BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ
CHƯƠNG TRÌNH KHCN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC.10/11-15
“ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ TIÊN TIẾN
PHỤC VỤ BẢO VỆ CHĂM SÓC SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG”
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN
PHÒNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG EV71 Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
MÃ SỐ: KC.10.TN08/11-15
Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài: ThS. Vũ Hồng Nga GS. TSKH. Nguyễn Thu Vân
Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ
10
1.2.2. Đặc điểm lâm sàng
11
1.3. CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM
13
1.4. DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ
14
1.4.1. Kiểu gen và đặc điểm lưu hành chung của EV71
14
1.4.2. Dịch tễ học bệnh ở Việt Nam
17
1.5. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮCXIN PHÒNG BỆNH
TAY CHÂN MIỆNG EV71
19
1.5.1. Các vắcxin EV71 dự tuyển
19 1.5.2. Công nghệ sản xuất vắcxin tiềm năng
23
1.6. TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT VẮCXIN
24
1.6.1. Yêu cầu chất lượng của tế bào sử dụng sản xuất vắcxin
24
1.6.2. Dòng tế bào thường trực Vero
26
1.7. CHỦNG GIỐNG VIRÚT SỬ DỤNG TRONG
SẢN XUẤT VẮCXIN
29
1.8. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
2.1.4.1. Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai trên
động vật thí nghiệm
43
2.1.4.2. Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá virút TCID50
45
2.1.4.3. Thử nghiệm kiểm tra tính ổn định di truyền
46
2.1.4.4. Thử nghiệm kiểm tra vi khuẩn lao
51
2.1.4.5. Thử nghiệm kiểm tra virút viêm gan A
53
2.1.4.6. Thử nghiệm kiểm tra virút viêm gan B
54
2.1.4.7. Thử nghiệm kiểm tra virút viêm gan C
56
2.1.4.8. Xác định nhận dạng EV71 bằng phương pháp
hiển vi điện tử
56
2.2. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
VẮCXIN EV71 TRÊN TẾ BÀO VERO
57
2.2.1. Quy trình sản xuất vắcxin EV71 trên tế bào Vero
57
2.2.1.1. Gây nhiễm và nuôi cấy virut
57
2.2.1.2. Thu hoạch và tinh sạch virut.
58
2.2.1.3. Cô đặc, bất hoạt, tinh chế virút, pha bán thành phẩm
cuối cùng
81
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
82
3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG CHỦNG GIỐNG EV71
CHO SẢN XUẤT VẮCXIN
82
3.1.1. Nguồn gốc chủng EV71
83
3.1.2. Tế bào sử dụng sản xuất hệ chủng giống EV71
84
3.1.2.1. Tế bào Vero sản xuất chủng EV71 giống gốc
và giống sản xuất
84
3.1.2.2. Kiểm tra tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng EV71
giống gốc và giống sản xuất
85
3.1.3. Quy trình sản xuất chủng EV71 giống gốc (Master seed lot)
86
3.1.4. Quy trình sản xuất chủng EV71 giống sản xuất
(Working seed lot)
87
3.1.5. Kết quả xây dựng hệ thống chủng giống EV71
88
3.1.5.1. Kết quả sản xuất hệ chủng giống EV71
88
3.1.5.2. Hình ảnh chủng EV71 trên kính hiển vi điện tử
88 3.1.5.3. Tính ổn định di truyền của chủng gốc giống (MSV),
107
3.2.4. QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT
108
3.2.5. QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT
109
3.2.6. QUY TRÌNH CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT
111
3.2.7. QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT
112 3.2.7.1. Loại ADN tồn dư
112
3.2.7.2. Siêu ly tâm
114
3.2.8. QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG
117
3.2.9. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM
118
3.3. SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN EV71 Ở QUY MÔ
PHÒNG THÍ NGHIỆM
118
3.3.1. Kết quả nuôi cấy và chuẩn bị tế bào Vero
119
3.3.2. Kết quả gây nhiễm EV71 vào tế bào Vero
119
3.3.3. Kết quả nuôi cấy, thu hoạch và tinh sạch virút
120
3.3.4. Kết quả bất hoạt virút
120
TÀI LIỆU THAM KHẢO
131
PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATTC
Ngân hàng tế bào của Mỹ (American type culture
collection)
ADN
Axít desoxyribonucleic (Desoxyribonucleic acid)
ARN
Axít ribonucleic (Ribonucleic acid)
CPE
Hủy hoại tế bào (Cytopathetic Effect)
CT Scan
Chụp cắt lớp vi tính (Computed Tomography scan)
ELISA
Thử nghiệm miễn dịch gắn enzym (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay)
EV71
Virút đường ruột typ 71(Enterovirus 71)
FBS
Huyết thanh bê bào thai (Fetal Bovin serum)
IgA
Imuno globulin A
PCR
Phản ứng khuyếch đại gen (Polymerase chain reaction)
RK
Tế bào thận thỏ (Rabbit Kidney)
RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction
SDS-PAGE
Điện di trên gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis)
TBE
Tris-Borate-EDTA
TCID
50
Liều gây nhiễm 50% tế bào (Tissue Culture Infectious Dose
50)
TCYTTG
Tổ chức y tế thế giới (WHO)
VABIOTECH
Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1
VVSDT
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương
Vero
Tế bào thận khỉ xanh châu Phi
VLP
Virus like particle
WCB
Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank)
WSV
Chủng virút giống sản xuất ( Working seed virus)
Công thức cho một phản ứng PCR giải trình tự
49
2.3.
Công thức cho một phản ứng PCR/Lao
53
2.4.
Công thức cho một phản ứng PCR/HAV (Vòng 2)
54
2.5.
Công thức cho một phản ứng PCR/HBV (Vòng 1)
55
2.6.
Công thức cho một phản ứng PCR/HBV (Vòng 2)
55
2.7.
Công thức cho một phản ứng PCR/HCV (Vòng 2)
56
2.8.
Tiêu chuẩn đánh giá chất gây sốt
70
3.1.
Đặc điểm chủng 0822 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam
sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắcxin phòng bệnh
tay chân miệng EV71
83 3.2.
Tế bào Vero sản xuất chủng EV71 giống gốc và giống
Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột nhắt trắng
thí nghiệm
93
3.11.
Kiểm tra an toàn trên chuột ổ thí nghiệm
94
3.12.
Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/C4
95
3.13.
Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/C5
95
3.14.
Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/B5
96
3.15.
Kết quả nuôi cấy tế bào Vero trong môi trường MEM
với các nồng độ huyết thanh bào thai bê (FBS)
100 3.16.
Kết quả gây nhiễm EV71 ở nồng độ virút 1; 0.1; 0.01;
0.001 MOI tại các thời điểm gặt 24; 36; 48; 60h
104
3.17.
Kết quả nuôi cấy EV7 theo thời điểm thay môi trường
và không thay môi trường nuôi cấy
106
không có chất hấp phụ nhôm
118
3.26.
Kết quả nuôi cấy tế bào Vero của các loạt sản xuất thử
nghiệm
119
3.27.
Kết quả gây nhiễm EV71 của các loạt sản xuất thử
nghiệm
120 3.28.
Kết quả thu hoạch và tinh sạch hỗn dịch virút của các
loạt sản xuất thử nghiệm
120
3.29.
Kết quả bất hoạt virút của các loạt sản xuất thử nghiệm
121
3.30.
Kết quả cô đặc hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử
nghiệm
121
3.31.
Kết quả tinh chế virút của các loạt sản xuất thử nghiệm
122
3.32.
Kết quả pha bán thành phẩm và sản xuất vắcxin thành
phẩm của các loạt sản xuất thử nghiệm
122
tử
3
1.2.
Cấu trúc virút đường ruột
5
1.3.
Cấu trúc di truyền virút đường ruột và các sản phẩm
6
1.4.
Phân bố số mắc, tử vong do bệnh tay chân miệng năm
2011-2012 theo tháng
18
2.1.
Sơ đồ phiển phản ứng trung hòa vi lượng
72
3.1.
Quy trình sản xuất chủng EV71 giống gốc
86
3.2.
Quy trình sản xuất chủng EV71 giống sản xuất
87
3.3.
Hình ảnh virút đường ruột typ 71. Hỗn hợp miễn dịch
kháng thể đơn dòng kháng VP1-EV71 gắn các hạt vàng
bao quanh hạt EV71
89
3.4.
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR sau tinh sạch được
tổng hợp từ cặp mồi đặc hiệu vùng VP1 - EV71
89
116
1 MỞ ĐẦU
Vi rút đường ruột typ 71 (EV71) là một trong những căn nguyên gây ra
các vụ dịch tay chân miệng trên toàn thế giới. Khác với Coxsakie A16 thường
chỉ gây các bệnh cảnh lâm sàng nhẹ của bệnh tay chân miệng như sốt, ban
ngoài da, nổi mụn phỏng loét trợt ở miệng, tay, chân, EV71 thường gây thêm
các bệnh cảnh về thần kinh cấp tính bao gồm liệt mềm giống với bại liệt, viêm
não, viêm màng não vô khuẩn, phù phổi. Các bệnh do EV71 gây ra thường để
lại các di chứng về thần kinh nghiêm trọng và có tỷ lệ tử vong cao.
Những năm gần đây các vụ dịch tay chân miệng nghiêm trọng bùng
phát trên quy mô lớn với nhiều trường hợp biến chứng thần kinh và tử vong
thường xảy ra tại Việt Nam và các nước trong khu vực châu Á - Thái Bình
Dương. Số ca mắc và tử vong do EV71 tăng nhanh và diễn biến bệnh ngày
càng phức tạp tại Việt Nam đang là vấn đề y tế nổi trội gây ảnh hưởng đến
sức khỏe và tổn thất về kinh tế. Bệnh xẩy ra quanh năm và lưu hành ở hầu
khắp các địa phương trên cả nước. Đến nay chưa có thuốc kháng virút hay
vắcxin hiệu quả nào được sử dụng để điều trị và phòng bệnh tay chân miệng
EV71. Một số các vắcxin EV71 dự tuyển trên thế giới đang trong giai đoạn
thử nghiệm lâm sàng tuy nhiên hiện vẫn chưa vắcxin nào được cấp phép lưu
hành, do đó việc phát triển vắcxin EV71 tại Việt Nam được ưu tiên hàng đầu
để có thể giảm giá thành, chủ động trong công tác phòng chống dịch bệnh và
bảo vệ sức khỏe cộng đồng
1.1.1. Phân loại
Virút đường ruột typ 71 thuộc nhóm vi rút đường ruột typ huyết thanh
A, là thành viên thuộc chi các virút đường ruột, họ Picornaviridae.
Họ Picornaviridae được chia thành 12 chi: Enterovirus, Cardiovirus,
Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Koburirus, Teschovirus,
Sapelovirus, Senecavirus, Tremovirus, Avihepatovirus.
Chi Enterovirus bao gồm 10 loài [25].
4
Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Enterovirus [25].
TT
Loài (Tên cũ)
Loài (Tên mới)
1
Human enterovirus A
Enterovirus A
2
Human enterovirus B
Enterovirus B
3
Human enterovirus C
Enterovirus C
4
Human enterovirus D
Enterovirus D
5
Bovine enterovirus
Enterovirus E
6
Porcine enterovirus B
5
song với liên kết jelly-roll tạo thành protein bề mặt của virút [18]. VP4 chỉ
gồm khoảng 70 axit amin và nằm sâu phía trong vỏ capsit [5].
Protein bề mặt VP1, VP2, VP3 quyết định khả năng hấp phụ của virút
lên bề mặt tế bào thông qua các thụ thể đặc hiệu [19]. Sự liên kết của các
protein trên capsit tạo ra hình dạng không gian 3 chiều đặc trưng rất quan
trọng cho khả năng sinh miễn dịch.
Một protomer gồm có 3 protein VP0, VP1, VP3 được sắp xếp cùng
nhau và năm protomer tạo thành một pentamer. Mười hai pentamer tạo thành
một procapsit. Hạt virút lây nhiễm VP0 tách thành VP4 và VP2. Hình 1.2: Cấu trúc virút đường ruột [40]. 6
1.1.3. Axít nucleic và protein của virút
Giống như các virút đường ruột, vật liệu di truyền của EV71 là ARN
đơn, dương, bao gồm khoảng 7500 nucleotit không kể đuôi poly A.
Hình 1.3: Cấu trúc di truyền virút đường ruột và các sản phẩm.
Vùng không mã hóa nằm ở đầu 5’, protein VPg gắn với đầu 5’ bằng
liên kết đồng hóa trị. Cấu trúc bậc hai của vùng không mã hóa đầu 5’ rất quan
trọng tạo thành điểm vào bên trong ribosom (IRES) điều khiển dịch mã
polyprotein virút. Vùng không mã hóa nằm ở đầu 3’ gắn với chuỗi poly A.
Vùng mã hóa là khung đọc mở lớn duy nhất chịu trách nhiệm mã hóa
7
1.1.5. Kháng nguyên
Tính kháng nguyên của EV71 cũng như của virút Polio phụ thuộc vào
cấu hình của nó. Hạt virút có tính kháng nguyên cao, nhưng nếu hạt virút bị
phân tách thì tính kháng nguyên của nó trở nên thấp. Tính kháng nguyên
trung hòa của polypeptit tạo thành hạt virút cũng thấp. Tính kháng nguyên của
hạt virút toàn vẹn bằng tính kháng nguyên của một hạt rỗng.
Việc cấy truyền liên tục virút qua các môi trường nuôi cấy tế bào có
kháng thể đơn dòng trung hòa sẽ tạo ra một virút đột biến kháng lại sự trung
hòa này. Sự thay thế không đồng nhất trong chuỗi bazơ của gen P1 trong biến
dị kháng trung hòa được gọi là vị trí kháng nguyên trung hòa. Các vị trí như
vậy đã được tìm thấy ở VP1và VP2. Hai péptit tổng hợp SP55 và SP70 có chứa
các axit amin 163-177 và 208-222 nằm trong vùng VP1 được gây miễn dịch trên chuột
đã tạo được kháng thể đơn dòng 22A12 có hoạt tính trung hòa EV71 [19],
[26].
1.1.6. Sự nhân lên của EV71
Giống như các virút đường ruột khác, chu trình nhân lên của EV71
cũng tương tự như chu trình nhân lên của virút Polio [15]. Sự xâm nhập của
virút vào tế bào cảm thụ phụ thuộc vào các thụ thể đặc hiệu. Một số thụ thể
đặc hiệu của EV71 đã được phát hiện trên tế bào bạch cầu, tế bào hệ tiêu hóa,
hệ hô hấp và tế bào đuôi gai [33], [53], [54], [57].
Khi virút đường ruột gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, một
loạt các thay đổi cấu trúc xảy ra trên vỏ capsit của virút và tạo thành một lỗ
trên màng tế bào. ARN của virút thoát khỏi vỏ capsit xâm nhập vào tế bào
chất của tế bào vật chủ. Do vật liệu di truyền là ARN đơn dương nên ARN
của virút mẹ được dùng trực tiếp làm ARN thông tin để dịch mã thành một
tiền polypeptit lớn. Sau đó, proteaza 2A và 3C phân cắt tiền polypeptit thành
11 protein cấu trúc và không cấu trúc. Các protein này sẽ tham gia vào quá
trình sao chép ARN của virút. Virút sao chép nhờ emzym ARN- polymeraza
9
Copyright: Tài liệu đại học ©