 1.7 : Ht đu đen 19
Hình 1.8 : u đen (Vigna unguiculata ssp. cylindrica ) 20
Hình 2.1: S đ quy trình trích ly Anthocyanin 27
Hình 2.2: S đ các giai đon nghiên cu quy trình trích ly Anthocyanin 30
Hình 2.3: S đ quy trình th hot tính bt gc t do DPPH

39
Hình 3.1:  th xác đnh bc sóng hp ph cc đi ca dch trích 43
Hình 3.2 :  th biu din kh nng kháng oxy hoá 50
Hình 3.3 : Kh nng kháng khun ca Anthocyanin thô đi vi E.coli 53
Hình 3.4: Kh nng kháng khun ca Anthocynin thô vi B.subtilis 54
Hình 3.5: Bt Anthocyanin thô 55
Hình 3.6: Màu ca Anthocyanin theo pH 56

cao ca cht Anthocyanin nh delphinidin, petunidin, malvidin .
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 2

 nc ta, vùng trng đu đen phân b rt rng t Bc vào Nam vi din
tích đáng k. Tuy vy, đu đen ch đc s dng ch bin trong các món n thông
thng hàng ngày. Do vy, chúng tôi quyt đnh thc hin đ tài: “Nghiên cu quy
trình trích ly vƠ kho sát hot tính sinh hc ca hp cht Anthocyanin t u
đen (Vigna cylindrica)” đ tn dng các hot tính sinh hc quỦ có trong ht đu
đen, nâng cao giá tr thng mi ca ht đu đen nhm mang li li ích cho ngi
nông dân cng nh cung cp mt ngun cht màu có ngun gc t nhiên, an toàn
cho sc kho ngi tiêu dùng.
Mc tiêu đ tƠi:
o Xây dng quy trình tách chit, thu nhn cht màu Anthocyanin t ht đu đen
trong phòng thí nghim.
o Kho sát tính kháng khun và kh nng chng oxy hoá ca Anthocyanin thu t
dch trích.
Ni dung nghiên cu:
o Kho sát bc sóng hp th cc đi ca dch trích Anthocyanin.
o Kho sát các yu t nh hng ca quá trình trích ly Anthocyanin: h dung môi
(nc và các loi acid), nng đ cn, t l dung môi và nguyên liu, nhit đ trích
ly, thi gian trích ly.
o Kho sát hot tính sinh hc: kh nng kháng oxy hoá, kh nng kháng khun.
o Kho sát mt s đc tính ca Anthocynain thô: đ m, đ bn màu, hàm lng
polyphenol, nh hng ca pH đn màu sc Anthocyanin.
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 3


acid tác dng vi nhng cation và to mui đc vi các acid. Còn trong dung
dch kim thì Anthocyanindin li tác dng nh anion và to mui đc vi base.
Cho đn nay, ngi ta đã xác đnh đc 18 loi aglycon khác nhau, trong
đó 6 loi ph bin nht là pelargonidin, cyanidin, delphinidin, peonidin, petunidin
và maldivin.

Hình 1.3: Các Anthocyanin ph bin trong rau qu
Trong t nhiên, Anthocyanin rt him khi  trng thái t do (không b
glycosyl hóa). Nhóm hydroxy t do  v trí C-3 làm cho phân t Anthocyanidin
tr nên không n đnh và làm gim kh nng hòa tan ca nó so vi Anthocyanin
tng ng. Vì vy, s glycosyl hóa luôn din ra đu tiên  v trí nhóm 3-hydroxy.
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 5

Nu có thêm mt phân t đng na, v trí tip theo b glycosyl hóa thng gp
nht là  C-5. Ngoài ra, s glycosyl hóa còn có th gp  các v trí C-7, C-3’, C-5’.
Loi đng ph bin nht là glucose, ngoài ra cng có mt vài loi
monosaccharide (nh galactose, rammose, arabinose), các loi disaccharide (ch
yu là rutinose, sambubiose hay sophorose) hoc trisaccharide tham gia vào quá
trình glycosyl hóa.
S methoxyl hóa các Anthocyanin và các glucoside tng ng din ra
thông thng nht là  v trí C-3’ và C-5’, cng có th gp  v trí C-7 và C-5. Tuy
nhiên cho đn nay ngi ta vn cha tìm thy môt hp cht nào b glycosyl hóa
hay b methoxyl hóa trên tt c các v trí C-3, C-5, C-7 và C-4’ do cn thit phi
còn ít nht mt nhóm hydroxyl t do  C-5, C-7 hay C-4’ đ hình thành dng cu
trúc quinonoidal base (dng cu trúc ca Anthocyanin thng tn ti trong không
bào thc vt có pH t 2,5 – 7,5).
Hai glucoza
Cúc tây, m cò
Xianin
Hai glucoza
Hoa hng
Ceraxinanin
Glucoza, Ramnoza
Qu anh đào
Prunixianin
Galactoza
Qu mn
Ldain
Glucoza, Ramnoza
Qu vit qut
Malvin
Hai glucoza
Hoa cm qu
Peonin
Glucoza
Hoa mu đn
Enin
Hai glucoza
Qu nho
Hirxutin

Hoa anh tho, hoa ngc
trâm
(Ngun: Lê Ngc Tú, 2005)
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu


Chng hn rubrobraxindin clorua ca Anthocyanin ca bp ci đ là mt
triglucozit ca Anthocyanindin.
Khi:
pH = 2,4 – 4,0 thì có màu đ thm.
pH = 4 – 6 thì có màu tím.
pH = 6 thì có màu xanh lam.
pH là kim thì có màu xanh lá cây.
Hoc xianin có trong hoa hng màu sc thay đi khi pH ca dch bào thay đi. Các
màu sc khác nhau ca hoa có đc là do t hp các Anthocyanindin và các este
metylic ca chúng vi acid và base.
1.1.3. c tính quang ph ca Anthocyanin[9]
Anthocyanin có bc sóng hp th trong min nhìn thy, kh nng hp th
cc đi ti bc sóng 510÷540nm. Màu ca Anthocyanin to ra t màu tím đn
màu xanh ca nhiu loi qu.

 hp th Anthocyanin ph thuc vào dung môi,
pH ca dung dch, nng đ Anthocyanin. Thông thng pH thuc vùng acid mnh
có đ hp th ln, nng đ Anthocyanin càng ln đ hp th càng mnh.
 hp th th hin bn cht ca mi Anthocyanin do kh nng hp th
khác nhau ca chúng.  hp th liên quan mt thit đn màu sc ca các
Anthocyanin.
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 9

1.1.4. S phân b ca Anthocyanin[13,14,15]
Anthocyanin tp trung  nhng cây ht kín và nhng loài ra hoa. Trong t
nhiên Anthocyanin có mt trong 80% sc t lá, 69% trái cây và 50% hoa. Trong
nhng loi thc vt này, Anthocyanin đc tìm thy ch yu  các lp t bào nm
bên ngoài nh biu bì. S phân b ca sáu Anthocyanidins ph bin nht trong các

diferuloyl, sinapoyl và disinapoyl
Fragaria spp
Dâu tây
(strawberry)
Pg và Cy-3-glucoside
Glycine maxima
u nành (v)
Cy và Dp-3-glucoside
Hibicus
sabdariffa L
Hoa bt dm
Cy, Pn, mono- và biosides
Raphanus
sativus
C ci đ (r)
Pg và Cy-3-sophoroside-5-glucoside acyl hóa vi
-coumaroyl, feruloyl, caffeoyl.
Vitis spp
Nho
Cy, Pn, Dp, Pt và Mv mono và diglucoside  dng
t do và dng acyl hóa
Malus pumila
Táo (apple)
Cyanidin-3-galactoside
Cyd-3-glucose, Cy-3-arabinose, Cy-3-xylose
Prunus persica
ào
Cyanidin-3-glucoside
Sambucus nigra
Cm cháy

s gim. Tuy nhiên khi tng s methoxyl hóa s thu đc kt qu ngc li.
Các Anthocyanin đc glycosyl hóa và acyl hóa s cho dng màu xanh. S
glycol hóa nhng nhóm OH
-
t do làm tng tính bn ca Anthocyanin. Vì vy, các
diglucoside bn hn các monogluside ca cùng mt Anthocyanin.
Anthocyanin có cha 2 hay nhiu nhóm acyl (nh ternatin, platyconin,
cinerarrin, gntiodenphin và zebrrinin) là bn trong môi trng trung tính hoc acid
yu do liên kt hydro gia các nhóm hydroxyl ca các nhân phenolic trong
Anthocyanin và acid vòng thm.
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 12

 pH
Khi pH thay đi làm cho cu trúc ca Anthocyanin thay đi t đó dn ti s
thay đi màu sc. Do trên gc aglycon có mang đin tích dng nên các
Anthocynin có kh nng nhn H
+
hoc OH
-
nên làm thay đi màu sc Anthocynin,
khi tng nhóm OH
-
màu ca anthocynin chuyn theo hng sc màu xanh.
 Nhit đ
Khi tng nhit đ thì tc đ phân hu Anthocyanin tng. i vi
Anthocyanin – 3- glucoside khi nhit đ tng s ct đt liên kt Anthocyanin – 3-
glucoside to thành các gc aglycon, gc aglycon là mt gc kém bn nhit nên
màu ca Anthocyanin gim dn.

Nm 1964, Siegenman cho rng nhng qu táo ging đ s chuyn sang màu
xanh khi đ trong bóng ti. Nm 1968 Vanburen và các cng s tng trình rng
các diglucoside đc acyl hóa và methyl hóa thì các Anthocyanin trong ru bn
nht khi đ ngoài ánh sáng, các diglucoside không b acyl hóa là ít bn hn và
monoglucoside là kém bn nht, nm 1975 Palamidis và Markakis đã tìm thy rng
ánh sáng thúc đy quá trình phân hy Anthocyanin trong nc gii khát có CO
2

đc phi màu vi Anthocyanin t xác nho.
 ng và các sn phm bin tính
 nng đ 100 ppm, đng và các sn phm phân hy ca chúng có tác
dng thúc đy s phân hy các Anthocyanin, trong đó fructose, arabinose, lactose
và sorbose có kh nng phân hy Anthocyanin mnh hn glucose, sucrose, và
maltose.
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 14

Tc đ phân hy ca Anthocyanin liên quan đn tc đ phân hy ca đng.
Các sn phm phân hy ca đng gm có: furfura l,5–hydroxymethyl furfural và
acctaldehyde thu đc t phn ng Mailard hoc t s oxy hóa ca acid ascorbic,
polyuronic hoc  bn thân các Anthocyanin. Nhng sn phm phân hy này d
dàng ngng t vi các Anthocyanin hình thành nhng hp cht phc tp có màu
nâu sm.
 Các ion kim loi
Mt s ion kim loi đa hóa tr có th tng tác vi các Anthocyanin có nhóm
OH
-
 v trí ortho gây ra hiu ng sâu màu (bathocromic). Hin tng này xy ra
khi kim loi tip xúc vi Anthocyanin trong quá trình ch bin rau qu hoc s cho

i vi sc khe con ngi
Ngoài nhng vai trò sinh lỦ đi vi thc vt các hp cht Anthocyanin còn
đc chng minh mang li nhiu ích li v sc khe cho con ngi.
Các hp cht Anthocyanin đc hp thu vào trong d dày  dng phân t
(Passamonti, Vrhovsek và Mattivi, 2002) hoc có th đc h tr bi mt c ch
vn chuyn qua mt. Ngoài ra, phân t Anthocyanin cng không b bin đi di
tác dng ca h vi khun trong rut non. Vì th, phân t Anthocyanin cng không
thay đi trong huyt tng và nc tiu. Các nghiên cu gn đây cho thy các
Anthocyanin ch đc hp thu  mc đ rt thp ch khong 0,016% đn 0,11%
lng tiêu th  ngi.
Mc dù Anthocyanin ch đc c th hp thu mt lng rt nh nhng các
phân t Anthocyanin sau khi đc chuyn hóa có th biu hin nhng hot tính
nh chng ung th, chng x va đng mch, chng viêm, gim mc đ thm
thu, đ v ca mao mch, c ch s đông t ca các tiu huyt cu và thúc đy s
to thành cytokine t đó điu hòa các phn ng min dch. Tt c nhng hot tính
này đu da trên kh nng chng oxy hóa ca các Anthocyanin. Cng nh kh
nng này các hp cht Anthocyanin còn giúp bo v màng d dày chng li nhng
thng tn do s oxy hóa, vì vy hoãn li giai đon đu ca bnh ung th d dày,
ung th rut và rut k.
Hot tính chng oxy hóa
S thiu electron t nhiên ca các phân t Anthocyanin giúp cho các hp
cht này đc bit hot đng. Mt s c ch chng oxy hóa ca Anthocyanin có
đc t các nghiên cu nh:
Anthocyanins  hoa dâm bt (HAS) đc s dng trong nc gii khát và
các loi thuc tho dc. Hot tính sinh hc cht chng oxy hóa ca nó đã đc
nghiên cu và đa ra kt lun rng sc t dâm bt làm gim t l tn thng gan
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 16



t ung th rut kt hoc các t bào AGS t ung th d dày ca con ngi. T l c
ch bi Anthocyanin cao hn đáng k ca các loi khác.
Nm 2001, Meiers cùng cng s cho thy rng aglycones ca hu ht các
Anthocyanin trong thc phm nh cyanidin ( Cy ) và delphinidin ( Del ) có kh
nng c ch s tng trng ca t bào ung th ca con ngi trong ng nghim.
 Hot tính chng các bnh tim mch
Các hp cht flavanoid nói chung và các Anthocyanin nói riêng có kh nng
làm gim nguy c mc bnh đng mch vành bi kh nng ngn chn s oxy hóa
các lipoprotein có t trng thp (LDL) trong huyt tng. iu đó đc chng
minh bi Gracia cùng cng s (1997) báo cáo rng Anthocyanin nh cht chng
oxy hóa lipoprotein mt đ thp (LDL) và lecithin-liposome h thng trong ng
nghim. Trong h thng LDL, khi quá trình oxy hóa đc xúc tác vi 10 mM
đng, malvidin là tt nht cht c ch quá trình oxy hóa, tip theo là delphinidin,
cyanidin, và pelargonidin. Khi quá trình oxy hóa đc xúc tác vi 80 mM đng,
th t ca các hot đng chng oxy hóa thay đi và gim theo th t sau  tt c
nng đ th nghim: delphinidin, cyanidin, malvidin, và pelargonidin. S oxy hóa
các hp cht này đc xem nh mt bc quan trng trong s hình thành các khi
x đng mch và t đó dn đn cn bnh đng mch vành.
Vai trò ca Anthocyanin trong vic phòng chng các bnh tim mch có liên
quan trc tip đn hot tính chng oxy hóa, gim viêm, tng đ bn và kh nng
thm thu ca thành mch máu, c ch s đông t ca các tiu huyt cu.
1.3. Mt s nghiên cu v Anthocyanin
Nm 2004, Hunh Th Kim Cúc, Nguyn Th Lan đã xác đnh hàm lng
Anthocyanin trong mt s nguyên liu rau qu bng phng pháp pH vi sai và kt
qu cho thy hàm lng Anthocyanin trong qu dâu là 1.188%, bp ci tím:
0.909%, v cà tím: 0.441%, lá tía tô: 0.397%, trà đ: 0.335%.
Báo cáo khoá lun tt nghip GVHD: Th.S: Nguyn Th L Thu

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 18

[SVTH: Nguyn Th Kim Ngân-1053010478] Page 19

Cm hoa mc  k lá, thành chùm dài 20-30cm. ài hình chông có 5 rng
bng nhau. Tràng màu tím nht. Nh 10 xp thành 2 bó.
Qu đu, mc thng, dài 7-13cm, đu nhn, có đài tn ti, cha nhiu ht màu
đen (khong 7-10 ht).
Ht đu đen: Ht hình thn, v màu đen bóng có chiu dài 6-10mm, có chiu
ngang t 5-7mm. Rn ht màu sáng trng. Trng lng ht t 100- 115mg. Ht d
v thành hai mnh lá mm. u ca hai mnh ht có cha hai lá chi, mt tr mm.
u đen thuc loi cây ngn ngày, a sáng, thích nghi vi điu kin nóng và
m. Nhit đ thích hp cho cây sinh trng t 20
0
C đn 35
0
C. Gii hn v lng
mua hàng nm rng. Ngoài vic trng d dàng, d thu hoch, đu đen đc ngi
dân nhiu vùng a trng vì nhng giá tr dinh dng và li ích thit thc mà đu
đen mang li. Hình 1.6 : Cây đu đen Hình 1.7 : Ht đu đen
2.1.2. Phân b đa lí
Chi Vigna có khong 20 loài  Vit Nam trong đó nhiu loài là cây trng.
ây là nhóm cây trng rt phong phú vì mi loi có vài ging khác nhau.
u đen có ngun gc Châu Phi và sm đc đa vào trng t thi c đi.
Hin nay cây đc trng rng rãi khp các vùng nhit đi và cn nhit đi t 30
0