MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Tìm ra thuốc để chữa bệnh cho người, từ lâu đã là mơ ước của nhân
loại. Năm 1928, A. Fleming phát hiện ra Penicillin - một chất kháng sinh
(CKS) có nguồn gốc từ nấm Penicillium. Nhưng phải hơn 10 năm sau, vào
năm 1940, một nhóm các nhà khoa học mới tách chiết thành công được
Penicillin. Kể từ đó, Penicillin mới chính thức được dùng để chữa bệnh cho
người. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế
kỷ XX. Sự ra đời của CKS có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực sản xuất
và đời sống. Trong y học, CKS được sử dụng để phòng và chữa bệnh cho
người. Trong chăn nuôi, CKS được sử dụng để chữa bệnh và tăng trọng cho
vật nuôi. Trong nông nghiệp, CKS được sử dụng để thay thế thuốc hóa học và
dùng làm chất kích thích sinh trưởng. Ngoài ra, CKS còn được sử dụng để
bảo quản thực phẩm…[1].
Tuy nhiên, việc sử dụng các CKS không hợp lý đã dẫn đến sự xuất hiện
ngày càng nhiều các VSV gây bệnh có khả năng kháng lại các thuốc kháng
sinh hiện có, đặc biệt là nhiều loài VSV có khả năng kháng chéo nhiều CKS
có cấu trúc tương tự nhau. Do đó việc tìm ra những CKS mới, nhất là các
CKS có cấu trúc hóa học tự nhiên do chính VSV tiết ra cần được quan tâm
nhiều hơn. Hàng năm có khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện và cho
đến nay, người ta đã phát hiện khoảng 17000 CKS có nguồn gốc VSV, hơn
30000 CKS bán tổng hợp, nhưng trong số các CKS này chỉ có 1 - 2% là được
sử dụng trong y học [15, 21].
Trong số các VSV có khả năng sinh CKS thì xạ khuẩn đóng vai trò
quan trọng hàng đầu, chiếm 80% các CKS được mô tả [18]. XK là nhóm sinh
vật nhân sơ (Prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ở nhiều vùng sinh
thái khác nhau trên thế giới. Nhóm VSV này được biết đến với nhiều ứng
dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá trị sử
dụng cao như các enzym thủy phân hợp chất cao phân tử, chất kháng sinh và
nhiều hợp chất y dược khác.
1
vi khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới
nhân sơ (Prokaryota) [32].
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó
có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại
được xếp vào nhóm XK hiếm [11, 36].
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy trong hầu
hết các môi trường: đất, nước, không khí, thậm chí cả những môi trường mà
cả vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. XK phân bố nhiều nhất ở
trong đất, và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên. Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải
khác trong đất [36]. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 -
2.400.000 mầm XK, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [34]. Sự phân bố của XK
phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Sự
phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều
trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. XK có rất ít
trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng
XK trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của XK là khả năng hình
thành chất kháng sinh, 60 - 70% XK được phân lập từ đất có khả năng sinh
CKS [15]. Ngoài ra, XK tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều
hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza,
amylaza, cellulaza… một số axit amin và axit hữu cơ. Một số XK có thể gây
bệnh cho người, động vật [8].
3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
* Cấu tạo tế bào xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G
(+), toàn bộ cơ
Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…[10].
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc
biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử
của XK.
4
Tế bào chất của XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn
nhập gồm các hạt poliphotphat và polixacarit. Nhân của tế bào XK không có
cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non,
toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác
trong toàn bộ hệ khuẩn ty [25].
* Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn
Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách
ngăn (trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi XK có đường kính thay
đổi trong khoảng 0,2 ÷ 1 µm đến 2 ÷ 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài
cm [11]. XK phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh theo kiểu 30 µm một
nhánh. Độ dài khuẩn ty XK trong giai đoạn phát triển là 11µm [35].
Khuẩn ty XK bắt màu gram dương, hiếu khí, hoại sinh, không hình
thành nha bào, không có lông và giáp mô, đa hình thái như dạng hình chùy,
dạng phân nhánh hay dạng sợi dài, dạng phân nhánh thành chùm, thành bó
gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường
không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy [31]. Hệ sợi của
XK có màu sắc rất đa dạng: xanh, đỏ, trắng, vàng, lục, lam, tím, hồng… Các
khuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường lớn hơn các khuẩn ty già
và khuẩn ty không mang bào tử. Các loài XK khác nhau đều có cùng một kiểu
cấu tạo hệ sợi, chỉ khác nhau ở chỗ có loài có hệ sợi dài, thẳng hay làn sóng
hoặc rất ít phân nhánh, có loài lại có hệ sợi ngắn, thường phân nhánh, thẳng
hoặc xoắn.
Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại.
Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất -
hình cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm.
Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong loài thậm
chí ngay trên cùng một chuỗi bào tử. Bề mặt bào tử XK có thể nhẵn (Sm -
Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose)
hay dạng tóc Ha - Hair like [10].
Bào tử XK được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein
với độ dày khoảng 300 ÷ 400A
0
gồm có 3 lớp, các lớp này giúp cho bào tử
6
tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm,
pH… Hình dạng, kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay
đổi khi nuôi cấy trên những môi trường có nguồn nitơ khác nhau [14].
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit
hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon,
muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên
khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng
khác nhau.
Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ
thích hợp cho sự sinh trưởng là 25 - 30
0
C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh
tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 28
0
C. Độ ẩm thích hợp đối
với XK dao động trong khoảng 40 - 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5.
XK không có giới tính [28]. XK có khả năng hình thành enzym và các CKS
nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống.
1.2. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền
chất, enzym và cofactor [15].
1.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn
1.3.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống
Cũng như đối với vi khuẩn, việc phân loại xạ khuẩn hiện nay chủ yếu
dựa vào phân tích trình tự gen mã hóa cho 16S rRNA. Bên cạnh đó các đặc
điểm về hóa phân loại, hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường được
kết hợp để định danh xạ khuẩn một cách chính xác đến tên loài.
Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào
được coi là đặc điểm quan trọng nhất. Các đặc điểm hóa phân loại khác như
thành phần đường, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ GC
trong ADN genom cũng mang tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quan
trọng trong phân loại xạ khuẩn.
Các đặc điểm sinh lý, sinh hoá thường được kết hợp sử dụng trong
phân loại xạ khuẩn là khả năng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu
8
các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hệ
thống enzym. Bên cạnh đó, các chỉ tiêu khác như mối quan hệ với pH, nhiệt
độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với
chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và
nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất
đặc trưng khác của XK cũng được tiến hành phân tích đồng thời [10].
1.3.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại
Các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng về
trình tự rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV. Tất cả các
loài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các
riboxom. Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã
hoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng. rRNA
là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của VSV vì:
- Phân tử này có mặt trong mọi tế bào VSV.
Kể từ khi CKS được sử dụng và đã cứu sống được bệnh nhân bị nhiễm
trùng máu năm 1941 [21], đến nay hàng loạt CKS đã được phát hiện và ứng
dụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tác phòng và
điều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người. Nhờ có CKS
mà y học đã làm giảm bớt mối lo cho nhân loại về căn bệnh nhiễm trùng, điều
trị loại bỏ những mối nguy hiểm của một số bệnh thường gặp như thương
hàn, dịch hạch, dịch tả, thấp khớp, các bệnh về răng miệng, mắt, mũi.
Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra như nấm da, nấm tóc,
móng chân, móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôi trực
tiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống. Có nhiều loại thuốc được sử
dụng để điều trị bệnh này như: nystatin, natamicin, hamicin, rimocyclin…
Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK,
trong đó có tới 1/3 các CKS là do XK hiếm sinh ra. Trong y học, kháng sinh
có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh nhằm mang lại hiệu
quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng sinh (khi kết hợp hai
kháng sinh hãm khuẩn) [21].
10
Hiện nay các CKS còn được sử dụng trong điều trị ung thư. Ngày nay y
học đã biết sử dụng thuốc kháng sinh trong trường hợp bệnh đã chuyển sang
giai đoạn di căn để thay thế cho biện pháp xạ trị và phẫu thuật. Cho đến nay
đã có nhiều loại thuốc kháng sinh được sử dụng trong điều trị ung thư như:
daunorubicin được dùng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin,
sarcom lưới… mitomycin dùng trong điều trị ung thư vú, dạ dày, tụy,
streptozocin dùng trong điều trị ung thư tụy…
Đến năm 2010 thuốc kháng sinh có 17 nhóm với gần 500 tên thuốc
trong đó có 4 nhóm chuyên biệt là chống nấm, chống lao, chống phong, trị
ung thư, còn lại 13 nhóm là thuốc trị các bệnh nhiễm khuẩn thông thường
[37]. Tuy nhiên vẫn chưa có một kháng sinh nào có tác dụng để điều trị virus.
Các bệnh do virus gây ra thường sử dụng các vaccin và interferon để điều trị.
1.4.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y
Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ
thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng
XK có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và Fusarium
oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật [1]. Năm 2002, Trung tâm công nghệ
sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được từ đất chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. LD30 có khả năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi
khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas
solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng [4]. Tuy nhiên việc sử dụng CKS
trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh
tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.
Ngoài công tác bảo vệ thực vật thì CKS còn được sử dụng trong chăn
nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thủy sản, công nghệ thực phẩm… Các loại
CKS thường được sử dụng trong chăn nuôi như: biomycin, terranycin,
tetracyclin, bacitrcin… để phòng chống, điều trị bệnh và tăng trọng cho gia
súc, gia cầm. Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế
và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiêu
hóa và hô hấp trên động vật non, như vậy làm cho chúng khỏe mạnh tăng
trưởng tốt. Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit ở
12
quy mô 12 tấn /năm. Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng trọng
15 - 25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5 - 7%
[1]. Trong công nghiệp thực phẩm, việc sử dụng CKS kết hợp với công nghệ
làm lạnh có thể làm tăng thời gian bảo quản của thực phẩm mà không gây độc
hại cho con người. Một số chất kháng sinh thường được sử dụng trong bảo
quản thực phẩm như: clotetracyclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin,… Các
chất kháng sinh sử dụng theo hướng này cần phải có phổ tác dụng rộng để tác
động lên cả vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh trong
bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại: chất kháng sinh khó phân
hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm cho
người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc, làm
và chọn lựa những phức hệ enzym cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công
nghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzym không thể khai thác được từ
nguồn động vật và thực vật.
Enzym VSV có hoạt tính cao hơn enzym từ các sinh vật khác do VSV
có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn. VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanh
chóng, hàm lượng enzym trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuất
công nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất được
lượng lớn chế phẩm enzym.
Việc lên men sản xuất enzym có thể triển khai trên quy mô sản xuất
công nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết,
khí hậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệu
đơn giản, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong thực tiễn sản xuất enzym hiện nay chúng
thường dùng các nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải của
một số ngành sản xuất khác và một số muối vô cơ. Do đó việc sản xuất enzym
nhờ VSV có khả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh
tế cao.
VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điều
chỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hay
điều chỉnh hoạt lực của enzym) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môi
trường nuôi. Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinh
dưỡng hay điều chỉnh các điều kiện trong quá trình lên men, người ta còn có
khả năng điều chỉnh phổ các enzym sẽ được tổng hợp, làm tăng cường năng
lực sinh tổng hợp enzym hay làm thay đổi hoạt tính của chúng.
Ngoài ra, so với nguồn enzym động vật và thực vật, đối với nhóm
enzym ngoại bào VSV người ta không cần phải phá vỡ tế bào nên có thể sử
14
dụng được tác nhân qua nhiều chu kỳ sản xuất, đồng thời, việc tinh chế thu
enzym ngoại bào VSV thường dễ dàng và chi phí thấp hơn.
1.5.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzym cao từ tự nhiên
VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để
Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylaza có thể dùng để sản xuất
alcohol. Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylaza và glucoamylaza, từ
các phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền quy trình chế biến
thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học và
sinh học.
- Enzym cellulaza: Trong thập kỷ qua, enzym thuỷ phân cellulose ngày
càng được quan tâm. Sự quan tâm này là do các enzym này có khả năng thủy
phân chất thải chứa celluloza, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocelluloza và
celluloza trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm
đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giầu năng lượng khác. Thí
dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể
thu nguồn năng lượng ethanol [29].
- Enzym proteaza: Proteaza thuộc nhóm enzym thủy phân protein được
sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá
và thịt. Proteaza có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất
các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật
nuôi. Proteaza thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban
đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành
các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra
với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzym lên bề mặt cơ chất
và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà proteaza được sử dụng,
một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này
không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phế
thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi
không còn mùi hôi thối [30].
16
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu đất được lấy ở những địa điểm khác nhau thuộc khu vực Trại
Fusarium solani VTCCF-1302
Viện Bảo tàng giống
chuẩn VSV
Aspergillus niger VTCCF-001
Viện Bảo tàng giống
chuẩn VSV
2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.3.1. Hóa chất
- Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose… của
hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất.
17
- Các loại muối: K
2
HPO
4
, KH
2
PO4, KI, MgSO
4
.7H
2
O, KNO
3
, CaCO
3
, NaCl,
FeSO
4
.7H
2
3
- 1
* Môi trường MPA (g/l) (môi trường nuôi vi khuẩn)
- Cao thịt - 5 - Thạch - 20
- Pepton - 10 - Nước cất vừa đủ 1 lít
- NaCl - 5 - pH = 7 -7,2
* Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l) (môi trường phân
lập và giữ giống nấm)
- Khoai tây - 200 - Nước cất vừa đủ 1 lít
- Đường - 20 - pH = 7 - 7,4
- Thạch - 20
18
Copyright: Tài liệu đại học ©