BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS
THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THỦY

Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng Nguyễn Thanh Thủy
Nguyễn Nhƣ Nhứt

Thành phố Hồ Chí Minh
- 2007 - iii

LỜI CẢM ƠN

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã luôn trăn trở, lo lắng và động
viên để tôi có đƣợc ngày hôm nay.

Xin tỏ lòng biết ơn đến tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt quá trình học tại trƣờng.

Xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến chị Trƣơng Phƣớc Thiên
Hoàng và anh Nguyễn Nhƣ Nhứt đã tận tình hƣớng dẫn, động viên tôi trong thời
gian thực hiện khóa luận.

- Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis thích hợp để thu α-amylase là 48 giờ.
- Tỷ lệ tủa α-amylase bằng cồn 96% tốt nhất là 1 thể tích dịch chiết enzyme
và 3 thể tích cồn. Thời gian tủa là 15 phút.
- pH và nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng thủy phân của chế phẩm α-amylase là
6,0 và 55
o
C.
- Lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất từ sự thủy phân bột năng 10%. v
ABSTRACT

NGUYEN THANH THUY, Nong Lam University of HCM city
Graduating thesis topic: “α-amylase production by Bacillus subtilis solid state
fermentation and dextrin production application”. This thesis was carried out at
biochemistry and application room of Natural Science University HCMC from
03/2007 to 09/2007.
We used α-amylase activity measurement method (Heinkel) and protein
concentration determination method (Lowry) to investigate fermentation time, α-
amylase precipitation by 96% ethanol and solid ammonium sulfate. After

Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. BACILLUS SUBTILI ....................................................................................... 3
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn .................................................................................... 3
2.1.2. Phân loại ................................................................................................... 6
2.1.3. Bộ gen ....................................................................................................... 6
2.1.4. Ứng dụng .................................................................................................. 7
2.2. ALPHA-AMYLASE ....................................................................................... 8
2.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 8
2.2.2. Phân loại, danh pháp ................................................................................ 8
2.2.3. Cấu trúc phân tử ....................................................................................... 8
2.2.4. Tính chất ................................................................................................... 9
2.2.5. Cơ chế xúc tác ........................................................................................ 10
2.2.6. Ứng dụng ................................................................................................ 11
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT ..................................... 12 vii
2.3.1. Nuôi cấy bề mặt ...................................................................................... 12
2.3.2. Nuôi cấy chìm ........................................................................................ 12
2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME .............................................................. 13
2.5. DEXTRIN ...................................................................................................... 13
2.5.1. Phân loại ................................................................................................. 14
2.5.2. Tính chất ................................................................................................. 14
2.5.2.1. Độ nhớt ........................................................................................ 15
2.5.2.2. Độ pH .......................................................................................... 16
2.5.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin .......................................................... 16
2.5.2.4. Độ hòa tan .................................................................................... 16
2.5.2.5. Màu sắc ........................................................................................ 16
2.5.3. Quy trình sản xuất dextrin ...................................................................... 17
2.5.4. Ứng dụng ................................................................................................ 18

4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ
(NH
4
)
2
SO
4
............................................................................................................ 25
4.2.1. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% ................................................ 24
4.2.2. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH
4
)
2
SO
4
............................................ 27
4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA ENZYME BẰNG CỒN 96% .. 28
4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE.......................................................... 29
4.4.1. Nhiệt độ .................................................................................................. 29
4.4.2. pH ........................................................................................................... 30
4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN THÍCH HỢP THU DEXTRIN ......... 31
4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA CHẾ PHẨM
α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT .................................................. 32
4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN
THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE ................. 32
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38
PHỤ LỤC


Hình 2.4. Cấu trúc không gian của α-amylase ........................................................... 9
Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột ........................................... 11
Hình 2.5. Dextrin ....................................................................................................... 14
Hình 4.1. Môi trƣờng bán rắn trƣớc khi nuôi cấy .................................................... 25
Hình 4.2. Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 giờ .............................................................. 25
Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ......................................... 30
Hình 4.4. Chế phẩm α-amylase ................................................................................. 36
Hình 4.5. Chế phẩm dextrin ...................................................................................... 36 xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis .................................................. 5
Bảng 2.2. phân loại của Bacillus subtilis ................................................................... 6
Bảng 2.3. Một số tính chất của dextrin ..................................................................... 15
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase ....................... 24
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ............................. 26
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH
4
)
2
SO

xii
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột .......................................... 17

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase ...................... 25
Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ............................ 26
Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH
4
)
2
SO
4
lên hoạt độ α-amylase ................................. 27
Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase .............. 28
Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase ............................... 29
Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ....................................... 31

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1. Lƣợng dextrin thu đƣợc từ các tỷ lệ cồn 96% ...................................... 31
Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ tinh bột 10% .............. 32

Việc sử dụng α-amylase thay thế cho acid trong các qui trình sản xuất
dextrin sẽ khắc phục đƣợc những hạn chế trên. 2
Dextrin thu đƣợc nhờ α-amylase sau khi sấy phun có màu trắng, pH trung
tính, ít ngọt, sạch khuẩn, khoáng và chất hữu cơ nên rất thích hợp sử dụng trong
nhiều ngành công nghiệp và trong y dƣợc.
Từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu
nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”.
1.2. MỤC ĐÍCH
Thu nhận α-amylase, xác định điều kiện tối ƣu cho phản ứng thủy phân của α-
amylase và tinh bột để thu nhận dextrin.
1.3. YÊU CẦU
- Khảo sát thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng bán rắn ở
điều kiện nuôi cấy theo đề tài nghiên cứu trƣớc.
- Thu nhận và tinh sạch sơ bộ α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy B.subtilis.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo
dextrin của chế phẩm α-amylase.
3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn
Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu
khí hay kỵ khí tùy ý. Thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất.

Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa

Trong môi trƣờng lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử
chiu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hƣ hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị
khó chịu.
Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhƣng không
tạo khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium).
Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong điều kiện kỵ khí,
không sinh khí từ môi trƣờng lỏng chứa nitrate.
Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy
gelatine nhanh chóng.
5
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis
Phản ứng sinh hoá Kết quả
Hoạt tính Catalase +
Sinh Indol –
MR +
VP +
Sử dụng Citrate +
Khử Nitrate +
Tan chảy gelatin +

thƣờng có trong thực phẩm nhƣng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm.
2.1.2. Phân loại

Bảng 2.2. Bảng phân loại của Bacillus subtilis 2.1.3. Bộ gen
Năm 1997, ngƣời ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của B.
subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn.
Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4100 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen
không thể thiếu đƣợc, 79 gen đƣợc dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều
có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào. Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli

Một chủng Bacillus subtilis đƣợc biết trƣớc đây là Bacillus natto đƣợc dùng
trong sản xuất thực phẩm thƣơng mại của Nhật tƣơng tự nhƣ thực phẩm
cheonggukjang của Hàn Quốc.
B. subtilis tái tổ hợp đƣợc sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates
(PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải nhƣ là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí
sản xuất PHA giảm.

8
2.2. ALPHA-AMYLASE
2.2.1. Khái niệm
α-amylase là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside nằm
bên trong phân tử tinh bột và glycogen.
Là một enzyme kim loại. Nếu không có sự hiện diện của ion Canxi trong
phân tử enzyme sẽ không hoạt động đƣợc.
α-amylase phân cắt cacbonhydrate chuỗi dài tạo maltotriose và maltose từ
amylose hay tạo maltose, glucose và dextrin từ amylopectin.
Do có thể hoạt động ở bất kỳ vị trí α-1,4 nào trên cơ chất nên hoạt động
phân cắt của α-amylase nhanh hơn β-amylase. Ở động vật, α-amylase là enzyme
tiêu hóa chính.
2.2.2. Phân loại, danh pháp α-amylase
α-amylase: (1,4-α-D-glucan glucanhydrolase) thuộc nhóm enzyme thủy
phân (hydrolase), họ 13 (GH 13), mã số EC 3.2.1.1.
Xúc tác phản ứng nội thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucosidic trong chuỗi
đƣờng đa có chứa 3 hoặc nhiều hơn những đơn vị D-glucose liên kết với nhau ở vị
Hình 2.4. Cấu trúc không gian của α-amylase.
(URL: plaza.snu.ac.kr/~sewonsuh/home/structures.html)

2.2.4. Tính chất α-amylase
Tính chấy đặc trƣng của α-amylase là khả năng dextrin hóa cao nên làm cho
phản ứng màu của tinh bột với iod bị biến đổi nhanh chóng. Kết quả tác động của α-
amylase thƣờng làm giảm nhanh độ nhớt của hồ tinh bột do đó ngƣời ta gọi α-
amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
α-amylase dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối, dung dịch đệm
và rƣợu loãng.
α-amylase hoạt động không cần chất hoạt hóa và cần Ca với vai trò là
một đồng yếu tố để xúc tác sự thủy phân tinh bột. Canxi có tác dụng ổn định tốt α-
amylase trong quá trình thủy phân bằng nhiệt hay kiềm, tăng độ bền của α-amylase 10
trƣớc các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy của protease (Lƣơng Đức
Phẩm, 1998).
pH tối ƣu của α-amylase vi khuẩn trong khoảng 6,0 – 7,0. α-amylase
bị bất hoạt nhanh ở pH thấp 4,5 – 4,7 và khi có mặt các tác nhân tạo phức với Canxi
nhƣ EDTA, polyphosphate, oxalate, chlorine tự do và các chất oxy hóa (Nguyễn
Tiến Thắng, 2005).

O 11
Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột

2.2.6. Ứng dụng của α-amylase
Là một trong những enzyme quan trọng hiện nay do ứng dụng của nó trong
nhiều lĩnh vực nhƣ thực phẩm, dƣợc phẩm, công nghiệp dệt, chăn nuôi…
 Trong công nghiệp thực phẩm:
- Sản xuất rƣợu, bia, nƣớc trái cây.
- Sản xuất bánh, bánh mì: trong tinh bột tự nhiên đã có amylase của ngũ
cốc nhƣng hàm lƣợng của chúng không đủ nên việc bổ sung α-amylase có thể cải
thiện tính chất của bánh nhƣ làm tăng độ nở xốp và mùi vị của bánh.
- Chế biến tinh bột, sản xuất đƣờng maltose, syro glucose, syro
fructose. Dịch giàu glucose đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất bột ngọt, công
nghiệp lên men, sản xuất nƣớc trái cây, làm mứt. Glucose tinh thể đƣợc sử dụng
trong y tế, trong khẩu phần dinh dƣỡng cho bệnh nhân, sản xuất dịch truyền. Syro
fructose đƣợc dùng trong sản xuất đồ uống chứa ít năng lƣợng, bánh kẹo, nƣớc quả
và sản phẩm sữa…
 Làm mềm vải trong công nghiệp dệt:
Trong sản xuất vải có giai đoạn hồ hóa làm vải chắc hơn, ngƣời ta hồ hóa
bằng tinh bột. Sau khi dệt ngƣời ta phải loại bỏ chất tham gia hồ hóa bằng cách xử
lý với α-amylase.

trong những thùng lên men có trang bị hệ thống sục khí, khuấy trộn, điều chỉnh pH.
Phƣơng pháp nuôi cấy chìm có ƣu điểm chiếm ít diện tích nhƣng có nhƣợc
điểm là dễ bị nhiễm toàn bộ và chi phí cho trang thiết bị khá cao.

13
2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME
Phần lớn các enzyme thủy phân dễ hòa tan trong nƣớc nên có thể tách chiết
enzyme từ canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn bằng cách lọc hay ly tâm.
Để tinh sạch enzyme ngƣời ta thƣờng dùng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn
bằng dung môi hữu cơ hay các dung dịch muối trung tính (K.Clarkson và cộng sự,
2000).
Phƣơng pháp tinh sạch enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là
phƣơng pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và aceton).
Tỷ lệ dung môi và dịch enzyme là một chỉ tiêu quan trọng, nếu thiếu dung
môi sẽ không thu hồi hết enzyme trong dung dịch (Ngô Xuân Mạnh và cộng sự,
2005). Thông thƣờng ngƣời ta thêm 3 – 4 thể tích dung môi vào 1 thể tích nƣớc
chiết enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, dung môi và enzyme phải đƣợc
làm lạnh xuống 3 – 5
o
C. Phƣơng pháp này cho hiệu suất cao, ít ảnh hƣởng đến hoạt
tính enzyme, dễ tách dung môi khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ. Có thể thu hồi dung
môi bằng chƣng cất.
Phƣơng pháp phổ biến thứ hai để tách enzyme là dùng muối trung tính để
kết tủa. Muối trung tính thƣờng dùng là (NH
4
)
2