B GIÁO DO
TRI HC NHA TRANG
VIN CƠNG NGH SINH HNG
  THANH BÌNH

ẢNH HƯỞNG CỦA pH, NHIỆT ĐỘ VÀ ENZYME ĐẾN
HOẠT TÍNH CỦA BACTERIOCIN Ở MỘT SỐ CHỦNG VI
KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐỘNG VẬT BIỂN VIỆT NAM

 ÁN TT NGHII HC
Chun Ngành: CƠNG NGH SINH HC GVHD: TS. NGUY
ThS. NGUYN TH HI THANH Nha Trang, năm 2013
i

Lời cảm ơn
c tiên, tôi xin chân thành ccác thy cô giáo Vin Công ngh sinh
hi h luôn quan tâm, dy d, ging dy
nhit tình, giúp tôi tip cc nhng kin thc quý báu.
c bày t lòng bit n TS. Nguy Th.S.
Nguyn Th Hi Thanh, B môn Công ngh sinh hc, Vin Công ngh sinh hc và
ng ng dng, dy bo và to mu kin cho tôi
 án tt nghip này.

 12
1.4. ng dng ca bacteriocin 13
 13
 13

trong NTTS 14
1.5. Tình hình nghiên cu vi khun bin sinh bacteriocin 15
1.5.1.  15
 21
 VT LIU 23
2.1. Vt liu 23
2.1.1.  23
2.1.2.  23
iii

2.1.3.   23
2.2. u 24
 24
 24
 25

 26
III. KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 28
3.1. Tuyn chn các chng vi khun sinh bacteriocin có hot tính kháng khun mnh 28
3.2. Mi quan h ging và sinh bacteriocin ca mt s vi khun bin
sinh bacteriocin. 30
3.3. ng ca enzyme, nhi    n tính kháng khun ca mt s
chng vi khun bin 35
3.3.1.  35
3.3.2.  38

TSA
Tryptone Soya Agar
8
TSB
Tryptone Soya Broth
9
VSV
Vi sinh vt

v



Bng 1.1. So sánh bacteriocin và kháng sinh 3
Bng 1.2. Phân loi bacteriocin 7
Bng 1.3. Tính cht hóa lý ca mt s bacteriocin ca vi khu 11
Bng 1.4. Các chng vi khun bin sinh bacteriocin 18
Bng 1.5. Bacteriocin t vi khuc phân lp t ng vt bin 20
Bng 3.1. Vòng kháng khun ca các chng nghiên ci vi 3 chng ch th 28
Bng 3.2. Kh ng (OD
600
) và sn sinh bacteriocin ca chng CR9.1 30
Bng 3.3. Kh ng (OD
600
) và sn sinh bacteriocin ca chng CR10 31
Bng 3.4. Kh ng (OD
600
) và sn sinh bacteriocin ca chng CR15 32
Bng 3.5. Kh ng (OD
600

R2(D), chng ch th P. mirabilis T14 38
Hình 3.8. ng ca nhi n hot tính kháng khun ca dch bacteriocin
thô t các chng CR9.1, CR10, CR15, R2, chng ch th P. mirabilis T14 40
Hình 3.9. ng cn hot tính kháng khun ca dch bacteriocin thô t
các chng CR9.1 (A) và CR10 (B), chng ch th P. mirabilis T14 42
Hình 3.10. ng cn hot tính kháng khun ca dch bacteriocin thô
t các chng CR15 (A) và R2 (B), chng ch th P. mirabilis T14KT LUN VÀ
KIN NGH 43
1


Vit Nam là mt quc gia rt giàu có v tài nguyên bin, vng b bin
. S ng v sinh hc bi 
c nghiên c, nht là nhng nghiên cn v vi khun
bing vt ch ng d
vrt hn ch.
NTTS hin là mt trong nhc sn xut thc phm phát trin mnh
nhc ta. Tuy nhiên, dch bnh lng xuyên xy ra gây thit hi kinh t
hàng triô la M mn na, cùng vi hing bii khí hu toàn
cu, nhi t  nh và truyn nhi
 Vic lm dng cht kháng sinh trong phòng u tr bnh cho thy sn
gây nên hing nhn thung xu ng nuôi. Bên c
 ng kháng sinh trong sn phm thy sn gây  ng ln n sc khe
i tiêu dùng vic xut khu sn phc khác. Vì vy, các
 thân thin vng  dng vaccine, cht kháng
sinh th h mi hay probiotic ngày càng c quan tâm. S dng vaccin ng
vt thy sn ng  v u qu  vt ch,
tn kém v chi phí sn xut, chi phí nhân công và ng vt nuôi. Do
, các ch phm vi sinh có th là mt gii pháp hiu qu. Chúng kìm hãm s phát
trin ca các vi khun có hi nh tính cnh tranh ca các chng có li, nâng cao kh

3

C I. 


Bacteriocin là các peptide 
bào vi kh Bacteriocin           
 
 bacteriocin ó [5, 19, 26].
Các kháng           con
  tiêu  nhau, còn
bacteriocin 
 [19, 26].
. So sánh bacteriocin và kháng sinh

Bacteriocin


    n
vng trong NTTS


Trên ribosom




    
    


Colicin [22, 36].
Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương



[22, 36].
bacteriocin
n nay có khong 200 lonh, tuy nhiên vic
phân loi bacteriocin vn  tranh cãi.
c phân loi kt hp theo các tiêu chí khác nhau.
Nhng tiêu chí chính là vi khun sn xut, trng phân t ca chúng và trình
t acid amin [17]. Da trên h thng phân loi bacteriocin ca Klaenhammer và
 c chia làm 4 lp (nhóm)   p III và l
c nghiên cu nhiu, ch yu là lp I và lp II.
Lớp I
Bacteriocin lp c gi là Lanbiotic là nhng peptide nh (<5
kDa), bn nhit và hong bng cách ng lên cu trúc màng. Mi din
5

tiêu biu ca nhóm này là Nisin [30]. c chia thành 2 phân lp là
Ia và Ib da trên s ng cu trúc.
a) Phân lớp Ia
Gm các peptide dng thuôn dài, linh hot và t
ng bng cách hình thành các l trong màng t bào cht ca các loài vi khu
[29].
Nisin (thuc nhóm này) là mc hình thành bi 34 amino acid. Có 2
bin th ca Nc ghi nhn là Nisin A và Nisin Z, chúng ch khác nhau  amino
acid th 27: Histidine trong Nc thay th bi Asparagin trong Nisin Z.
Loi bacteriocin này c sn xut bi mt vài chng Lactococcus lactic,
c s dt cht ph gia trong thc phm. Nó có ph kháng khun Gram

c hong cp này ch tìm
thDivergicin A và Acidocin B [32].
Lớp III
B
 
 
Lactobacillus [30].
Lớp IV
lipid 
[20]               
actocin 27 [11, 44].
Các   lactic (LAB) 
           Ngoài ra, b 
b.
7


Loi
Lp
Vi khun
Trng
ng phân
t (kDa)
Hong
Protein-
Bacteriocins

Gracilicutes
Xanthomonas
campestris
50
Phân gii kiu

Enterocoliticin
Yersinia
enterocolitica
669
Phân gii kiu

Carotovoricin
Erwinia
carotovora
68/76
Phân gii kiu


Firmicutes Helveticin J
Lactobacillus
helveticus

t
Millericin
Streptococcus
milleri


Escherichia coli

Hot tính enzyme
ni bào/ To l
màng

Firmicutes Class I
Lactic acid
bacteria
2-4
To l màng
Class II

4-6
To l màng

Cyanobacteria Microcin-like
Prochloron
didemni
0,7
t
Nguồn: [29]

 hong cc công nhn rng

quá trình vn chuy tng hp nên thành peptidoglycan t trong t bào
cht. Bacteriocin thuc nhóm này có kh   t vi lipid nm trên màng
nguyên sinh, s liên kc gii thích rng do phn ln
n tích âm vì th s liên kc d dàng to ra
trên màng. Sau khi to liên kt, bacteriocin s khóa lipid làm chúng mt kh 
vn chuyn các ti cu to nên thành peptidoglycan.
i vi màng sinh cht, bacteriocin liên kt và s dng lipid trên màng
   thc hin quá trình oxi hóa kh, lúc này lipid có tác d 
nhng con dao ct to nên nhng l hng trên màng nguyên sinh. Nhng l hng
này làm tht thoát nhiu các ion, các cht hòa tan trong nguyên sinh cht (mui
10

y phân và tht thoát nhiu ATP dn
t bào ch[24].
Lp II - n hình là Sakacin: do thuc nhóm k c sau khi to ra kênh
dn trong màng, bacteriocin thuc nhóm này s liên kt vi lipid trong thành phn
phospholipid màng, chúng s gn trc tit thành phn ca màng,
c hin các phn ng oxi hóa kh to nên nhng l h
nhóm I [24].
Lp III - ng trc tip lên thành t bào, làm tan
thành t bào và phá v tính thm thu [24].
Lp IV- hin nay các nhà khoa hc vt kt lun c th rõ
 ng ca nhóm này. Theo s gi nh ca các nhà khoa
hc, h cho r    ng ch yu lên DNA, RNA và s tng hp
protein. Các bacteriocin nhóm này có th to phc hp không tan v
cn DNA tng hp nên RNA và protein, hoc liên kt vi DNA làm dch mã ra các
protein không bình th nó liên kt trc tip và c ch hong
ca protein [24].
1.2. Tính cht hóa lý ca bacteriocin
1.2.1.  

 lipase và -amylase. Hay vibriocin AVP10  bacteriocin t
chng vi khun Vibrio có trong cá bin, 
[31].
 

3. 
Tên bacteriocin
Nhi x lý
Khong pH bn
Enzyme thy phân
Megacin A  216
60°C/30 phút
2÷7
Chymotripsin, Pepsin,
Trypsin
Clostocin A
100°C/30 phút
4÷9
Trypsin, Chymotripsin,
Pronase P, Rnase, Dnase
Clostocin B
80°C/10 phút
4÷9
Trypsin, Chymotripsin,
Pronase P, RNAse, DNAse
Clostocin C
80°C/10 phút
4÷9
Trypsin, Chymotripsin,
Pronase P, RNAse, DNAse

Trypsin
Nguồn: [43]
1.3.  

Ngày nay, vic s dng rng rãi các bacteriocin trong bo qun thc ph
n nhng li ích nhnh so vi vic s dng cht bo qun hóa h
- An toàn trong bo qun thc phi, ít có hn ch 
vi nhng cht bo qun hóa hc vì các phân t c sn sinh t nhiên bi vi sinh
vt lên men trong thc phm lên men truyn thng [36].
- ng vì chúng b thoái bin nhanh chóng.
- c s dn th yi vi các tác
nhân gây bnh mà không làm n vi khun có li [30].
- Bacteriocin không làm thai tính cht cm quan thc phm [36].
- Có ph hong rõ ràng.
- B sung cho tác nhân kháng khun.
- Có th thay th thuc kháng sinh trong nuôi trng thy sn mà không gây
c hi vi t bào eukaryote [22].
- Bacteriocin tinh khii n nh v mn 10%, ph hong
i hp so vi kháng sinh truyn thng nên s không git cht nhng sinh vt
có ích.
1.3.2. 
Vi nhng lc ng dng rng rãi trong
13

công nghi t loi kháng sinh a   t s
m 
- c bii các cht bo qun hóa hc.
- B thoái bin nhanh chóng bi các enzyme phân gii protein.
- Chi phí cao trong vit.
- Ch có hiu qu chng li mt nhóm vi khun òi hi có nhng yêu

ng ru     Enterobacter, Klebsiella hoc Samonella. Trong
c sinh ra t vi khun Gram âm có kh c ch các loi vi
khu  ng E.coli H22 có th c ch ng ca 7 chi trong h
Enterob   Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella,
Salmonella, Shigella và Yersinia). Kh c ch c cho là do s sn sinh
ra microcin C7 [35] và colicin E1 và Ib [16].
i vi gia súc và gia cm, v qun lý s phát trin quá mc ca các tác
nhân gây bi trong nguyên liu sn xut tht quan trng. Chúng
có th b nhim trong khâu sn xut và ngay c quá trình tiêu thc b
sung probiotic trong quá trình nuôi là mt vic làm thit yu. Nghiên cu ca
Carina Audisio và cng s [9] khi b sung bacteriocin sn xut t Enterococcus
faecium J96 có kh nh Salmonella pullorum, và nâng
cao t l sng ca gà con. Trong gia súc, d c n ca tác nhân gây
bnh khó có th kim soát bE. coli O157:H7 [27]. Bên cnh
 dc ca nhng tác nhân gây bnh này.
Mt s công trình nghiên cu g b sung colicin t các chng E.coli vào d
c cm s ng tác nhân gây bnh mt cách rõ r.
, E.coli
[37]. E.coli 
 [44].
1.4.
trong NTTS


15


L. monocytogenes 
khói. 
2

c công b (Hình 1.2)

Hình 1.2. S ng bài báo nghiên cu v bacteriocin trong mi chu k
 1949-c trích dn trên Pubmed [18].
Trong đó: “colicin” là các bacteriocin từ E.coli, “microcin” là các
bacteriocin rất nhỏ từ enterpbacteria, “LAB bacteriocin” là bacteriocin từ vi khuẩn
lactic và “marine bacteriocin” là các bacteriocin có nguồn gốc từ biển.
Bacteriocin t Vibrio sp.
Bacteriocin bi   c phân lp t Vibrio harveyi. McCall và
Sizemore n chc 795 chng Vibrio spp. sn sinh ra bacteriocin to
Galveston, Texas. Theo nghiên cu này khong 5% chng Vibrio spp. có kh 
kháng khuc phát hin có kh n
trng phân t c mã hóa trên plasmid và ch có kh i kháng
vi loài V. harveyi (bng 1.4).       c gi là
Harveyicin. Nhng nghiên c    t rng Harveyicin có cu trúc
protein, b bin tính khi x lý vi các loi enzyme và bn nhit (không mt hot tính
kháng khuc x lý nhit  55
0
C trong 4 gi . Harveyicin có kh 
cnh tranh vi các loài vi khung rut  nhi 4 - 39
0
C, pH = 5 - 9,5
 mn 1,75% - 3,5%. Vic phát hin ra Hu cho vic nghiên
cu các loài bacteriocin t vi khun bin. Phn ln nhng nghiên cu này tp trung
nh ti dt cht kháng sinh th h mi hoc
probiotic [3].
17

Các loài Vibrio ng gp ph bi c bin c
phân lp ch yu t ng vt thân mm. Mt vài loài trong s  là các

Bacteriocin

N

Kích
c
(kDa)
Listonella
anguillarum
AVP10
Vibriocin AVP 10
Escherichia coli
Listonella
anguillarum
  
(Arius
thalassimus)
  

?
Vibrio
mediterranei
BLIS
V.
parahaemolyticus
V. mediterranei
  
h 



BLIS
Pasteurella
piscicida
E. coli V.
vulnificus
Enterococcus
seriolicida
Leiognathus
nuchlis
<5
Chng vi khun
 ZM81
Bacteriocins/BLIS
Chng vi khun
bin ZM19
 
  

>10

Trích đoạn Nuơi cấy và bảo quản chủng vi sinh vật

---