BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
oOo

PHẠM VĂN TÙNG KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG
VIRUS NIBRG - 14 TRÊN TRỨNG GÀ CÓ PHÔI
TRONG SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H5N1 Ở
QUY MÔ CÔNG NGHIỆP

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn:
TS. LÊ VĂN BÉ
ThS. LÊ PHƯƠNG CHUNG


ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
iv
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CÚM H5N1
3
1.2. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
3
1.2.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay 3
1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam 5
1.2.3. Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người ở Việt Nam 7
1.3. TÁC NHÂN GÂY BỆNH
8
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1 8
1.3.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ 10
1.3.3. Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1 12
1.3.4. Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch 15
1.4. SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH CÚM A/H5N1.
19
1.4.1. Các công nghệ sản xuất vắc xin cúm 19
1.4.1.1. Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi 19
1.4.1.2. Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào 20
1.4.1.3. Một số các phương pháp sản xuất vắc xin cúm khác 22


KẾT LUẬN
47
2.

KIẾN NGHỊ
47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤCiv
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
EID50 : Egg Infection Dose 50 (Liều gây nhiễm 50%)
FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương thế giới)
HA : Haemagglutinin (Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu – Kháng nguyên
HA)
HPAI : Highly pathogenic avian influenza (chủng virus cúm gia cầm độc lực
cao)
LM1 : Liquit Medium 1
LM2 : Liquit Medium 2
LPAI : Low pathogenic avian influenza (Chủng virus cúm gia cầm độc lực
thấp)
NA : Neuraminidase (Kháng nguyên neuraminidase)
NP : Nucleo Protein
NIBSC: National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc
gia về tiêu chuẩn và Kiểm định Sinh học, Anh)

vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay. 4
Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 5
Hình 1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012 6
Hình 1.4. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp
ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A . 8
Hình 1.5. Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào
chủ 13
Hình 1.6. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus
cúm A 15
Hình 1.7. Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “kháng nguyên”
(antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn
kháng nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A (B). 19
Hình 1.8. Quy trình sản xuất vắc xin cúm H5N1 23
Hình 1.9. Bằng kĩ thuật di truyền ngược chủng gốc NIBRG-14 được tạo ra từ 6 gen
của virus A/PR8/34(H1N1) và 2 gen của virus A/Vietnam/1194/2004
(H5N1), trong đó gen HA bị đột biến mất đoạn để giảm độc lực,
cho phép virus này tái tổ hợp này nhân lên bằng công nghệ phôi
trứng gà. 27
Hình 2.1. Sơ đồ lấy mẫu thử nghiệm 30
Hình 2.2. Sơ đồ xác định các điều kiện tối ưu 32
Hình 2.3. Hình ảnh về quá trình đánh dấu vị trí tiêm 33
Hình 2.4. Hình ảnh về quá trình đục lỗ điểm tiêm 33
Hình 2.5. Hình ảnh về quá trình tiêm chủng vào dịch niệu đệm của trứng 33
Hình 2.6. Hình ảnh về quá trình dán kín vị trí tiêm 33
Hình 2.7. Hình ảnh về quá trình cắt vỏ trứng tại vùng buồng khí 34
Hình 2.8. Hình ảnh về quá trình dùng pipette hút dịch niệu trong từng
trứng 34


H5N1 trên trứng gà có phôi để đem vào thử nghiệm và ứng dụng trên quy mô
công nghiệp.

2
Nội dung nghiên cứu:
• Xác định các điều kiện thích hợp để nuôi cấy virus cúm H5N1: thời gian,
nhiệt độ, độ ẩm, liều gây nhiễm.
• Thử nghiệm và áp dụng điều kiện nuôi thích hợp vào quy trình sản xuất
vắc xin cúm trên quy mô 5000-10000 liều/mẻ 3
Chương I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CÚM H5N1
Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus
cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng lan truyền từ động vật
sang người. Virus H5N1 thể độc lực cao (HPAI) vẫn đang là mối đe dọa cho
chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng. Chúng ta có thể khống chế dịch bằng cách tiêu
diệt và loại trừ các loài gia cầm bị nhiễm bệnh trong vùng dịch để cắt đứt đường
lây truyền. Virus cúm A/H5N1 trong giai đoạn từ 2003 đến nay là thể có độc lực
cao, với sự xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan
truyền từ Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới. Tính gây bệnh của
virus A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease
của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng
tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần
tính đến. Trong thời gian này, đặc biệt là trong 5 năm gần đây trên thế giới có
hàng ngàn công trình nghiên cứu về cúm A và cúm A/H5N1 thậm chí là nghiên
cứu phát triển công nghệ sản xuất vắc xin gây miễn dịch cho gia cầm và để chuẩn
bị cho đại dịch có thể xảy ra ở người. Về phương diện dịch tễ, tiến hóa, tạo biến


5
cúm thành 6 giai đoạn, từ mức độ chỉ là nguy cơ nhỏ cho đến khi đại dịch bùng
phát và lan tràn. TCYTTG đánh giá hiện nay đang nằm ở giai đoạn 3 của dịch,
điều đó thừa nhận sự gây nhiễm trên người của virus H5N1 nhưng chưa có bằng
chứng về sự lây truyền virus từ người sang người [19], [24], [29].
Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 như hình 1.2 [34] Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1
1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam
Tại Việt Nam, ca bệnh đầu tiên vào năm 2003, cho đến đầu tháng 3/2012
ghi nhận có tổng cộng 122 ca, đến ngày 7/3/2012 ghi nhận thêm 01 ca nhiễm
cúm A (H5) là một bệnh nhân nam 31 tuổi, ở xã Ea Tyh, huyện Ea Kar, đây là ca
bệnh thứ 4 xuất hiện tại Việt Nam trong năm 2012 và là ca bệnh đầu tiên tại Đắk
Lắk từ trước đến nay đang được theo dõi và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
Tp. Hồ Chí Minh (ca đầu tiên tại Kiên Giang, ca thứ 2 tại Sóc Trăng, ca thứ 3 tại
Bình Dương) 6
Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012 như hình
1.3 [34], [35] .

Hình 1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012
Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người được
ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm. Mặc dù số mắc ít
nhưng tỷ lệ tử vong chung rất cao (58,75%) và chi phí điều trị rất tốn kém, do
vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để khỏi mắc bệnh.
Trước tình hình dịch cúm A/H5N1 có nguy cơ lan rộng ở gia cầm và lây

phòng thí nghiệm PR8. Chủng do Viện NIBSC –Vương quốc Anh cung cấp và
được sự công nhận của TCYTTG. Kết quả nghiên cứu cho thấy vắc xin cho đáp
ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm đạt yêu cầu theo khuyến cáo của
TCYTTG. Trên cơ sở thành công của đề tài, năm 2007, Viện đã được TCYTTG
chọn là một trong các cơ sở nằm trong chiến lược dự trữ vắc xin cúm đại dịch
cho toàn cầu và được tài trợ xây dựng một nhà máy đạt chuẩn GMP-WHO để
sản xuất vắc xin cúm với công suất 1 -3 triệu liều vắc xin/năm. Tiếp theo, năm
2011, Tổ chức PATH (Mỹ) đã tiếp tục tài trợ nguồn kinh phí để vận hành nhà
máy. Sản phẩm vắc xin cúm A/H1N1 sản xuất trên dây chuyền công nghệ của
nhà máy hiện nay đang được thử nghiệm lâm sàng trên người. Tiếp tục chiến
lược sản xuất vắc xin cho đại dịch, từ tháng 10/2011 đến nay nhà máy bắt đầu

8
sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 bằng chủng NIBRG-14, hướng tới thử nghiệm
lâm sàng dự kiến thực hiện vào năm 2013 cho loại vắc xin này. Nếu thử nghiệm
lâm sàng thành công, Vắc xin sẽ được đăng ký cấp phép sản xuất ở qui mô công
nghiệp với công suất 1-3 triệu liều/năm, đủ đáp ứng cho nhu cầu phòng chống
dịch cho các đối tượng có nguy cơ cao.
• Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu phát triển dạng vắc xin
nuôi cấy trên tế bào VERO, sử dụng chủng NIBRG-14. Tuy nhiên dạng vắc xin
này cũng mới chỉ dừng ở mức độ đề tài nghiên cứu.
1.3. TÁC NHÂN GÂY BỆNH
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1
Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà) có tên khoa học
là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại
chung (Basic Taxomomy) [22]. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc
hình khối đa diện, đường kính 80-120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối
lượng phân tử khoảng 250 triệu Da [19], [24], [29].
• Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA;
70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [11].

kháng nguyên bề mặt (NA và HA), cho đáp ứng miễn dịch khác nhau giữa các
chủng virus ở cơ thể bị nhiễm [7], [8]. Có 16 phân type HA và 9 phân type NA
đã được phát hiện, sự tổ hợp giữa các phân type này, về lí thuyết, có thể tạo ra
hơn 254 biến chủng khác nhau, trừ chủng ban đầu [29]. Hiện nay, dữ liệu gen và
hệ gen của virus cúm A có thể được tìm thấy trong Ngân hàng gen [18], tại mạng
lưới chuyên gia cúm gia cầm của Tố chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ
chức Thú y thế giới (OIE) [22], [23]; và tại trang web của Trung tâm dữ liệu các
gen virus
(Influenza Sequence Database
). TCYTTG đã quy định thống nhất danh
pháp theo thứ tự kí hiệu: Tên serotype - Loài động vật bị nhiễm - Vùng địa lí
phân lập - Số hiệu đăng kí chủng virus - Thời gian phân lập - Loại hình phân type

10
[HA(H) và NA(N)]; ví dụ: A/Chicken/Vietnam/ HG4/2005(H5N1). Đối với các
virus được phân lập trên người bệnh, thì không cần ghi loài mắc trong danh pháp, ví
dụ: A/Vietnam/1194/2004(H5N1) [31].
1.3.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ
 Độc lực gây bệnh của virus cúm A
Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại:
Loại độc lực cao (HPAI), và loại độc lực thấp (LPAI), cả hai loại đều cùng
tồn tại trong tự nhiên [21].
• HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội
tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia
cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm, loại này rất nguy hiểm gây lo
ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và
tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29].
• LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm
nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ.
Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên

ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ
bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng:
formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và
hydroxylamine. Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được
15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy
được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn
toàn ở 100
o
C và ở 60
o
C/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong
phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (−70
o
C). Trong phủ tạng gia
cầm (40
o
C), virus tồn tại 25 - 30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ cơ
thể người (37
o
C), trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30
o
C [22],
[29].

12
1.3.3. Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1
 Đường xâm nhập của virus vào tế bào chủ
Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân
lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa
của cơ thể nhiễm [22], [24], có những nét đặc trưng như sau:

các protein của virus (Hình 1.5).
• Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển
gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là
hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển
trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng
các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các
“chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ
thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng
các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [22],
[23].
Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ ở
hình 1.5 [11].

Hình 1.5. Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên
của virus cúm A ở tế bào chủ

 Phương thức lây truyền
Các chủng của virus cúm gia cầm có thể lây nhiễm cho nhiều loại động
vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi, hổ và người. Virus cúm có

14
thể lan truyền nhanh từ trại chăn nuôi này sang trại chăn nuôi khác bằng các cơ
chế cơ học qua các phương tiện vận chuyển, quần áo, giày dép Virus có nhiều
trong chất bài tiết như dịch mũi họng, phân gia cầm bệnh, bụi và đất. Tiếp xúc
trực tiếp với gia cầm bệnh hoặc đồ dùng, vật dụng bị nhiễm bởi phân gia cầm là
đường lây truyền chính. Virus có thể lây truyền qua không khí (qua các giọt nhỏ
dịch tiết đường hô hấp của gia cầm bệnh hoặc hít phải không khí có chứa bụi từ
phân gia cầm) hay qua ăn uống (nước, thực phẩm nhiễm virus ) và tiếp xúc với
dụng cụ và đồ vật nhiễm virus. Người có thể bị lây bệnh do tiếp xúc trực tiếp với
gia cầm bị bệnh qua chăn nuôi, vận chuyển, giết mổ, chế biến, ăn gia cầm và sản

loài vật chủ mới [35]. Ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân
của các đại dịch cúm trên người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người
[21]. Tuy nhiên, các chủng này vẫn thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng
năm ở người, do khả năng biến đổi kháng nguyên của chúng [18]. Đây cũng
chính là nguồn virus trao đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia
cầm, để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên người
[29], [35].

Hình 1.6. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ
của virus cúm A [35]

1.3.4. Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch
 Cấu trúc, chức năng của HA và NA
• Haemagglutinin
Haemagglutinin (HA) là một glycoprotein có cấu trúc trimer, dạng hình
cây mọc nhô ra từ màng lipid của virus với tán cây hình cầu nằm ở phía ngoài.
HA có khả năng gây ngưng kết (agglutinate) hồng cầu.

16
HA là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định độc tính của virus nhờ
khả năng nhận biết và gắn vào thụ thể (receptor) của tế bào chủ. Khả năng này
phụ thuộc vào hai yếu tố:
- Hai dạng phân tử sialic acid (SA) trên thụ thể (receptor) của tế bào chủ:
N -acetylneuraminic acid và N - glycolylneuraminic acid.
- Hai kiểu liên kết với galactose: liên kết alpha - 2,6Gal hay liên kết alpha-
2,3Gal trên bề mặt của tế bào chủ.
HA virus cúm chim có ái lực với liên kết SA anpha - 2,3Gal, có nhiều ở
các tế bào biểu mô của ruột. Ngược lại, HA virus cúm người liên kết với liên kết
SA alpha -2,6Gal, các tế bào biểu mô của khí quản người phần lớn chứa liên kết
trên. Vì vậy virus tấn công cơ quan hô hấp của người, gây bệnh nặng và thường

enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm
mất đi hoặc thay thế (đột biến trượt - xóa) [35] một hay nhiều nucleotide mà
không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus [22], [35].
Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm
thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn
đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy
ra đột biến (đột biến điểm). Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000
nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1
nucleotide sai khác [29], [35]. Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra
đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen của nó, và các đột biến này được
tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có
những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch (Hình1.7).
Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng nguyên NA
và HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới, hoặc làm thay đổi cấu
trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa
rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể
virus mới thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới [29], [35].
• Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các
gen kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có ở virus cúm, và rất ít ở một số
virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng
rất cao. Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của virus cúm A được 2

18
chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào trao đổi cho
nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân
đoạn gen của hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen, tạo
ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai
RNA hệ gen của những virus ban đầu. Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới
có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây