BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Báo cáo
Đề tài: quy trình sản xuất amylase và
ứng dụng trong sx mật tinh bột
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
SVTH: Nguyễn Văn Chí 3005110037
Hồ Văn Chương 3005110029
Phạm Đình Chương 3005110030
Nguyễn Minh Nhân 3005110205
Trần Thị Trang 3005110354

TP. HCM 06/2014
NIÊN KHÓA: 2011-2014NIÊN KHÓA: 2011-2014NIÊN KHÓA: 2011-2014NIÊN KHÓA: 2011-2014
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
MỤC LỤC
: TỔNG QUAN VỀ ENZYME
AMYLASE
1.1. Lịch sử nghiên cứu, định
nghĩa
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra
quá
trình lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện
nước
chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hoá tinh bột thành đường ở
nhiệt
độ thường. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor
đã
chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách
được

Endo amylase
Exo amylase
Enzyme khử nhánh
Khử gián tiếp
Khử trực tiếp
γ-
amylase
β- amylase (α- 1,4
–
glucanmaltohydrolase
α-amylase
Maylo-1,6- glucosidase
Transglucosylase (oligo-1,6 glucosidase
Pullulanase
(α-dextrin 6
– glucosidase
Nhóm 6 Trang 4
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

Endoamylase:
-
α– amylase
α– amylase
có khả
năng
phân cắt các liên kết
1,4-
glucoside của cơ chất một
cách
ngẫu nhiên, là enzyme

thành glucose hoặc
maltose.
Pullulanase thủy phân α-1,liên kết
6-
glycosidic của chuỗi
phân
nhánh và α-1,
4-glycosidic.
Nhóm 6 Trang 5
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
- Khử gián
tiếp
Transglucosylase
(oligo-1,6-
glucosidase) và
Maylo-1,6-glucosidase:
Enzyme này thủy phân
liên kết
β-1,6-
glucoside trong isomaltose, panose
và
các dextrin tới hạn có thể chuyển hóa đường có
thể lên men
được.

Exoamylase
-
β–amylase
(β-1,4-glucan-maltohydrolase)
β–amylase

glucose mà không cần có sự tham gia của
các
loại enzyme amylase
khác.
1.2.2. Đặc
tính
Nhóm 6 Trang 6
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Khả năng dextrin hóa: Thủy phân tinh bột > dextrin + một ít
maltoza.
Dextrin có khả năng họat hóa cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme
này.
Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình
thành
ổn định
cấu trúc bậc 3 của
enzyme.
Tính tan: Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và
rượu
loãng
Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu
2+,
Ag
+
,
Hg
2+.
Cơ chất tác dụng: của enzyme amylase là tinh bột và
glycogen.
• Đặc

vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn
Bac.subtilis.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn
khác
nhau
cũng không đồng nhất. α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với
tác
động nhiệt.
Nhiệt độ tối thích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C
(Kozmina,1991).
α-amylase là
một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa
1-30
nguyên tử gam Ca/mol,
nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca
tham
gia vào sự hình thành, ổn định cấu
trúc bậc 3 của enzyme và duy trì hoạt
động
của enzyme. Do đó, Ca còn có vai trò duy
Nhóm 6 Trang 7
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
trì sự tồn tại của enzyme khi bị
tác
động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của
các enzyme phân
giải
protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn
toàn bị mất
hết

trong ngành công nghiệp chế biên thực phẩm vd như kẹo mạch nha, bia khi đó, hạt
ngũ cốc được cho nảy màm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp
và khi đó ta thu được malt.
2.1.1. Malt đại mạch
Các enzyme thủy phân tinh bột trong đại mạch chủ yếu là amylase mà chủ yếu là α-
amylase và
β-amylase, quá trình nảy màm của đại mạch là giai đoạn chuyển hóa
enzyme từ trạng thái khong hoạt đông sang trạng thái hoạt động, đồng thời tổng hợp
them hang loạt các enzyme mới, giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều
chất khô của hạt, tạo độ thông thoáng bằng cách đảo trộn. hạt đại mạch trước khi
ngâm không có hoạt lực của enzyme
α-amylase, khi hạ trải qua 3-4 ngày trong giai
đoạn nảy màm thì hoạt lực đạt tới mức cực đại vào ngày t7. Sau đosex giảm xuống
2.1.2. Lúa
Hệ enzyme trong lúa cũng tương tự như trong hạt đại mạch, trong quá trình
nảy mầm,hoạt động các enzyme tăng cao thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các loại
enzyme và quá trình sinh hóa gần giống đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành
enzyme và tốc độ phản ứng.
Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết. khi hạt nảy mầm,
chúng lại chuyển sang hoạt động.
2.1.3. Vi sinh vật
Trong ba nguồn thực vật, đông vật, vi sinh vật thì vi sinh vật được sử dụng
nhiều nhất để thu nhận enzyme. Cơ bản là do các lí do sau:
- Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn
Nhóm 6 Trang 9
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
khác.
- Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú.
- Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền.

Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus,
rhizopus.
Nấm
men và giả nấm men thuộc các giống Candida,
Saccharomyces,
Endomycopsy,
Endomyces cũng tạo
amylase.
Nhóm 6 Trang 10
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như:
Bac.polymyxa,
Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả
năng
sinh
trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít
bị
nhiễm vi sinh
vật
khác.
Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy
nhiên
cũng có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vugaris 42 có
khả
năng
tạo một lượng nhỏ a-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và
các
enzyme
khác.

lớp
Ascomyctes (năng khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao
gồm
những
sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách
ngăn,
chia sợi
thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang
này
hình thành
những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ
quan
sinh sản vô tính.
Nhóm 6 Trang 11
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Cuống đính bào tử của Aspergillus Oryzae thường dài
1-2mm
nên có thể nhìn thấy
bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng
lên
gọi là bọng. Từ bọng này
phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi
là
những tế bào hình chai. Đầu các
tế bào hình chai phân chia thành những bào
tử
đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử.
Đính bào tử của Aspergillus Oryzae
có

mới.
3.2.3. Các phương pháp phân lập và bảo
quản
3.2.3.1. Các phương pháp phân
lập
Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình
bình
thường
đên nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt vsv. ở những nơi
giàu
chất hữu cơ,
hay nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật,
trong
cơ thể người,
động vật, nơi có nhệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhệt
độ
cao. VSV có khả
năng thích nghi trong trong mọi hoàn cảnh môi trường.
Chính
nhờ khả năng tuyệt
vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong
hoàn
cảnh khắc nghiệt
nhất.
Thông thường để phâp lập một giống chủng vsv để thu nhận enzyme
thì
có 3
cách phân
lập:
- Phân lập giống trong điều kiện tự

Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi
nhanh
được
thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để
chuyển
hóa
nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế
bào(thích ứng
mạnh mẽ .
Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme (ở quy mô
sản
xuất công nghiệp) với một loại enzyme thật sự
mạnh.
Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào
đó
thường
tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa
vào
đặc điểm này
chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại
VSV
sinh tổng hợp enzyme
mà ta
cần
Ví dụ: nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp
protease
cao, ta phải
tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn
phân
lập vsv có khả

Nhóm 6 Trang 13
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Mật độ tế bào vi sinh quá trình biến đổi gen và có những
đặc
điểm sinh hóa
hơn các giống vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên
men,
dịch nước
thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó,
khả
năng thu nhận của
những chủng có khả năng sinh tổng hợp cao thường rất
cao
.
Phân lập

giống

trong

môi

trường

giống

đã hư

hỏng

enzyme amylase này
là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn
hay
có thể mua trực tiếp từ
cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này
là
giống mua thì thời gian bảo
quản và hiệu suất chất lượng giống được bảo
đảm
chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình
phân lập giống này có thể cho những kết
quả
đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ
sung một chủng giống mới tại phòng
thí nghiệm.
Quá trình lấy mẫu : có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai
tây
cắt lát
đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng
khoai
tây ra, rửa
sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào
bao
nylon và mang
về phòng thí
nghiệm.
Tiền hành thí nghiệm phân
lập:
• Nghiền mẫu đối với mẫu khoai
tây

• Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống
thạch
nghiêng
với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể
dự
trữ trong
máy làm
đông.
Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (quy mô nhỏ
).

 Đổ 10ml H
2
O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử
nấm.
 Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung
dịch
huyền
phù.
 Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác
có
chứa môi
trường sinh trưởng của
nấm.
KH
2
PO
4
1,4 mg
NH

C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng
/
phút. Sau khi nhân
giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi
bảo
quản và dự trữ. Để có hiệu
quả cao cho nấm mốc giống ta cần có
những
phương pháp bảo quản thích
hợp.
3.2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh
vật
Mục đích của bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sản xuất enzyme
là
đảm
bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzyme và tính ổn định của
hoạt
tính
enzyme. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như
sau:

Cấy

truyền

và bảo

quản

lạnh

tục.
Nhóm 6 Trang 16
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang

Bảo

quản

giống

trong

đất

hoặc

trong

cát
Phương pháp dựa trên nguyên tắc : Trong môi trường tối thiểu có độ
ẩm
thấp, vi
sinh vật có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme
trong
thời gian
dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm
mốc Asp.oryzae.
Trước khi sử dụng, đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm <
5%.

Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau:
Giống
ống nấm
mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo
nhiều.
3.3. Yêu cầu đối với giống vi sinh
vật
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại
và
được sản
xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng
trong
công nghệ
enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất
định.
Đó
là:
o Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này
phải
có số
lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá
trình
trao đổi
chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp
hàng
nghìn lần cơ
thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể
VSV
cần tổng hợp
nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác.

Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo
quản.
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình
lên
men công
nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần
khiết.
Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải
tiến
hành phân
lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động
mạnh,
đồng thời phải
tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi
trường
tối thích cũng như
tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng
hợp
Enzyme Amylase không
những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV
mà
còn phụ thuộc vào việc tuyển
chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các
yếu
tố hoá học (thành phần môi
trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá
trình
nuôi cấy cũng có một ý nghĩa
rất lớn đối với sinh tổng hợp
Enzyme

cát.
- Sấy chân không < 40
o
C (độ ẩm
5%).
- Dùng parafin rắn đun chảy và đổ lên nút
bông.
-
Thời gian bảo quản: 1 năm hoặc
hơn.
4.2. Nguyên
liệu:
- Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất
béo,
10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ
37-59%.
- Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có
vị
chua hay
đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp
chất
độc không quá
0,05%.
- Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường
nuôi
cấy: trấu, mạt
cưa….
4.3. Sơ

đồ

NGHIỀN MỊN
TRÍCH LY
LỌC
KẾT TỦA ENZYME
ENZYME THÔ
GIỐNG VSV
SẮC KÝ
BAO GÓI
SẤY
THÀNH PHẨM
Nhóm 6 Trang 20
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
4.4. Thuyết

minh

quy

trình:
- Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất
béo,
10-14%
protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ
37-59%.
- Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có
vị
chua hay
đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp
chất

o
C, độ ẩm 60-65%, đồng
thời
phải thoáng
khí.
- Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô.
Cần
thu nhận
enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm
sinh
bào tử là lúc
quá trình tổng hợp enzyme đa yếu đi. Do đó cần một bước
nuôi
cấy thử nghiệm để
xác định thời điểm thu nhận enzyme thô. Chế phẩm
enzyme
thô thu được chứa tế
bào nấm, cơ chất, nước và
enzyme
- Để giữ hoạt tính của enzyme, sấy chế phẩm thô này ở nhiệt độ
30-40
o
C,
độ ẩm sau
sấy là
10%.
- Nghiền mịn: chế phẩm enzyme thô được nghiền với cát và bột
thạch
anh. Cát và bột
thạch anh được rửa sạch, sấy khô

được
enzyme
amylase. Gel sử dụng là Sephadex
G200.
- Sấy: sản phẩm sau sắc ký được sấy ở nhiệt độ 30-40
o
C để bảo đảm
hoạt
tính cho
enzyme, độ ẩm sản phẩm là
5%.
4.5. Ưu

và

nhược

điểm

của

phương

pháp

này:
a. Ưu
điểm
Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được
tạo


hưởng

đến

chất

lượng

enzyme:
a. Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh
dưỡng:
Nhóm 6 Trang 22
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Nguồn dinh dưỡng Nito hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi
trường
dinh
dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người
ta
dùng muối
vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại
nấm
sợi tạo α-
amylase. Hàm lượng thường dùng là 0.91% Natri Nitrat và
Amoni
Nitrat có hiệu
quả hơn so với các muối khác( Kali Nitrat, Magie Nitrat,
Amoni Sunfat…)
Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng

0.15 - -
NH
4
NO
3
0.15 98 4100
Nhóm 6 Trang 23
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
NH
4
NO
3
0.3 45 4900
NH
4
H
2
PO
4
0.3 5.5 8000
b. Ảnh hưởng của amino
acid:
- Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nito vừa
là
nguồn năng
lượng.
- Một số amino acid riêng rẻ (glutamic acid, aspatic acid ) đóng vai
trò
vô cùng quan
trọng trong trao đổi amino acid, cụ thể là sinh tổng hợp

4
sẽ
có
ảnh hưởng xấu
đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. khi đó sự tổng
hợp
α-amylase bị ức chế
hoàn toàn. Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp
α-
amylase là
0.05%.
- Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh
chất
(nucleic
phospholipide acid) và nhiều coenzyme, đồng thời đề phosphoryl
hóa
glucide trong quá
trình oxy hóa sinh học. phospho ảnh hưởng trực tiếp tới
sinh
sản của nấm sợi, do vậy
mà tăng cường tổng hợp enzyme. Các muối
phospho
thường được dùng với nồng độ
Nhóm 6 Trang 24
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng
cao
khi có 0.1%
KH
2


hưởng

đến

quá

trình lên
men:
a. Độ ẩm môi
trường:
Tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ
ẩm
môi
trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ
cho
độ ẩm môi
trường không bị giảm trong quá trình phát triển. Ảnh hưởng
của
việc giữ ẩm trong quá
trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của
Asp.oryzae
nuôi bằng phương pháp bề
mặt:
Bảng: ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo
α-
amylase
của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề
mặt
Nhóm 6 Trang 25