LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo
- TS. Vi Thị Đoan Chính - người đã định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ
em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Trịnh Ngọc Hoàng, CN. Đỗ Thị
Tuyến cùng toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Phòng thí
nghiệm Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học đã tận tình giúp
đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này.
Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người
thân, cùng toàn thể các bạn lớp Công nghệ sinh K6 đã động viên và giúp đỡ
em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này.
Thái Nguyên, ngày 23 tháng 8 năm 2011
Sinh viên
Lương Thị Hương Giang
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chú thích
CFU Colony Forming
Unit
CKS Chất kháng sinh
G (+) Gram dương
G (-) Gram âm
HSKS Hệ sợi khí sinh
HT Hoạt tính
HTKS Hoạt tính kháng
sinh
KS Kháng sinh
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
VSVKĐ Vi sinh vật kiểm
4
Khả năng ức chế các nhóm VSV kiểm định 30
3
.
5
Phổ kháng sinh của các chủng XK đã phân lập 32
3
.
6
HTKS của 5 chủng XK lựa chọn trên môi trường thạch 33
3
.
7
HTKS của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn 34
3
.
8
HT kháng nấm gây bệnh trên chè của 3 chủng XK lựa chọn 36
3
.
9
Hoạt tính enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn 37
3
.
1
0
Hoạt tính enzyme của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn 38
3
.
1
70 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu
vực núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên được dùng để tuyển chọn và nghiên cứu
hoạt tính sinh học.
3. Mục tiêu
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng
sinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế.
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme
ngoại bào.
4. Kết quả chính
Khảo sát sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu tại khu vực
núi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên là khu vực
đã và đang chịu ảnh hưởng của hoạt động khai thác khoáng sản nhiều
năm.
Phân lập và thuần khiết được 70 chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất khác
nhau: đất trồng chè, đất trồng keo, đất trồng màu, đất trồng lúa, đất
vườn, đất đồi trọc.
Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn với các vi sinh
vật kiểm định bao gồm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm
mốc, đặc biệt có sử dụng các chủng nấm gây bệnh trên cây chè là loại
cây trồng chủ đạo ở tỉnh Thái Nguyên.
Tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao có hoạt
phổ rộng, có khả năng kháng được các vi sinh vật kiểm định thuộc các
nhóm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm mốc và nấm
gây bệnh trên chè. Các chủng xạ khuẩn này được ký hiệu: HT17.8,
HT19.1 và HT 12.2. Đây là các chủng có nhiều khả năng ứng dụng
trong thực tiễn.
Kiểm tra hoạt tính enzyme: amylase, protease và cellulase của các
chủng xạ khuẩn và đã tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính enzyme
cao được ký hiệu là: HT12.7 và HT10.6. Đồng thời đã nghiên cứu
được khả năng chịu nhiệt của các enzyme.
Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp nên có
khu hệ VSV khá phong phú, trong số đó có không ít loài xạ khuẩn sinh chất
kháng sinh. Mặt khác, Thái Nguyên lại nằm trong vùng sinh khoáng, có nhiều
loại hình khoáng sản phân bố tập trung. Điển hình là khu vực núi Pháo thuộc
xã Hà Thượng - huyện Đại Từ, là nơi đã và đang diễn ra các hoạt động khai
thác khoáng sản mạnh mẽ.Trong đó chủ yếu là khai thác quặng vonfram. Các
hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường
đất, nước và qua đó, rất có thể sẽ ảnh hưởng đến sự phân bố của hệ VSV.
Trên thực tế đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động khai
khoáng tới sự phát triển và đa dạng của các hệ động, thực vật nhưng lại chưa
có nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động này tới sự phân bố và các hoạt
tính sinh học đến hệ VSV đất.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn
phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu tại khu vực
núi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên là khu vực đã và
đang chịu ảnh hưởng của các hoạt động khai thác khoáng sản nhiều năm.
- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của xạ khuẩn để từ đó có thể tuyển
chọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt là
trong công tác bảo vệ thực vật và môi trường.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và thuần khiết xạ khuẩn từ các mẫu đất.
- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng đã phân lập được với các
VSV kiểm định để tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao.
- Kiểm tra khả năng sinh enzyme ngoại bào để chọn ra các chủng có
hoạt tính enzyme cao.
- Xác định khả năng chịu nhiệt của dịch enzyme.
2
bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các
peoxidase ngoại bào [33]. Các chủng xạ khuẩn xuất hiện trong môi trường
3
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
giàu chất hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu
nhiệt (thermophilic) [39], và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứa
mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn định, đặc
trưng [37].
Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30ºC và pH trung tính là điều kiện
tối ưu cho xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài đã được phân lập ở
các môi trường khắc nghiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh được
phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [28] và
Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở
pH 9,5 - 10 [30].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào
tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đường kính thay đổi trong
khoảng 0,2 - 1 µm đến 2 - 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [11],
[13].
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đây là một trong những đặc điểm phân biệt
khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có
đường kính rất lớn thay đổi từ 5 - 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi,
dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa
dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện
ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùy
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF),
dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có
hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của
cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ,
ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành
dạng lông [10].
Bào tử xạ khuẩn được bao
bọc bởi màng mucopolysaccharide
giàu protein với độ dày khoảng 300
- 400Aº chia làm 3 lớp. Các lớp này
tránh cho bào tử khỏi những tác
động bất lợi của điều kiện ngoại
cảnh như nhiệt độ, pH… Hình
dạng, kích thước chuỗi bào tử và
cấu trúc màng bào tử là những tính
trạng tương đối ổn định và là đặc
điểm quan trọng dùng trong phân
loại xạ khuẩn. Tuy nhiên những
tính trạng này có thể có những thay
đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi
trường có nguồn nitơ khác nhau
[14].
Hình 1.2. Hình dạng cuống sinh bào
tử và bề mặt bào tử của chủng
Streptomyces cinereoruber subp [6]
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự VK G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là
một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,
nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 nm có cấu
thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty.
1.2. Đại cương về chất kháng sinh
1.2.1. Chất kháng sinh (Antibiotic)
Theo khái niệm cũ, CKS là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật mà
ngay ở nồng độ thấp (µg/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh
vật khác một cách chọn lọc (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…). Thuật ngữ
antibiotic được bắt nguồn từ chữ Hi Lạp: “anti” là kháng lại, “bios” là sự
7
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
sống. Thuật ngữ này được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân
biệt penicillin với sulfonamit đã được phát hiện từ những năm 1930. Thuật
ngữ này được thay đổi sau khi penicillin và các chất kháng khuẩn khác đã
được cải tiến và tổng hợp mới trong phòng thí nghiệm. Ngày nay, thuật ngữ
này được sử dụng phổ biến để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, tổng
hợp hoặc bán tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Nhiều chất
kháng sinh được sử dụng như một chất hóa trị liệu có khả năng kháng virus,
tế bào ung thư… Tất cả các CKS đều có tính độc chọn lọc, mỗi CKS thường
chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định [10].
1.2.2. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh
Kháng sinh là thuốc được con người dùng chủ yếu để chống các bệnh
truyền nhiễm. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của
con người và động vật. Cho đến nửa sau thế kỷ 19 người ta đã phát hiện rằng
vi sinh vật chính là thủ phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm. Do đó
liệu pháp hóa học nhằm vào các VSV gây bệnh đã được phát triển thành liệu
pháp điều trị chính.
Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh đã được
dùng trong điều trị vào những năm 1940. Ngay sau đó penicillin đã trở thành
một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh
thế giới II [36].
Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới
9
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1.2.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình
thành chất kháng sinh. Đa số các CKS đang dùng trong y học hiện nay có
nguồn gốc từ XK, trong khoảng 5.500 CKS đã biết đến hiện nay, có tới hơn
4000 chất từ XK [2].
Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ
kháng sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của
nhiều loài VSV khác nhau.
Ngày nay, người ta đã biết CKS là sản phẩm trao đổi thứ cấp của vi
sinh vật. Dẫu vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của CKS đối
với XK. Một số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế
giúp xạ khuẩn tồn tại trong môi trường tự nhiên, sự hình thành CKS là do sự
cạnh tranh môi trường dinh dưỡng. Lại có giả thuyết cho rằng CKS chỉ là
sản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào… [17], [23].
Có 3 con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn:
CKS được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, thông qua một chuỗi các
phản ứng enzyme.
CKS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau.
CKS được hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I,
sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều
CKS có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau [6], [7].
1.2.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Đa số các CKS được dùng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn,
trong số đó có nhiều chất hiện vẫn đang được sử dụng tương đối phổ biến
trong thực tiễn.
Streptomycin: Được Waksman phát hiện ra từ năm 1943, có nguồn gốc từ xạ
khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các VK G(+)
Amphoterycin B: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces nodosus, được dùng để
điều chỉnh các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [23].
Dactinomycin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces antibiticus, có hoạt tính
kìm hãm phát triển các khối u ác tính. Được dùng để điều trị một số bệnh
ung thư [23].
Daunorubixin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces coeruleorubidus, được
dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [23].
1.3. Ứng dụng của chất kháng sinh
11
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1.3.1. Ứng dụng trong y học
Kể từ khi CKS được sử dụng và đã cứu sống được bệnh nhân bị
nhiễm trùng máu năm 1941 [22], đến nay hàng loạt CKS đã được phát hiện
và ứng dụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tác
phòng và điều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người. Nhờ
có các loại thuốc kháng sinh mà con người đã khống chế và loại bỏ được
nhiều bệnh nguy hiểm như dịch tả, thương hàn v.v…
Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra như nấm da, nấm tóc,
móng chân, móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôi
trực tiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống. Có nhiều loại thuốc
được sử dụng để điều trị bệnh này như: nystatin, natamicin, hamicin,
rimocyclin…
Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK,
trong đó có tới 1/3 các chất kháng sinh là do xạ khuẩn hiếm sinh ra. Trong y
học, kháng sinh có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh
nhằm mang lại hiệu quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng
sinh (khi kết hợp hai KS hãm khuẩn) hoặc hiệu quả cộng lực - tăng hiệu lực
của CKS (khi kết hợp hai KS diệt khuẩn) [22].
Căn bệnh ung thư là một trong số những bệnh rất nguy hiểm đối với
con người. Trước đây thường sử dụng biện pháp xạ trị và phẫu thuật để điều
tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc một số sâu bệnh nhất định mà
không ảnh hưởng đến các loài có ích khác và đặc biệt chất kháng sinh còn có
khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học. Các kháng sinh
được dùng để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các
bệnh khô vằn, vàng lụa ở lúa, bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ… Ngoài ra
CKS còn được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng ở những nồng độ
nhất định như kích thích sự nảy mầm của hạt. Các CKS được dùng trong
công tác bảo vệ thực vật thường ở dạng bột hoặc dung dịch có bổ sung các
chất độn để tăng độ bền của CKS. Các CKS có thể được trộn lẫn vào đất,
phun trực tiếp lên thực vật hoặc dùng trong quá trình xử lý hạt giống để tiêu
diệt các mầm bệnh ở bên trong và bên ngoài hạt.
13
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong công tác bảo vệ thực vật được
phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc,
Ấn Độ… Năm 1950, Trung Quốc đã tuyển chọn được chủng Streptomyces
sp. 5406 có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum
gây thối rễ ở bông non [19]. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng
Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh CKS mới là z – methylheptyl iso –
nicotinate, CKS này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như
Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium
moniliforme…[17].
Hiện nay, nước ta cũng bắt đầu sử dụng các CKS có nguồn gốc từ
Trung Quốc, Nhật Bản để thay thế dần cho việc sử dụng các chất hóa học
độc hại trong công tác bảo vệ thực vật. Năm 2002, Trung tâm công nghệ
sinh học – ĐHQGHN đã phân lập được từ đất chủng XK Streptomyces sp .
LD30 có khả năng sinh CKS phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh
nhất là chống chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây
trồng [4].
Ngoài công tác bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y thì CKS còn được
2
, S, Fe, CO
2
,
CH
4
… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin,
cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệ enzyme
tương ứng [3]. Điều đó cho phép con người mở ra khả năng tìm kiếm và chọn
lựa những phức hệ enzyme cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công nghệ khác
nhau, đặc biệt là các nhóm enzyme không thể khai thác được từ nguồn động vật
và thực vật.
Enzyme VSV có hoạt tính cao hơn enzyme từ các sinh vật khác do VSV
có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn. VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanh
chóng, hàm lượng enzyme trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuất
công nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất được
lượng lớn chế phẩm enzyme.
Việc lên men sản xuất enzyme có thể triển khai trên quy mô sản xuất
công nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết, khí
hậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệu đơn
15
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
giản, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong thực tiễn sản xuất enzyme hiện nay thường dùng
các nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải của một số ngành
sản xuất khác và một số muối vô cơ. Do đó việc sản xuất enzyme nhờ VSV có
khả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh tế cao.
VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điều
chỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hay
điều chỉnh hoạt lực của enzyme) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môi
trường. Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinh dưỡng hay
năm: protease từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, protease từ nấm mốc là 10 tấn/năm,
pectinase là 10 tấn/năm… [26]. Các enzyme này có ứng dụng nhiều trong nông
nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích là làm tăng giá trị dinh dưỡng,
tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thức ăn… Các enzyme được dùng ngày
càng nhiều ở các nước trên thế giới.
* Enzyme amylase: Amylase là các enzyme đường hóa, có khả năng phân
hủy amylose và amylopectin và các polysaccharit tương tự giải phóng glucose.
Các enzyme này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các
nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản
17
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Copyright: Tài liệu đại học ©