Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng đại học y h nội Lê văn hng Chuyên đề 3
ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử
trong chẩn đoán v nghiên cứu vi khuẩn lậu
Chuyên đề sâu có liên quan đến nội dung luận án tiến sỹ chuyên ngành y
học: "Xác định vi khuẩn lậu v phát hiện đột biến gen
kháng Ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử
tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007" Chuyên ngành Vi sinh vật
Mã số: 62.72.68.01
Hà Nội - 2008
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng đại học y h nội
1. Tầm quan trọng của Y sinh học phân tử
hiện nay
1
2. Tình hình ứng dụng sinh học phân tử
trong lĩnh vực y họ
5
2.1. Trên thế giới
5
2.2. Trong nớc
8
3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thờng
dùng
8
3.1. PCR
8
3.2. Tách, tạo dòng gen
20
3.2.1. Chọn và xử lý vector
20
3.2.2. Xử lý ADN cần tạo dòng
20
3.2.3. Tạo vector tái tổ hợp
20
3.2.4. Chuyển vetor tái tổ hợp vào tế bào chủ
21
3.3. Thao tác gen
21
3.3.1. Cắt
21
3.3.2. Gắn
4.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử khác đ 42
và đang đợc sử dụng rộng ri trong xác
định và nghiên cứu N.gonorrhoeae
5. Kết luận 43
Chữ viết tắt
AAGAP Ala-Ala-Glu-Ala-Pro
ADN
Acid deoxyribonucleic
ARN
Acid ribonucleic
BAC Bacterium artificial chromosomes
BSA
Bovine Serum Abumin
cat chloramphenicol acetyltransferase
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CMRNG
Chromosomally mediated resistant N. gonorrhoeae: N.
gonorhoeae kháng thuốc qua trung gian nhiễm sắc thể
CSWs Commercial sex workers: gái mại dâm
DGI Disseminated gonococcal infection: nhiễm vi khuẩn lậu lan tỏa
DMSO
Dimethyl sulfoxide
Fbp Ferric binding protein: protein gắn sắt
FDA Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thực phẩm và
dợc phẩm
FrpB Fe-regulated protein B: protein điều hòa sắt
Frps Ferric-repressible proteins: Các protein ức chế sắt
GASP Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme: chơng
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: điện
di trên gel polyacrylamid
STD
Sexually Transmitted Disease: bệnh lây truyền qua đờng tình
dục
TEM Transfer Electronic Microscopy: Kính hiển vi điện tử dẫn truyền
TF Transferin
Tm
Melting temperature: nhiệt độ biến tính
TMA Transcription-mediated amplification: khuếch đại qua trung gian
bản sao
TRNG
Tetracycline-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu
kháng tetracycline
WHO World Health Organization: tổ chức Y tế thế giới
ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn
đoán v nghiên cứu vi khuẩn lậu
1. Tầm quan trọng của Y sinh học phân tử hiện nay
Sinh học phân tử là một ngành của sinh học. Nó nghiên cứu các vấn đề về
hình dạng, cấu trúc và chức năng của các đại phân tử có vai trò quan trọng
với sự sống nh các acid nucleic, protein đặc biệt là vai trò của chúng trong
sự nhân lên của tế bào cũng nh sự truyền lại các thông tin di truyền.
Cơ sở của sinh học phân tử là sinh lý y học, di truyền và hóa sinh.
- Đối với các bệnh nhiễm trùng: Chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, cơ chế gây
bệnh, đột biến, kháng thuốc, các bệnh mới xuất hiện.
Sinh học phân tử ngày càng đóng vai trò quan trọng và là một phơng tiện
hữu dụng trong chẩn đoán các vi sinh vật gây nhiễm trùng. Cho tới nay, việc
xác định các căn nguyên gây nhiễm trùng thờng dựa vào các phơng pháp
hợp, bằng việc giải trình tự một đoạn nucleotide, sau đó so sánh trình tự này
với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gien, ngời ta có thể biết rằng đoàn
nucleotide đó là của một vi sinh vật đã đợc nghiên cứu hoặc là một vi sinh
vật mà cha đợc biết.
- Đối với bệnh ung thu: Chẩn đoán, cơ chế, can thiệp
Hiện nay, ung th là một trong những bệnh có tỷ lệ mắc khá cao. Vì sao ung
th khó chẩn đoán và điều trị? Nó là bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở các
nớc đang phát triển. Vấn đề là ở chỗ, ung th là một bệnh có cơ chế,
nguyên nhân tiến triển rất phức tạp. Dới sự phát triển của khoa học công
nghệ, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử, ngời ta đã tìm thấy nhiều
yếu tố về mặt di truyền liên quan đến cơ chế phát sinh và tiến triển của ung
th. Cho tới nay, ứng dụng của sinh học phân tử trong lĩnh vực ung th tập
trung ở ba khía cạnh chính:
2
+ Xác định các bệnh nhân có những yếu tố thuận lợi về mặt di truyền
để phát sinh ung th (ví dụ nh phát hiện các đột biến của các tế bào sinh
dục ở bệnh nhân trong gia đình có tần xuất ung th cao) và phát hiện các
thay đổi về mặt di truyền ở các tế bào sinh dỡng có nguy cơ bị tổn thơng
và dẫn đến ung th.
+ Phát hiện sớm: Biện pháp tốt nhất để chống lại ung th là phát hiện
sớm. Việc xác định sớm ung th sẽ mang lại hiệu quả điều trị cao. Nếu phát
hiện muộn, việc điều trị thờng khó khăn và tiên lợng xấu.
+ Các kỹ thuật sinh học phân tử mới cũng đang đợc phát triển nhằm
vào các tế bào ung th hoặc môi trờng của khối u. Ngời ta đã áp dụng
nhiều kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán, điều trị cũng nh nghiên cứu
nhiều dạng ung th nh ung th tuyến giáp, ung th tiền liệt tuyến, ung th
dạ dày ruột, ung th phổi, ung th vú.Ví dụ, sự có mặt của một số yếu tố
di truyền nh sự thiếu hụt gien gây bệnh thiếu máu Fanconi BRCA2 và sự
nhạy cảm với mitomycin C liên quan đến ung th [5, 27, 32]. Những gien có
đời. Do vậy, nếu có thể phát hiện sớm các rối loạn di truyền này, ngời ta có
thể có hớng xử lý thích hợp tuỳ từng trờng hợp. Ngoài ra, nếu những rối
loạn di truyền có liên quan đến cả ngời bố và mẹ, bằng các kỹ thuật sinh
học phân tử, ngời ta có thể xác định các thay đổi di truyền này và các thông
tin nh vậy có thể dùng để t vấn trớc sinh.
- Đối với sản xuất thuốc và các chế phẩm sinh học, protein tái tổ hợp
(insulin, yếu tố VIII), vacxin (viêm gan B, HPV, các vacxin ADN), chế
phẩm điều trị
Trong giai đoạn hiện nay, do sự bùng nổ của khoa học công nghệ, các kỹ
thuật sinh học phân tử không chỉ đợc áp dụng trong lĩnhvực chẩn đoán, điều
trị, mà nó còn đợc áp dụng rộng rãi trong công nghệ dợc nhằm sản xuất ra
các loại dợc phẩm mới, hay trong việc sản xQất `a cc ciế phẩm 3inh học.
4
Mộp tr.ng .hữne ch ph@m s)nh học đang đợc sử dụng rộng rãi hiện nay là
insulin. Ban đầu, insulin đợc sản xuất từ tuỵ của bò, lợn, ngựa, cả cá. Nhng
sau này nhờ công nghệ tái tổ hợp, ngời ta có thể tạo ra insulin nhân tạo
hoàn toàn trong phòng thí nghiệm. Insulin đợc sản xuất bằng công nghệ di
truyền đã đợc sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Để làm đợc việc này, ngời
ta đã đa đoạn gien chịu trách nhiệm sản xuất insulin của ngời vào bộ gien
của một loài vi khuẩn, virut nào đó, E. coli chẳng hạn. Khi vi khuẩn nhân
lên, đoạn gien chèn vào cũng đợc nhân lên, sao mã, dịch mã và tổng hợp ra
protein tơng ứng [1, 7, 48]. Ngoài insulin, nhiều chế phẩm khác nh
vaccine cũng đợc sản xuất bằng công nghệ di truyền. Một số vaccine đã và
đang đợc nghiên cứu bằng công nghệ tái tổ hợp nh vaxcin phòng virus
viêm gan B, vaxcin phòng viêm não Nhật Bản, vaxcin phòng Tả[21, 22,
42, 49]. Việc áp dụng các kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử đã và đang tạo
ra một xu hớng mới trong y sinh học.
2. Tình hình ứng dụng sinh học phân tử trong lĩnh vực y học
Nguyên lý chung
Năm 1985, nhà khoa học ngời Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển phản ứng
chuỗi trùng hợp gọi là Polymerase Chain Reaction. Kỹ thuật này cho phép
nhân bất kỳ một đoạn vật liệu di truyền nào (ADN hoặc ARN) lên hàng tỉ
lần trong một thời gian ngắn [12, 13, 16, 20, 23, 34, 37].
Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo sự sao chép của ADN
trong tế bào, trong đó, ADN đợc nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Từ một
phân tử ADN chuỗi kép ban đầu, chúng đợc tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi
chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi ADN mới. Kỹ thuật
PCR đợc thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu (mồi này có khả năng bắt cặp,
bổ sung vào hai đầu của hai sợi ADN khuôn theo chiều 5 đến 3 dới tác
6
dụng của enzym Taq ADN polymerase. Đoạn mồi sẽ đợc kéo dài về phía
đầu 3 của mồi để hình thành mạch ADN mới với các nucleotide bổ sung với
các nuclotide trên sợi ADN khuôn. Qua các chu kỳ nhiệt, số lợng đoạn
ADN cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính
ở nhiệt độ 94
0
-95
0
C, đoạn ADN duỗi xoắn và tách hoàn toàn thành hai sợi
đơn.
- Giai đoạn gắn mồi
Nhiệt độ đợc hạ xuống 54
0
-55
0
C các nucleotide trên mỗi đoạn mồi xuôi
Tránh đầu 3 bắt đầu với A hoặc T
Nhiệt độ dùng để gắn mồi khác nhau ở mỗi loại mồi và đợc tính theo
công thức:
Tm = (G+C) x4
0
C + (A+T) x 2
0
C
Hai mồi của một khuôn phải có Tm xấp xỉ bằng nhau.
- ADN polymerase
Có hai loại: ADN polymerase phụ thuộc ADN và ADN polymerase phụ
thuộc RNA.
ADN polymerase lúc đầu sử dụng cho PCR đợc chiết xuất từ các tế bào
bình thờng do đó không có khả năng chịu nhiệt và bị phá huỷ ở giai đoạn
biến tính. Ngời ta phải cho thêm ADN polymerase sau giai đoạn biến tính
của mỗi chu kỳ. Ngày nay, enzym này đợc chiết xuất từ các vi khuẩn sống
ở suối nớc nóng có khả năng chịu nhiệt cao làm cho phản ứng PCR đơn
giản hơn rất nhiều.
- Vật liệu di truyền làm khuôn cho PCR
Có rất nhiều loại khuôn nh ADN hoặc ARN bao gồm: genomic ADN,
mRNA, cADN, plasmid, phage, cosmid
Lợng khuôn cho mỗi phản ứng PCR cũng khác nhau:
1 g genomic ADN ngời
8
10 ng genomic ADN nấm
1 ng genomic ADN E. coli hoặc vi khuẩn nói chung
1-2 pg plasmid
20 pg Bacteriophage ADN
- 4 loại dNTP
vậy, đã được xác định (cả về độ dài và trình tự các nucleotide) ngay từ giai
đoạn này.
Khi đưa bộ gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được tách chiết từ vi
sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn gen có trình tự các nucleotide bổ
sung với trình tự của gen mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau và, sau đó, gen
mồi được kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ ADN polymerase. Đoạn ADN
đó, nhờ vậy, sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất nhiều lần; sau quá trình
nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn ADN này, thông thường nhất, bằng điện di
trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide. Như vậy, sau khi điện di,
nếu có bǎng ADN chạy giống như bǎng chuẩn thì điều đó có nghĩa là có vi
sinh vật cần tìm trong bệnh phẩm; ngược lại, nếu không thấy bǎng nào xuất
hiện hoặc có những bǎng không giống với bǎng chuẩn thì có nghĩa là không
có tác nhân gây bệnh cần tìm trong bệnh phẩm.
Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả các vi sinh vật gây bệnh
đều có thể tìm được nhờ PCR. Sau đây là một số ứng dụng điển hình:
• Dùng PCR cho những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi
cấy rất khó khǎn:
. Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy.
Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa
nuôi cấy nhân tạo được. Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm
cho PCR (1). Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm.
10
Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng ngoài (2)
hoặc một đoạn 419-bp (3) của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây
bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi). Bằng cách đó, bệnh Lyme có thể được
chẩn đoán sớm và chính xác.
. Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm
niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy.
Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu
mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (VacA, CagA) liên quan tới độc
tính của nó. Nhờ PCR, người ta còn biết được sự phân bố của các chủng HP
khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên
quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định.
. Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá
cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp
mã hoá cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi;
Pseudomonas pseudomallei (nay là Burkholderia pseudomallei) với mảnh
517-bp của 16S ARNr cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR.
Amíp:
Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan
tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp
gây bệnh và amíp không gây bệnh (6).
12
Vi rút: Vi rút viêm gan B (7,8), HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex,
Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã được chẩn đoán thành
công bằng PCR.
Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy, PCR cho kết quả dương tính
sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng; đặc biệt là nó cho
phép chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc
này, có thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang.
• Xác định độc tố của vi sinh vật:
Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần
đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic
Escherichia coli, ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy máu đường ruột
(enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E. côli gây
bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E. coli
xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã
được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại
độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không
thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác.
b. Định loại vi khuẩn
Sau khi phân lập được vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng trong định loại
chúng.
Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng
thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần. Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN
14
mu (template) t vi khun thun cho PCR rt n gin: ch cn un sụi
cỏch thu huyn dch vi khun trong 10 phỳt ri thu ly dch ni sau ly tõm
loi b t bo l .
c. Phõn loi vi khun
Nh khuych i nhng on gen ph trỏch ARNr 16S, ngi ta cú th so
sỏnh mi quan h gn gi hay xa nhau gia cỏc vi khun, gúp phn phõn loi
vi khun chi tit hn v chớnh xỏc hn.
3.2. Tách, tạo dòng gien
Mục đích của việc tạo dòng là là nhằm thu đợc một lợng lớn bản sao của
một trình tự ADN xác định. Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong
một th việnk gien dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm-tức tập hợp vi khuẩn
cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần
tìm.
Các bớc cơ bản của phơng pháp tạo dòng :
Tùy thuộc vào loại th viện gien cần thiết lập, các nhân tố tham gia vào quá
trình tạo dòng (nh vector, té bào chủ, kỹ thuật chuyển vector tái tổ hợp vào
tế bào chủ) có thể thay đổi, nhng tiến trình thực hiện đều bao gồm các
bớc sau :
a. Chọn và xử lý vector
Việc chọn vector phụ thuộc nhiều yếu tố : Kích thớc các đoạn ADN muốn
tạo dòn, mục đích tạo dòng Trớc hết, vector đợc cắt ở một vị trí xác định
Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép
vector tái tổ hợp thành một số lợng lớn bản sao. Tùy thuộc loại tế bào chủ
16
thông dụng một kỹ thuật chuyển thích hợp. Hai loại tế bào chủ thông dụng
nhất là (i) tế bào vi khuẩn, thờng là E. coli, rất thông dụng vì thao tác dễ
dàng và không tốn kém lại sinh sản nhanh; (ii) tế bào eucaryote (tế bào động
thực vật nuôi cấy hay tế bào nấm men), loại tế bào chủ này chỉ đợc sử dụng
vào những mục đích cụ thể, ví dụ nh khi ngời ta cần nghiên cứu in vivo sự
điều hòa biểu hiện các gien eucaryote hay khi protein cần sản xuất phải đợc
tổng hợp và biến đổi nhờ các phản ứng đặc trng cho tế bào eucaryote
e. Phát hiện dòng cần tìm trong th viện gien
Để phát hiện dòng cần tìm, ngời ta sử dụng một mẫu dò, mẫu dò có thể là
một kháng thể đặc trng cho protein mã hóa bởi gien cần tìm hoặc một trình
tự ADN bổ xung cho gien cần tìm
Do bản chất của ADN cần tạo dòn, ngời ta phân biệt hai loại th viện gien:
th viện bộ gien và th viện cDNA.
3.3. Thao tác gien
Cắt, gắn, biến nạp, tiếp hợp
Các thao tác gien đợc sử dụng rất phổ biến trong công nghiệ sinh học nói
chung và y sinh học phân tử nói riêng là cắt, gắn, biến nạp, tiếp hợp
a. Cắt
Nhờ có các enzyme đặc biệt gọi là Enzyme giới hạn, ngời ta có thể cắt các
gien thành các đoạn dài, ngắn khác nhau. Việc sử dụng các enzyme giới hạn
có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử. Chúng cho
phép cắt nhỏ bộ gien khổng lồ của các vi sinh vật. Các enzyme hạn chế chủ
yếu đợc sử dụng trong phơng pháp tạo dòng với mục đích thu nhận một
trình tự xác định với số lợng lớn. Ngoài ra, chúng còn đợc dùng vào việc
lập bản đồ giới hạn, vào việc phân tích so sánh bộ gien ở các loài khác nhau
thông qua kỹ thuật RFLP-tính đa hình kích thớc của các trình tự giới hạn.
Escherichia coli Ry13
18
Giống loài Chủng
EcoRI: enzyme đầu tiên đợc tìm thấy ở E. coli
EcoRV: enzyme thứ năm đợc tìm thấy ở E. coli
Các loại enzyme giới hạn:
Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng phân giải ADN mạch đôi
một cách lặp lại ở những vị trí có trình tự nhất định.
Do đặc tính cơ bản của các enzyme hạn chế là khả năng nhận biết và cắt một
trình tự xác định trên phân tử ADN nên dựa vào khả năng này, ngời ta chia
làm ba loại:
- Loại 1: Khi enzyme nhận biết đợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử
ADN đến cách đó khoảng 1000-5000 nuleotide và giải phóng độ vài chục
nucleotide.
- Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.
- Loại 3: Enzyme nhận biết một trình tự và cắt ADN ở vị trí cách đó khoảng
20 nucleotide.
b. Gắn
Gắn có nghĩa là nối hai đoạn với nhau. Trong sinh học phân tử, khái niệm
gắn đoạn ADN có nghĩa nối hai đoạn ADN sợi kép với nhau. Gắn là một
quá trình tự nhiên xảy ra trong cơ chế sửa chữa và nhân lên của ADN trong
tế bào. Tuy nhiên, trong phòng thí nghiệm, nhờ công nghệ sinh học, ngời ta
có thể tạo ra các điều kiện để gắn hai đoạn ADN với nhau trong ống nghiệm.
Kỹ thụât này có ứng dụng rất to lớn trong các thực nghiệm tái tổ hợp ADN
và các ứng dụng khác. Ví dụ, bằng cách sử dụng kỹ thuật gắn các đoạn ADN
với nhau, ngời ta có thể sử dụng một hỗn hợp các plasmids bị cắt và các
đoạn gien ADN tự do có các đầu có khả năng gắn bổ xung vào các đầu của
các đoạn plasmid. Ngời ta cho thêm vào hỗn hợp một enzyme gắn. Nhờ
hoạt tính của enzyme này, các đầu bổ xung của plasmid và các đoạn ADN tự
Copyright: Tài liệu đại học ©