BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
NGUYỄN THỊ CÚC TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT
ĐẶC TRƯNG CỦA COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA
(Pangasius hypophthalmus)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nha Trang - 2013



LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả
nêu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào.

Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Cúc ii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ
Thực phẩm cùng toàn thể Thầy cô Trường Đại học Nha Trang lòng biết ơn, sự kính
trọng và niềm tự hào được học tập, nghiên cứu tại Trường trong những năm qua.
Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy
Nguyễn Anh Tuấn và thầy Nguyễn Thế Hân đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới Viện Công nghệ Sinh học và Môi
trường, Trung tâm Thực hành thí nghiệm trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên cứu tại đây. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị
Nguyễn Như Thường và chị Đào Thị Ngà đã tận tình giúp đỡ tôi thực hành thí nghiệm
trong quá trình nghiên cứu.
Với tất cả sự kính trọng và lòng chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình
và bạn bè đã luôn ủng hộ tôi về vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập,

1.2. Tổng quan về collagen 9
1.2.1. Giới thiệu chung về collagen 9
1.2.2. Thành phần cấu tạo và cấu trúc phân tử collagen 9
1.2.3. Phân loại collagen theo cấu trúc 13
1.2.3.1. Collagen dạng sợi 14
1.2.3.2. Collagen không phải dạng sợi 16
1.2.4. Tính chất của collagen 17
1.2.4.1. Sự hút nước của collagen 17
1.2.4.2. Sự tương tác của collagen với acid và kiềm 18
1.2.4.3. Một số đặc điểm chất lượng của collagen 19
1.2.5. Ứng dụng của Collagen 20
1.2.5.1. Ứng dụng trong thực phẩm 20
1.2.5.2. Ứng dụng trong y dược 20
1.2.5.3. Ứng dụng trong mỹ phẩm 21
1.3. Các phương tách chiết collagen 22
1.3.1. Nguyên lý chung 22 iv

1.3.2. Nguyên lý tách chiết collagen bằng acid 24
1.3.3. Tách chiết bằng enzyme 24
1.4. Tình hình nghiên cứu collagen 26
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 26
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 28
1.5. Một số quy trình sản xuất collagen 29
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Đối tượng nghiên cứu 32
2.1.1. Da cá tra 32
2.1.2. Hoá chất 32

3.2. Kết quả tối ưu hoá công đoạn khử tạp chất phi collagen bằng phương pháp bề
mặt đáp ứng 51
3.2.1. Kết quả xác định mô hình hồi quy cho hàm mục tiêu hiệu suất khử protein
phi collagen (PPC). 52
3.2.2. Kết quả xác định mô hình hồi quy cho hàm mục tiêu hiệu suất khử lipit 54
3.2.3. Kết quả xác định mô hình hồi quy cho hàm mục tiêu mức độ tổn thất collagen 56
3.2.4. Tìm thông số tối ưu cho công đoạn khử tạp chất phi collagen 58
3.3. Kết quả tối ưu hoá công đoạn chiết collagen bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm 60
3.3.1. Kết quả xác định mô hình hồi quy cho hàm mục tiêu hiệu suất thu hồi collagen60
3.3.2. Kết quả xác định mô hình hồi quy cho hàm mục tiêu độ nhớt collagen 63
3.3.3. Tìm thông số tối ưu cho công đoạn chiết collagen 65
3.4. Kết quả xác định thông số cho công đoạn kết tủa collagen. 67
3.4.1. Kết quả xác định nồng độ muối NaCl cho công đoạn kết tủa collagen 67
3.4.2. Kết quả xác định thời gian tủa cho công đoạn kết tủa collagen 69
3.5. Đề xuất quy trình sản xuất collagen từ da cá tra 71
3.6. Kết quả sản xuất thử theo quy trình đề xuất và xác định một số tính chất đặc
trưng của sản phẩm collagen 72
3.6.1. Hiệu suất thu hồi và thành phần hoá học của collagen từ da cá tra 73
3.6.2. Kết quả quét phổ UV-Vis của sản phẩm collagen 73
3.6.3. Kết quả xác định nhiệt độ biến tính sản phẩm collagen 74
3.6.4. Kết quả thành phần acid amin 75
3.6.5. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/ cơ chất và thời gian thuỷ phân đến
khả năng khử gốc tự do của dịch thuỷ phân collagen 76
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 78
I. Kết luận 78
II. Đề xuất ý kiến: 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO 80
PHỤ LỤC


collagen (theo phần mềm DX 8) 59
Bảng 3.5: Kết quả thí nghiệm tối ưu công đoạn khử tạp chất phi collagen theo
tiên đoán và thực nghiệm 60
Bảng 3.6: Điều kiện tối ưu công đoạn chiết collagen 66
Bảng 3.7: Kết quả tiên đoán thông số tối ưu công đoạn chiết collagen 66
Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm tối ưu công đoạn chiết collagen theo tiên đoán
và thực nghiệm 66
Bảng 3.9. Thành phần acid amin của collagen từ da cá tra 75 viiiDANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1: Cá tra nuôi tại đồng bằng sông Cửu Long 5
Hình 1.2: Cấu trúc của tropocollagen 9
Hình 1.3: Sự tham gia của hydroxyproline vào liên kết hydro giữa các chuỗi
polypeptide 10
Hình 1.4: Cấu trúc xoắn ba của collagen 12
Hình 1.5: Sự sắp xếp của tropocollagen tạo thành vi sợi collagen trong cơ thể 13
Hình 1.6: Một số dạng collagen trong cơ thể 13
Hình 1.7: Sự sắp xếp của collagen dạng sợi 14
Hình 1.8: Sự sắp xếp của một số loại collagen không tạo cấu trúc sợi 16
Hình 1.9: Quá trình tách chiết collagen bằng enzyme pepsin 26
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian xử lý tới hiệu suất khử PPC 54
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian xử lý tới hiệu suất khử lipit 56
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian xử lý tới mức độ tổn thất
collgen 58
Hình 3.4 : Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic và thời gian chiết tới hiệu suất chiết
collgen 62

phẩm và thực phẩm. Collagen được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để làm
màng bao gói ăn được như làm vỏ bao xúc xích, làm màng bao gói thực phẩm ăn liền.
Collagen thủy phân thành gelatin cũng được ứng dụng nhiều trong sản xuất thực phẩm
và y học. Trong ngành y dược collagen, gelatin được ứng dụng để điều trị bệnh cao
huyết áp, bệnh viêm khớp xương mãn tính, làm gạc băng bó vết thương, ứng dụng
trong kỹ thuật nuôi cấy mô để tái tạo da, xương và làm mạch máu nhân tạo…[22, 23].
Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, các sản phẩm và phương pháp trẻ hóa làn da bằng
collagen đang rất được ưa chuộng và ngày càng phổ biến trên thế giới. Ngoài ra, các
sản phẩm thủy phân từ collagen có nhiều ứng dụng khác như làm phụ gia sản xuất
thực phẩm chức năng, là nguồn các peptide có hoạt tính sinh học[32].
Collagen có thể được tách chiết từ nhiều nguồn nguyên liệu như da, xương của
bò, heo; da, xương, vây, vảy của các loài cá nước ngọt và nước mặn; da gà; da mực và
râu bạch tuộc… Các nhà khoa học trên thế giới còn chỉ ra rằng, trong số các nguồn
nguyên liệu nêu trên thì nguồn nguyên liệu còn lại từ ngành công nghiệp chế biến cá là
tốt nhất bởi vì nguồn nguyên liệu này cho hiệu suất tách chiết collagen cao. Hơn nữa
collagen sản xuất từ nguồn nguyên liệu còn lại của ngành công nghiệp chế biến cá
không có mối nguy từ các bệnh truyền nhiễm như bệnh lở mồm long móng ở bò, heo
hay bệnh bò điên. Đồng thời collagen sản xuất từ cá không gặp phải những rào cản tín
ngưỡng khi tiêu thụ ở những quốc gia có tín ngưỡng không sử dụng các sản phẩm có
nguồn gốc từ bò, heo [22]. 2

Trong ngành công nghiệp chế biến cá, sản phẩm phile chỉ chiếm khoảng 30%
trọng lượng thân cá, phần còn lại chủ yếu là da và xương chiếm đến 70% (trong đó da
chiếm khoảng 5-7%) [10]. Ở nhiều nước trên thế giới, da cá được xem là nguồn
nguyên liệu cho sản xuất collagen. Tuy nhiên ở nước ta hiện nay, da cá tra mới chỉ
được cấp đông và xuất khẩu cho các công ty nước ngoài với mức giá chưa tới 0,5
USD/kg. Trong khi đó, collagen nhập khẩu có mức giá từ 25-30 USD/kg. Với mức giá

f
, nhiệt dung riêng trên và dưới điểm băng – C
pa
& C
pb
, hệ số dẫn nhiệt
trên và dưới điểm băng – k
a
& k
b
).
2. Tối ưu hóa hai công đoạn: khử thành phần tạp chất phi collagen và chiết
collagen trong quy trình sản xuất collagen từ da cá tra nuôi tại Việt Nam.
3. Xác định một số tính chất của collagen sản xuất theo quy trình tìm được
(nhiệt độ biến tính - T
d
, bước sóng hấp thụ cực đại - 
max
, thành phần acid amin).
4. Đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch collagen thuỷ phân.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài hoàn thành sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo về thành
phần hóa học cơ bản và các tính chất nhiệt lý của da cá tra, quy trình công nghệ tách
chiết và một số tính chất của collagen chiết từ da cá tra. Những kết quả này sẽ là cơ sở
cho những nghiên cứu và ứng dụng sau này.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài thực hiện thành công sẽ có những ý nghĩa thực tiễn như sau:
 Cung cấp qui trình sản xuất collagen từ da cá tra phù hợp với điều kiện ở Việt
Nam, làm cơ sở để triển khai sản xuất thực tế tại các doanh nghiệp chế biến cá tra.

- Pangasius pangasius
- Pangasius pleurotaenia
- Pangasius sutchi
Tên loài Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth, W.J. sử dụng lần đầu
vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá tra và sau đó được nhiều tác giả khác sử dụng
phổ biến đến nay. Tên đặt cho loài này khác nhau theo các nước trong vùng nó phân
bố. Ở Campuchia là trey pra (tên Khmer), Lào là pa souay kheo, pa suay, Thái Lan là
pla saa wha, pla suey và Việt Nam là cá tra [7]. 5Hình 1.1: Cá tra nuôi tại đồng bằng sông Cửu Long
Phân bố: Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê Kông, có mặt ở cả 4 nước Lào,
Campuchia, Thái Lan và Việt Nam. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá
sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng
thành chỉ thấy trong ao nuôi và ít gặp trong tự nhiên, do cá có tập tính di cư ngược
dòng sông Mê Kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Khảo sát chu kỳ di cư
của cá tra ở địa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di
cư về hạ lưu từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm.
Hình thái, sinh lý: Cá tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lưng xám đen,
bụng hơi bạc, miệng rộng, có 2 đôi râu dài. Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có
thể sống được ở vùng nước hơi lợ (nồng độ muối 7-10 ), có thể chịu đựng được nước
phèn với pH >5, ít chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 15
o
C, chịu nóng tới 39
o
C. Cá tra
có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các lòai cá khác. Cá có cơ quan hô hấp phụ

phân biệt được cá đực và cá cái. Bắt đầu phân biệt được cá đực cái từ giai đoạn II, các
giai đoạn sau, buồng trứng tăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có hình
dạng phân nhánh, màu hồng chuyển dần sang màu trắng sữa.
Trong sinh sản nhân tạo có thể nuôi thành thục và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên,
cá tra có thể tái phát dục 1-3 lần trong một năm.
1.1.2. Tình hình nuôi trồng và xuất khẩu cá tra
Cá tra được nuôi trồng rộng rãi ở đồng bằng sông Cửu Long vào đầu những
năm 2000, và cho đến nay trải qua hơn 10 năm phát triển cá tra đã trở thành đối tượng
nuôi quan trọng và xuất khẩu chủ lực chỉ đứng thứ hai, sau tôm sú. Theo Tổng cục
Thủy sản, trong năm 2010 diện tích nuôi cá tra đạt 5.400 ha; sản lượng đạt trên 1,141
triệu tấn. Trong năm 2011, tổng diện tích nuôi cá tra đạt khoảng 5.430 ha, sản lượng cả
năm đạt trên 1,195 triệu tấn, năng suất trung bình đạt 307 tấn/ha. Do những biến động
của nền kinh tế, nhu cầu nhập khẩu các sản phẩm cá tra giảm, đồng thời cũng do giá
bán cá tra không ổn định, thiếu nguồn vốn… làm cho người dân do dự tiếp tục đầu tư
nuôi cho vụ tiếp theo. Do đó diện tích nuôi những tháng đầu năm 2012 suy giảm nhẹ.
Theo báo cáo của Tổng cục Thuỷ sản, tính đến tháng 8 năm 2012 diện tích nuôi và sản
lượng thu hoạch cá tra như sau: diện tích nuôi đạt 4.631 ha, diện tích thu hoạch 2.494
ha đạt sản lượng 796.616 tấn, năng suất trung bình đạt 270 tấn/ha. Tình hình sản xuất 7

và tiêu thụ cá tra đến ngày 30/8/2012 tại các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long được
thống kê trong bảng 1.1.

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra đến ngày 30/8/2012

STT Địa phương
Diện tích nuôi
(ha)

tháng đầu năm 2012 được liệt kê trong bảng 1.2.

8

Bảng 1.2: Xuất khẩu cá tra Việt Nam 7 tháng đầu năm 2012
THỊ TRƯỜNG
Từ 1/1/2012 đến
31/7/2012 (GT)
% GT So với cùng kỳ 2011 (%)
EU 254,016 25,6 -19,7
Tây Ban Nha 55,276 5,6 -6,7
Hà Lan 43,712 4,4 -24,9
Đức 32,710 3,3 -42,6
Italia 21,635 2,2 -3,4
Mỹ 214,246 21,6 +32,9
ASEAN 63,861 6,4 +4,8
Singapore 21,095 2,1 +0,2
Philippines 15,768 1,6 +17,5
Malaysia 12,774 1,3 +4,4
Mexico 52,575 5,3 -0,3
TQ và HK 39,894 4,0 +42,5
Hồng Kông 24,833 2,5 +11,8
Brazil 34,356 3,5 -0,02
Colombia 27,151 2,7 +21,5
Nga 22,268 2,2 -33,8
Các TT khác 282,803 28,5 +4,1
Tổng cộng 991,172 100 +1,0

1.2.2. Thành phần cấu tạo và cấu trúc phân tử collagen
Đơn vị cấu trúc cơ bản của collagen là tropocollagen. Mỗi phân tử tropocollagen
có chiều dài khoảng 300 nm, đường kính khoảng 1,5 nm, bao gồm ba chuỗi polypeptid
(ba chuỗi α) xoắn lại với nhau tạo thành cấu trúc xoắn ba (Hình 1.2). Ba chuỗi này gắn
kết với nhau chủ yếu nhờ vào các liên kết hydro giữa các nhóm –CO và –NH kế liền
nhau trên mạch polypeptid [29].
Phân tử tropocollagen có thể là một homotrimer bao gồm ba chuỗi α giống nhau
như collagen loại II, III hoặc có thể là một heterotrimer bao gồm hai hoặc ba loại chuỗi
α khác nhau như collagen loại I, V Chuỗi α được ký hiệu theo công thức chung là
αn(N), trong đó N là chữ số La Mã cho biết loại collagen và n là số hiệu của chuỗi α.
Ví dụ, công thức của collagen I là [α1(I)]
2
α2(I), của collagen II là [α1(II)]
3
…

Hình 1.2: Cấu trúc của tropocollagen 10Mỗi chuỗi polypeptide có khoảng 1050 amino acid, trong đó khoảng 33 % là
glycine, 25 % là proline và hydroxyproline. Trình tự amino acid trong mỗi chuỗi
polypeptid của collagen có điểm đặc trưng là sự lặp lại của bộ ba amino acid Gly-X-Y,
trong đó X thường là proline, Y thường là hydroxyproline hoặc hydroxylysine. Sự lập lại
trình tự này xảy ra ở tất cả các loại collagen, tuy nhiên có thể bị gián đoạn ở những vị trí
xác định trong những đoạn xoắn ba của loại collagen không hình thành cấu trúc sợi [12].
Collagen có bản chất là protein, tuy nhiên thành phần acid amin của nó có nhiều
khác biệt so với các loại protein khác. Trong collagen có nhiều glycine, proline,

đã cho thấy sự ổn định của mạch polypepetide (Pro-Hyp-Gly)
10
(T
m
=60
o
C) lớn hơn rất
nhiều so với mạch polypeptide (Pro-Pro-Gly)
10
(T
m
=30
o
C). Nghiên cứu đã chỉ ra rằng
sự bền nhiệt này là do nhóm hydroxyl của Hyp hướng ra phía bề mặt ngoài cấu trúc
xoắn ốc, không tham gia vào liên kết hydro bên trong cấu trúc nên nhóm này sẽ tham
gia hình thành liên kết hydro nhờ cầu nối trung gian là phân tử nước (Privalov, 1982).
Lúc này nhóm hydroxyl đóng vai trò liên kết các phân tử nước nội và ngoại phân tử
thành những cầu nước liên tục nhau (Bella và cộng sự, 1994, 1995) [13].
Hydroxylysine được tìm thấy trong collagen với tỷ lệ khá thấp khoảng 6-20
gốc/1000 acid amin, tuy nhiên nó đóng vai trò quan trọng vào sự ổn định cấu trúc cho
collagen. Sự ổn định này nhờ vào khả năng tạo liên kết ngang của hydroxylysine cho
collagen thông qua liên kết cộng hóa trị.
Proline và glycine là những amino acid quan trọng để hình thành các vòng xoắn.
Proline giúp hình thành cấu trúc xoắn của mỗi chuỗi α nhờ vào cấu trúc vòng là nguyên
nhân tạo ra những chỗ vặn trên sợi peptide. Glycine là amino acid nhỏ nhất và không có
mạch bên nên chỉ có glycine mới đủ nhỏ để có thể cuộn vào bên trong lõi cấu trúc xoắn.
Do đó, sự lặp lại của bộ ba amino acid Gly-X-Y trong mỗi chuỗi polypeptid cho phép
hình thành cấu trúc xoắn ba với acid amin glycine cuộn vào bên trong lõi xoắn ốc còn
các acid amin X và Y lộ ra phía bề mặt ngoài (Hình 1.4) [29].
Hình 1.5: Sự sắp xếp của tropocollagen tạo thành vi sợi collagen trong cơ thể Trong động vật, collagen có cấu trúc thứ bậc, các phân tử tropocollagen sẽ liên
kết lại với nhau để tạo thành vi sợi (microfibril). Các vi sợi là đơn vị cấu trúc để hình
thành các sợi, bó sợi lớn hơn và các mạng lưới có trong mô, xương và các màng cơ
bản (Hình 1.6) [13].

Hình 1.6: Một số dạng collagen trong cơ thể
1.2.3. Phân loại collagen theo cấu trúc [24, 29]
Trong cơ thể người, tìm thấy 28 loại collagen khác nhau, các dạng và loại collagen
được liệt kê trong bảng 1.3. Dựa vào cấu trúc và cách tổ chức sắp xếp các phân tử,
collagen được phân chia thành hai nhóm chính: collagen dạng sợi (Fibrillar collagens)
(A): Trình tự acid amin của một chuỗi polypeptide collagen,
(B): Chuỗi polypeptide collagen, (C): Tropocollagen, (D): Vi sợi collagen 14

và collagen không phải dạng sợi (Non-Fibrillar collagens). Nhóm collagen không tạo
thành cấu trúc sợi bao gồm nhiều dạng khác nhau: collagen dạng màng, FACIT collagen
(FACIT: Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple helices), Collagen chuỗi
hạt, collagen chuỗi ngắn, collagen chuyển màng và một số loại collagen khác.
1.2.3.1. Collagen dạng sợi
Trong số các loại collagen, collagen dạng sợi là phổ biến nhất, chiếm khoảng 90%
tổng lượng collagen trong cơ thể. Collagen dạng sợi có đặc điểm là lặp đi lặp lại một dải
có chu kỳ khoảng 64-67 nm (chu kỳ D). Mỗi sợi collagen được tạo thành bởi các phân
tử tropocollagen có chiều dài 300 nm, chiều rộng 15 nm được xếp so le nhau một

2
α2(I)
II [α1(II)]
3

III [α1(III)]
3

V
[α1(V)]
3

[α1(V)]
2
α2(V)
α1(V)α2(V) α3(V)
XI α1(XI)α2(XI)α3(XI)
XXIV [α1(XXIV)]
3

Collagen dạng sợi
XXVII [α1(XXVII)]
3

IV
[α1(IV)]
2
α2(IV)
α3(IV)α4(IV) α5(IV)
[α5(IV)]

XII [α1(XII)]
3

XIV [α1(XIV)]
3

XVI [α1(XVI)]
3

XIX [α1(XIX)]
3

XX [α1(XX)]
3

XXI [α1(XXI)]
3
FACIT collagen
XXII [α1(XXII)]
3

XIII [α1(XIII)]
3