PHIẾU ĐĂNG KÝ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KH-CN Tên đề tài: SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT
BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER
CỦA VIRUS VIÊM GAN B

Mã số: Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Cơng nghệ Trẻ

Địa chỉ: Số 1 Phạm Ngọc Thạch, P. Bến Nghé, Q1, Tp. Hồ Chí Minh

Điện thoại: 8233363 Tổng chi phí thực chi: Trong đó: - Từ ngân sách Nhà nước: 50.000.000 VND
- Kinh phí của Bộ/Tỉnh:
- Vay tín dụng:
- Vốn tự có:
- Thu hồi:
Thời gian nghiên cứu:
Thời gian bắt đầu:

B. Phổ biến hạn chế
C. Bảo mật

Tóm tắt kết quả nghiên cứu
1. Đã xây dựng Quy trình xác đònh đột biến basal core promoter bằng kỹ thuật Nested PCR -
RFLP, khả năng phát hiện đột biến ở 30% (3x10
3
bản sao/ml).
2. Đã xây dựng Quy trình xác đònh đột biến kháng lamivudine rt180, rt204 bằng kỹ thuật Nested
PCR – RFLP, khả năng phát hiện đột biến ở 10% (1x10
3
bản sao/ml), độ nhạy 6,25x10
2
bản
sao/ml. Đã tạo được các dòng mang đột biến 180M-204V có tỉ lệ tương đồng về trình tự gene
96,3% và dòng 204I có tỉ lệ tương đồng 95,8% trên plasmid pGEM-T.
3. Đã thử nghiệm 2 quy trình trên 127 mẫu huyết thanh bệnh nhân, đột biến basal core promoter
chiếm tỉ lệ 32% trên nhóm khảo sát, đột biến kháng lamivudine chiếm tỉ lệ 74,4% trên nhóm
khảo sát phổ biến ở 2 dạng 204I và 180M-204V. Các kết quả xác đònh đột biến phù hợp với lâm
sàng.
Kiến nghị về quy mơ và đối tượng áp dụng kết quả nghiên cứu:
1. Kiến nghò sử dụng quy trình để ứng dụng cho các bệnh nhân viêm gan B đang điều trò
lamivudine, trước tiên là các bệnh nhân của Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM.
2. Kiến nghò chuyển giao kết quả nghiên cứu cho Công ty TNHH CNSH Khoa Thương để
tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn và phổ biến quy trình.
3. Đề nghò mở rộng nghiên cứu về tình hình kháng lamivudine trong bệnh nhân viêm gan B
tại TPHCM hiện nay, có thể thực hiện các khảo sát theo thời gian điều trò (1, 2, 3 năm)
SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM
CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM
CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

BÁO CÁO NGHIỆM THU
(ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU)

ĐỀ TÀI

SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH
ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL
CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN CHÍ VINH
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ CỐ VẤN CHUYÊN MÔN:
1. PGS.TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG
2. GS.BSCKII PHẠM HOÀNG PHIỆT

Bảng ghi chú các chữ viết tắt:

Antiviral : Thuốc kháng virus
BCP : Basal core promoter
BET : Ethidium bromide
bp : base pair – cặp base
DNA : Deoxyribonucleic acid
dATP : 2’-deoxyadenosin- 5’- triphosphate
dCTP : 2’-deoxycytidin- 5’- triphosphate
dGTP : 2’-deoxyguanosin- 5’- triphosphate
dTTP : 2’-deoxythymidin- 5’- triphosphate
dUTP : 2’-deoxyuridin- 5’- triphosphate
dNTP : 2’-deoxynucleosid- 5’- triphosphate
DW : Distilled water – nước cất vô trùng
EDTA : Ethyldiamin tetra-acetic acid
HBV : Hepatitis B Virus, Virus viêm gan B
IFN : Interferon
LAM : Lamivudine
M : Methionine
Mut : Mutation – đột biến
Nu : Nucleotide
OLT : Orthotopic liver transplant – ghép gan
PCR : Polymerase chain reaction
Phage : Thực khuẩn thể
Plasmid : Thể mang DNA mục tiêu – dùng trong kỹ thuật tạo dòng
Primer : Mồi – dùng trong phản ứng PCR


PHAÀN 2:

NOÄI DUNG – PHÖÔNG PHAÙP
PHAN 3:

KET QUA BAỉN LUAN
1.1. Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core
promoter
8
1.2. Tạo dòng lưu trữ các dạng cơ bản của đột biến kháng lamivudine,
từ đó tạo các sản phẩm PCR chứng dương
8
2. Thử nghiệm thay đổi một số yếu tố
2.1. Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay cho phương pháp
Boom
9
2.2. Nested PCR thay cho PCR 1 bước 10
2.3. Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới hạn 11
2.4. Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3% 12
3. Thử khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có hỗn hợp HBV đột
biến/hoang dại
3.1. Khả năng phát hiện đột biến Basal core promoter trong huyết thanh
hỗn hợp
12
3.2. Khả năng phát hiện đột biến kháng lamivudine trong huyết thanh
hỗn hợp
13
3.3. Độ nhạy của quy trình xác đònh đột biến kháng lamivudine 13
4. Thực hiện 2 quy trình đã được cải tiến trên huyết thanh bệnh nhân
4.1. Xác đònh đột biến Basal core promoter trên huyết thanh bệnh nhân 14
4.2. Xác đònh đột biến kháng lamivudine trên huyết thanh bệnh nhân 14

PHẦN 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
1. Kết quả về việc tạo vật liệu cho quy trình
1.1. Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core 15
promoter
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt:
1.
Nguyễn Hữu Chí, Bệnh viêm gan siêu vi, trang 69-140, NXB ITAXA 1993.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, 1997.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Kỹ thuật Di truyền, Giáo trình sau đại học 2005.
4. Đinh Dạ Lý Hương, Bùi Hữu Hoàng, Trần Thiện Tuấn Huy, Trần Ngọc Bảo,
Viêm gan siêu vi B
– từ cấu trúc siêu vi đến điều trò, NXB Đà Nẵng, 2000.
5. Trương Thò Xuân Liên, Virus học, Bài giảng sau đại học 2005.
6. Phạm Hoàng Phiệt, Diễn biến tự nhiên của nhiễm siêu vi viêm gan B mạn tính,
Sinh hoạt thường kỳ lần II Hội gan mật TP HCM, 1999.
7. Trương Bá Trung, Điều trò thêm Adefovir dipivoxyl trên bệnh nhân viêm gan B
kháng lamivudine, Hội nghò Tiếp cận đa phương với bệnh viêm gan virus B/C, TP
HCM 10/2006.

21. Gerald Y., Antonio Giulivi, Hepatitis B viral mutants and their relevance to the
health care system, 9, 2001.
22. Gish RG, Leung N, Safety and antiviral activity of emtricitabine (FTC) for the
treatment of chronic hepatitis B infection: a two-year study, J. Hepatol
Jul.2005;43(1): 60-68
23. Jake Liang T, Michael Craig, Summary of mutations associated with resistance
to HBV drugs, Clinical Care Options, 7, 2006.
24. Kakumu S., Prevalence of hepatitis B, hepatitis C and GB virus/ hepatitis G
virus in liver disease patients and in habitants in Ho Chi Minh City, VietNam, J
Med Virol 54, pp. 243-248.
25. Kenji Abe, Naoto Aiba, Complete nucleotide sequence of hepatitis B virus,
6/2003.
26. Kenji Abe, Tran Thien Tuan Huy, Characteristics of core promoter and precore
stop codon mutants of hepatitis B virus in Viet Nam, Journal of medical virology
2004,74:228-236.
27. Kenji Abe, Traàn Thieän Tuaán Huy, Molecular epidemiology of Hepatitis B and
C virus infection in Asia, Pediatrics International, 2004.
28. Lai CL, Dienstag J, Prevalence and clinical correlates YMDD variants during
lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B, Clin Infect Dis
2003;36:687-696.
29. Lai CL, Leung N, A 1-year trial of telbivudine, lamivudine, and the
combination in patients with Hepatitis B e antigen-positive chronic Hepatitis B,
Gastroenterology 2005;129:528-536.
30. Levine, 2002, Efficacies of entecavir against lamivudine-resistant Hepatitis B
virus replication and recombinant polymerases in vitro, Antimicrobial agents and
chemotherapy, Aug.2002, p.2525-2532.
31. Liaw YF, Chien RN, Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after
emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy, Hepatology
1999,30:567-572.
32. Locarnini S, Molecular virology and the development of resistant mutants:

46. Sugauchi F., Epidemiologic and virologic characteristic of hepatitis B virus
genotype B having the recombination with genotype C, Gastroenterology 2003,
124:925-932.
47. Sugauchi F., Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination
with genotype C over the precore region plus the core gene, J Virol 2002, 76:5985-
5992.
48. Tanaka T., Okamoto H., Hepatitis B virus strains with mutations in the core
promoter, Hepatology 2001; 33:1527-1532.
49. Takahashi K., The precore/core mutant T
1762
A
1764
of hepatitis B virus: clinical
significance and an easy method for detection, 1995, J Hepatol. 2005, 43:60-66.
50. Tenny DJ., Levine SM., Clinical emergence of entercavir resistant hepatitis B
virus requires additional substitutions in virus already resistant to lamivudine,
Antimicrob Agents Chemother 2004;48:3498-3507.
51. Yuen MF, Sablon E, Factors associated with hepatitis B virus DNA
breakthrough in patients receving prolonged lamivudine therapy, Hepatology
2001;34:785-791.
52. Zarski 2004, Hepatitis B: Treatment strategies for current available drugs.
Josee Gauthier – Eric J. Bourne, Quantitation of hepatitis B viremia and
emergence of YMDD variants in patients with chronic hepatitis B treated with
lamivudine, The journal of infectious disease 1999, 180:1757-62.
53. World Health Organization Fact Sheet/204, Hepatitis B, 2000.
53. Kenji Abe, Characteristic of HBV in Ghana: Full length genome sequences
indicate the endemecity of Genotype E in West Africa, Journal of Medical
Virology 78, 2006, 178-184.
D09 Unknown 8T 8 22.95 4.980 9.54E+04 9.54E+04 N/A
22.95 N/A
D10 Unknown 9T 9 14.98 7.335 2.26E+07 2.26E+07 N/A
14.98 N/A
D11 Unknown 10T 10 15.39 7.214 1.64E+07 1.64E+07 N/A
15.39 N/A E02 Unknown 1B 11 29.33 3.093 1.04E+03 1.04E+03 N/A
29.33 N/A
E03 Unknown 2B 12 29.14 3.151 1.42E+03 1.42E+03 N/A
29.14 N/A
E04 Unknown 3B 13 28.65 3.295 1.97E+03 1.97E+03 N/A
28.65 N/A
E05 Unknown 4B 14 26.08 4.055 1.13E+04 1.13E+04 N/A
26.08 N/A
E06 Unknown 5B 15 26.80 3.841 6.94E+03 6.94E+03 N/A
26.80 N/A
E07 Unknown 6B 16 23.60 4.699 4.49E+04 4.49E+04 N/A
23.60 N/A
E08 Unknown 7B 17 21.76 5.331 2.14E+05 2.14E+05 N/A
21.76 N/A
E09 Unknown 8B 18 24.62 4.487 3.07E+04 3.07E+04 N/A
24.62 N/A
E10 Unknown 9B 19 15.09 7.326 2.01E+07 2.01E+07 N/A
15.01 N/A
E11Unknown 10B 20 15.54 7.171 1.48E+07 1.48E+07 N/A

Mẫu 1T đến 10T: Mẫu theo thứ tự 1 đến 10, tách chiết bằng phương pháp Tủa
Mẫu 1B đến 10B: Mẫu theo thứ tự 1 đến 10, tách chiết bằng phương pháp Boom


-TTAAAGGTCT-
-TTAATGATCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAATGATCT-
-TTAATGATCT- Hoang dại
T
1762
A
1764
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại

1764

Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợpPhụ lục 3: Một số kết quả đối chiếu giữa giải trình tự và PCR-RFLP
phân tích tại codon rt180

Kí
hiệu
mẫu
Trình tự gen hoang dại
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
(Pol nu seq 657 676)

Kết quả
giải trình
tự gen

CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
CAGTCCGTTTCTCCATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCATGGCT
CAGTCCGTTTCTC
CATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
CAGTCCGTTTCTC
CATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT

180wt
180wt
180wt
180 LỈM
180wt
180 LỈM
180 LỈM
180 LỈM
180wt
180 LỈM
180wt

180wt
180wt
180wt
180 LỈM
180wt

Kết quả
giải trình
tự genï
Kết quả
PCR-
RFLP
Kết luận

KL01
KL02
KL04

KL05 GGCTTTCAGT
CATGTGGATGAT
GGCTTTCAGTCATATTGATGAT
GGCTTTCAGTCATATGGATGAT
(thiếu dạng đột biến 204 MỈV)
GGCTTTCAGT
CATATGGATGAT
(thiếu dạng đột biến 204 MỈV)

204 MỈV
204 MỈI
204wt

204wt


GGCTTTCAGTCATATTGATGAT
GGCTTTCAGT
CATGTGGATGAT
GGCTTTCAGTCATATGGATGAT

204 MỈI
204 MỈV
204 MỈV
204 MỈV
204 MỈI
204 MỈV
204 MỈV
204 MỈV
204wt

204 MỈI
204 MỈV
204 MỈI
204 MỈV
204 MỈI
204 MỈV
204 MỈI
204 MỈV
204wt

Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp

541 caaggcacct ctatgtttcc ctcttgttgc tgtacaaaac cttcggacgg aaactgcact
601 tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc gcaagattcc tatgggagtg ggcctcagtc
661 cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc
721 actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacaacatc
781 ttgaatccct ttttacctct attaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttgaacc
841 ctaataaaac caaacgttgg ggctactccc ttaacttcat gggatatgta attggaagtt
901 ggggtacttt accgcaagac catattatac taaaactcaa gcaatgtttt cgaaaactgc
961 ctgtaaatag acctattgat tggaaagtat gtcagagaat tgtgggtctt ttgggctttg
1021 ctgccccttt tacacaatgt ggctatcctg ccttaatgcc tttatatgca tgcatacaat
1081 ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatatctga
1141 acctttaccc cgttgcccgg caacggtcag gtctctgcca agtgtttgct gacgcaaccc
1201 ccactggatg gggcttggct attggccatc gccgcatgcg tggaaccttt gtggctcctc
1261 tgccgatcca tactgcggaa ctcctagcag cttgttttgc tcgcagccgg tctggagcga
1321 aactgatcgg aacagacaac tctgttgttc tctctcggaa atacacctcc tttccatggc
1381 tgctagggtg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg
1441 cgctgaatcc cgcggacgac ccgtctcggg gccgtttggg tctctaccgt ccccttcttc
1501 atctgccgtt ccggccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggtctcc ccgtctgtgc
1561 cttctcatct gccggtccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac
1621 cgtgaacgcc caccaggtct tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc
1681 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaagg actgggagga
1741 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt
1801 ctgttcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcatg ttcatgtcct
1861 actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgacccgtat
1921 aaagaatttg gagcttctgt ggagttactc tcttttttgc cttctgactt ctttccttct
1981 attcgagatc tcctcgacac cgcttctgct ctgtatcggg aggccttaga gtctccggaa
2041 cattgttcac ctcaccatac agcactcagg caagctattc tgtgttgggg tgagttgatg
2101 aatctggcca cctgggtggg aagtaatttg gaagacccag catccaggga attagtagtc
2161 agctatgtca atgttaatat gggcctaaaa atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc
2221 tgtcttactt ttggaagaga aactgttctt gagtatttgg tgtcttttgg agtgtggatt
2281 cgcactcctc ctgcttacag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact

- Đột biến Basal core promoter
Nội dung: Đề tài đạt được các nội dung như đã đăng ký.
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Tạo vật liệu cho quy trình Đã tạo được:
- Sản phẩm PCR chứng dương của đột biến
kháng lamivudine (rt180, rt204)
- Sản phẩm PCR chứng dương của đột biến
Basal core promoter (1762/1764)
- Plasmid lưu trữ các dạng cơ bản của đột
biến kháng lamivudine.
Thử nghiệm thay đổi một số yếu tố Đã thực hiện các cải tiến:
- Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay
cho phương pháp Boom
- Nested – PCR thay cho PCR 1 bước
- Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới
hạn
- Điện di microfluidic thay cho điện di
agarose 3%

Thử khả năng phát hiện đột biến
trong huyết thanh có hỗn hợp HBV
hoang dại và đột biến. Mục tiêu là
phát hiện được đột biến ở tỉ lệ 30%.
Xây dựng quy trình kháng
lamivudine có độ nhạy 10
3
-10