4
B Y T
TRNG I HC Y H NI

o0o
BO CO KT QU NGHIấN CU TI CP B

nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng
dụng trong điều trị một số tổn thơng giác mạc Ch nhim ti: PGS.TS. Nguyn Th Bỡnh

C quan ch trỡ ti: Trng i hc Y H ni
Ch nhim ti: PGS. TS. Nguyn Th Bỡnh
Th ký ti : TS. Nguyn Khang Sn
C quan ch trỡ ti:Trng i hc Y H ni
Cp qun lý: B Y t
Thi gian thc hin: t thỏng 8 nm 2006 n thỏng 8 nm 2009
Tng kinh phớ thc hin ti: 380 triu ng
Trong ú: kinh phớ SNKH 380 triu ng
Ngun khỏc: 0 triu ng H Ni - 2009 1 BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ VỀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI
CỦA ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

1. Tên đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị
một số tổn thương giác mạc”.
2. Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS Nguyễn Thị Bình
3. Cơ quan chủ trì đề tài : Trường Đại học Y Hà nội

“Đánh giá hiệu quả xử lý mẫu mô vùng rìa sinh thiết trong tạo tấm biểu mô giác
mạc thỏ nuôi cấy”.
+ 1 NCS chuyên ngành Nhãn khoa (ThS. Vũ Thị Tuệ Khanh): Tên đề tài:
“Nghiên cứu phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc vùng rìa nuôi cấy điều trị
hội chứng suy giảm tế bào nguồn sau bỏng mắt do kiềm”.

2 6.2. Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm
KHCN: Đối chiếu với yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm
đặt ra trong đề cương, đề tài đã đạt đầy đủ:
- Tấm màng ối người đã xử lý: có kích thức 3x3 cm, vô khuẩn, dai và
đàn hồi tốt, làm nền nuôi cấy mảnh mô vùng rìa tạo tấm biểu mô thành công,
không bị phân hủy khi ghép tấm biể
u mô nuôi cấy cho thỏ và bệnh nhân
- Tấm biểu mô giác mạc thỏ và người nuôi cấy: có đầy đủ đặc điểm về
cấu trúc hình thái và hóa học của biểu mô giác mạc: rộng 4cm
2
, là biểu mô
lát tầng không sừng hóa gồm 4-5 hàng tế bào , các tế bào liên kết chặt chẽ
với nhau bằng các mộng bào tương và thể liên kết, không có tế bào tiết nhày,
bào tương chứa K3 và K12, sống và áp sát vào nhu mô của giác mạc khi
ghép cho thỏ và cho người (thỏ: 3 tháng, người: 9 tháng)
- Gây bỏng giác mạc cho thỏ: Xây dựng thành công mô hình gây bỏng
giác mạc thực nghiệm cho thỏ: phá hủy toàn bộ biểu mô giác mạc và vùng
rìa giác mạc, tạo thành sẹo giác mạc.
- Ghép thành công tấm biểu mô giác mạc nuôi c
ấy cho 20 mắt thỏ :
tấm biểu mô dán sát vào nhu mô giác mạc, các tế bào biểu mô có bào tương

giemsa, nhuộm H.E với các kỹ thuật hiện đại như: hiển vi điện tử xuyên và quét, nhuộm
hóa mô miễn dịch, nhuộm huỳnh quang.
7.3. Những đóng góp mới khác: đây là công trình đầu tiên ở Việt nam đã nuôi cấy
và ghép thành công tấm biểu giác mạc nuôi cấy , mở ra một phương pháp hiện đại điều trị
cho các b
ệnh nhân bị hội chứng suy giảm tế bào nguồn giác mạc.
8. Tình hình sử dụng kinh phí: Giải ngân đầy đủ, đúng tiến độ và đúng các quy định về
tài chính hiện hành, có bản xác nhận chi tiêu kèm theo.

Hà nội, ngày 15 tháng10 năm 2009
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS.TS. Nguyễn Thị Bình 6
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu [2] 3
1.1.1. Giác mạc 3
1.1.3. Kết mạc nhãn cầu 4
1.1.3. Vùng rìa giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc. 5
1.1.4. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [36] 8
2.3.4. Ghép thực nghiệm trên thỏ 27
2.3.5. Ghép trên bệnh nhân tình nguyện 30
2.4. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 33
2.5. Địa điểm nghiên cứu 34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35
3.1.Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy. 35
3.1.1. Lựa chọn màng ối 35
3.1.2. Lựa chọn phương pháp xử lý màng ối: 37
3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý mảnh vùng rìa để nuôi cấy 39
3.2.1. M
ẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ được chuẩn bị cho nuôi cấy 39
3.2.2. Diện tích phát triển của tấm BMVRGM nuôi cấy trên nền màng ối 40
3.2.4. Hình thái của tấm BMGM sau nuôi cấy 42
3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 44
3.4. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy 45
3.4.1. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô giác mạc (Bảng 3.3) 45
3.4.2. Chất lượng của tấm biểu mô 45
3.5. Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế
bào gốc BMVR và
tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Đánh giá chất lượng tế bào của tấm BMVR nuôi
cấy 47
3.5.1. Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy 48
3.5.2. Cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô nuôi cấy 49
3.5.3. Cấu trúc hoá học của tấm biểu mô nuôi cấy 51
3.6. Mô hình gây bỏng cho thỏ. 52
3.7. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ 53
3.8. Nuôi và ghép tấm biểu mô nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện 56
3.8.1. Đặc đ

Hình 3.11: Mẫu mô vùng rìa được xử lí bằng dispase (HEx 250): 39
Hình 3.12:Biểu mô vùng rìa tái tạo sau 7 ngày trích thủ (HE x 250) 40
Hình 3.13: Sự phát triển và lan rộng của tấm BMGM nuôi cấy 41
Hình 3.14: Tấm biểu mô nuôi cấy ngày thứ 4. (KHV soi nổi x 25): 42
Hình 3.15: Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 10 ngày (Giemsa x 200) 43
Hình 3.16: Tấm biểu mô nuôi cấy 10 ngày 43
Hình 3.17. Tấm biểu mô nuôi cấy 12 ngày, vùng đặt mảnh VRGM(H.E x 250) 43
Hình 3.18: Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 16 ngày (Giemsa x 200) 44
Hình 3.19: Tấm biểu mô nuôi cấy 14 ngày (Nhuộm huỳ
nh quang x 250) 44
Hình 3.20. Nuôi cấy bằng dịch treo 4 ngày( Giemsa x 400) 46
Hình 3.22: Tấm biểu mô nuôi cấy ngày thứ 3 46
Hình 3.21. Tấm biểu mô nuôi cấy bằng dịch treo 18 ngày (H.E x500) 47
Hình 3.23. Tấm biểu mô nuôi cấy bằng mảnh mô vùng rìa 16 ngày (H.E x500) 47
Hình 3.24 : Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (giemsa x250) 48
Hình 3.25 : Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (H.E x500) 49
Hình 3.26. Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy14 ngày (x5000) 49
Hình 3.27. Mặt dưới màng ối (x 10.000) 50
Hình 3.28: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (x4000). 50
Hình 3.29: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (x10.000). 50
Hình 3.30. Tấm biểu mô nuôi cấy 14 ngày (P.A.S x 1000) 51
Hình 3.31: Tấm biểu mô nuôi c
ấy 18 ngày (K3x500). 51
Hình 3.32: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (K12x500). 51
Hình 3.33: Mắt thỏ trước bỏng 52
Hình 3.34: Mắt thỏ ngay sau khi gây bỏng 52
Hình 3.35: Mắt thỏ sau bỏng 1 tháng 52
Hình 3.36: Sau bỏng 7 ngày (H.E x 100) 53
Hình 3.37: Sau bỏng 15 ngày (H.E x100) 53
Hình 3.38: Sau bỏng 45 ngày (H.E x 100) 53

Bảng 3.7: Kết quả phẫ
u thuật tại các thời điểm theo dõi 57

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Tổn thương giác mạc là một bệnh lý thường gặp trong nhãn khoa.
Nguyên nhân gây tổn thương giác mạc rất khác nhau nhưng đều làm mất độ
trong của giác mạc và gây giảm thị lực ở nhiều mức độ khác nhau. Trong
một số trường hợp, vùng rìa giác mạc - nơi cư trú của tế bào gốc biểu mô
giác mạc cũng bị tổn thương, di chứng để lại cho bệnh nhân là hộ
i chứng suy
giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc. Hậu quả của hội chứng này làm mất
độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng
rìa lên bề mặt của giác mạc, loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô
giác mạc tái phát [12, 15, 34, 41, 46]. Để điều trị hội chứng suy giảm tế bào
gốc của biểu mô giác mạc, các nhà nhãn khoa đã sử dụng các phương pháp
khác nhau: Ghép kế
t mạc rìa tự thân, ghép giác - củng mạc rìa từ giác mạc
tử thi, ghép màng ối. Kết quả điều trị khá tốt, đặc biệt với những trường hợp
tổn thương một mắt. Tuy nhiên với các kỹ thuật này, mảnh mô dùng để ghép
lấy từ bên mắt lành hoặc từ mắt tử thi cần có một diện tích khá lớn hoặc cần
toàn bộ giác mạc.
Trong vài năm gần đây, y – sinh họ
c hiện đại đã đạt được những thành
tựu lớn trong việc đổi mới mô bằng ghép tế bào gốc. Trong nhãn khoa, công
nghệ tạo tấm biểu mô giác mạc từ việc nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc
trên thực nghiệm và trên người đã có những thành công nhất định. Ghép tấm

hiệu quả ghép trên mắt thỏ.
4. Bước đầu tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy, ghép tự thân cho một số
bệnh nhân tổn thương giác mạc.

3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu [2].
Bề mặt nhãn cầu (BMNC) là vùng được giới hạn bởi hai đường xám
của mi trên và mi dưới. BMNC gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc và
được ngăn bởi biểu mô vùng rìa giác mạc (VRGM).
1.1.1. Giác mạc
Giác mạc chiếm 1/6 vỏ ngoài của nhãn cầu, hình hơi bầu dục, dày 0,8
– 0,9 mm ở vùng trung tâm và 11,7 mm ở chu biên. Giác mạc là cấu trúc vô
mạch, gồm 5 lớp: Biểu mô giác mạc, màng Bowman, chân bì giác mạc,
màng Descemet và nội mô giác mạc (Hình 1.1)

Hình 1.1. Ảnh vi thể giác mạc bình thường ( H.E x 250)
1. Biểu mô trước giác mạc 2. Nhu mô
3. Màng Desmert 4. Nội mô giác mạc

• Biểu mô giác mạc: là biểu mô lát tầng không sừng hoá, gồm 4-6
hàng tế bào, chiếm khoảng 10% bề dày của giác mạc. Biểu mô
được chia thành 3 lớp: lớp đáy, lớp tế bào hình cánh, lớp bề mặt.
Các tế bào lớp đáy hình trụ có khả năng phân chia, các tế bào liên

•
Nội mô giác mạc: Là biểu mô lát đơn gồm 1 hàng tế bào đa diện
dẹt xếp đều đặn phủ mặt sau giác mạc. Các tế bào nội mô giác mạc
không có khả năng phân chia.
1.1.3. Kết mạc nhãn cầu.
Kết mạc trải từ vùng rìa củng mạc đến đường xám của bờ mi, được
chia thành 3 phần: kết mạc mi, kết mạc cùng đồ và kết mạc nhãn cầu.

5 Biểu mô kết mạc nhãn cầu là biểu mô trụ tầng. Các tế bào liên kết với nhau
lỏng lẻo, khoảng gian bào rộng. Trong biểu mô có khoảng 5-10% tế bào hình
đài tiết nhày. Lớp đệm của kết mạc là mô liên kết thưa, chứa mạch máu,
mạch bạch huyết và các loại tế bào: lympho, dưỡng bào, tương bào và bạch
cầu đa nhân.
1.1.3. Vùng rìa giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc
.
* Vùng rìa giác mạc:
Vùng rìa giác mạc là chỗ nối tiếp giữa giác mạc trong suốt ở phía
trước và củng mạc trắng đục ở phía sau. Biểu mô vùng rìa (BMVR) là vùng
tế bào biểu mô chuyển đổi về mặt hình thái cũng như chức năng từ biểu mô
lát tầng không sừng hoá của biểu mô giác mạc sang biểu mô có các tế bào
hình trụ, tế bào hình đài tiết nhày của biểu mô kết mạc. Biểu mô vùng rìa
gồm 7-10 hàng tế bào. Lớp t
ế bào đáy của biểu mô hình trụ và có khả năng
phân chia. Những tế bào này được gọi là tế bào gốc của biểu mô giác mạc,
đóng vai trò quan trọng trong việc đổi mới và tái tạo biểu mô giác mạc. Khi
soi vùng rìa bằng kính hiển vi thấy các khía dọc xếp theo hình nan hoa, đục
hơn tổ chức bao quanh. Hình ảnh này được gọi là hàng rào Vogt. Hàng rào

biểu mô hoá bắt đầu từ phía chu vi giác mạc, có
xu hướng về phía trung tâm giác mạc. Bình thường, kiểu hình biểu mô giác
mạc được duy trì nhờ sự cân bằng của những tế bào biểu mô bị bong ra trên
bề mặt và sự thay thế do gián phân của tế bào lớp đáy biểu mô và sự di cư về
phía trung tâm giác mạc của những tế bào đáy được sinh ra từ những tế bào
gốc trong vùng rìa giác mạc.
Thoft và cộng sự đã có nh
ững công trình nghiên cứu chứng minh sự
tồn tại cùng các hoạt động phân chia của tế bào gốc BMGM bằng những
phương pháp nhuộm, đánh dấu phóng xạ, quan sát quá trình biểu mô hoá.
Quá trình đổi mới của biểu mô bề mặt giác mạc tuân theo phương trình X +
Y = Z (Hình 1.2). Trong đó:X là sự tăng sinh tế bào từ dưới lên. Y là sự di
chuyển tế bào từ chu biên vào. Z là sự mất tế bào ở lớp nông [42], [43]

Hình 1.2. Sơ đồ quá trình đổi mới tế bào bề mặt giác mạc.

7 Tseng S. C. G và cộng sự đã ghép màng ối chia 2 nhóm: Một nhóm
chỉ ghép màng ối đơn thuần, một nhóm kết hợp ghép vùng rìa dị thân trên 31
mắt, kết quả nghiên cứu cho thấy các trường hợp có ghép vùng rìa thì thị lực
tăng và biểu mô hoá bề mặt nhãn cầu tốt hơn [48]. Thành công của phẫu
thuật ghép vùng rìa trên những bệnh nhân tổn thương bề mặt nhãn cầu nặng
một lần nữa là bằng chứng cho sự tồn tạ
i của tế bào gốc và vai trò quan trọng
trong sự hàn gắn biểu mô bề mặt nhãn cầu.
Hơn nữa, các mạch máu dưới kết mạc kết thúc và đổ vào đám rối mạch
vùng rìa, đám rối mạch này có vai trò quan trọng cung cấp các chất dinh
dưỡng và oxy cho quá trình gián phân của các tế bào gốc. Những nghiên cứu

năng và cấ
u trúc của tế bào biểu mô trưởng thành; (3) Ngăn chặn không cho
biểu mô kết mạc xâm lấn lên bề mặt giác mạc.
Tóm lại BMVR có chứa tế bào gốc của biểu mô giác mạc đã được
nhiều công trình khoa học chứng minh. Những tế bào đó đóng vai trò rất
quan trọng trong quá trình tái tạo sinh lý và trong quá trình tái tạo hồi phục
sau tổn thương biểu mô giác mạc.
1.1.4. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [36]
1.1.4.1. Mi m
ắt
Mi mắt có tác dụng bảo vệ BMNC khỏi các sang chấn về mặt cơ học
từ môi trường bên ngoài. Quan trọng hơn nữa cấu trúc mềm mại của bờ tự do
mi mắt giúp cho sự dàn trải của phim nước mắt trên BMNC giúp cho BMNC
luôn nhẵn bóng và đủ độ ẩm cần thiết. Bệnh nhân bỏng mắt, bờ tự do của mi
hay bị tổn thương ở nhiều mức độ
khác nhau. Nhẹ nhất có thể mất sự mềm
mại của bờ tự do, nặng hơn có thể có biến dạng toàn bộ bờ mi gây nên hở mi,
trễ mi. Do đó, ảnh hưởng đến sự bền vững của phim nước mắt và gây ảnh
hưởng đến sự toàn vẹn của BMNC.
1.1.4.2. Màng phim nước mắt.
Sự toàn vẹn của bề mặt nhãn cầu cũng được đảm bảo b
ởi mối quan hệ
mật thiết giữa biểu mô bề mặt nhãn cầu và màng phim nước mắt. Các rối
loạn bề mặt nhãn cầu làm màng phim nước mắt kém bền vững và ngược lại,
màng phim nước mắt kém bền vững sẽ góp phần làm các rối loạn bề mặt
nhãn cầu nặng hơn. Những tế bào hình đài thuộc bề mặt nhãn cầu tiết ra
mucin, là thành phần quan trọng của màng phim nước m
ắt. Hai đặc tính cơ

9

Sự trong suốt của giác mạc phụ thuộc vào sự sắp xếp của các sợi
collagen và sự đồng nhất về kích thước sợi cũng như khoảng cách giữa các
sợi. Trong quá trình hàn gắn biểu mô giác mạc, chất căn bản ngoại bào có
chứa các thành phần như Fibronectin, enzym protease, các yếu tố phát triển

10 có vai trò quyết định trong sự kết dính và di chuyển trên bề mặt chân bì giác
mạc của các tế bào biểu mô.
1.2. Màng ối và các phương pháp xử lý màng ối làm nền nuôi cấy
1.2.1. Màng ối
Màng bọc thai gồm 3 màng liên kết với nhau: màng ối, màng đệm,
màng rụng. Màng ối là lớp trong cùng tiếp giáp với buồng ối và có độ dày
khác nhau tuỳ theo vị trí.
Màng ối gồm: Biểu mô, màng đáy và tiếp đến là tổ chức liên kết
mỏng, không có mạch máu (Hình 1.3) [19]. Hình 1.3. Cấu tạo màng rau thai người.
1. Biểu mô; 2. Màng đáy; 3. Lớp đặc;
4. Màng đệm nhẵn; 5. Màng rụng tử cung

Màng ối có nhiều đặc điểm vượt trội hơn so với các màng sinh học
khác là: tính chun giãn, tính trong suốt, mềm mại, nhẵn bóng, mỏng, khó
rách.
Theo nghiên cứu của tác giả Fukuda K. và cộng sự (1999), màng đáy
của màng ối hoàn toàn giống với màng đáy của kết mạc vì có chứa collagen
typ IV, V, fibronectin, laminin-1, laminin-5, vì thế màng ối được sử dụng để
thay thế kết mạc [12]. Các thành phần này đóng vai trò quan trọng trong sự

mạc miệng. Việc bóc tách màng ối ra khỏi màng đệm rất dễ dàng, cùng với
tính chun giãn tốt của màng ối tạo điều kiện cho các thao tác dàn trải trong
quá trình phẫu thuậ
t được dễ dàng.
Màng ối là một nguyên liệu sẵn có, dễ lấy, dễ xử lý. Màng ối được bảo
quản ở nhiệt độ - 80
O
C có thể để được nhiều tháng [11], [26], [32].
Như vậy, màng ối là một màng sinh học có nhiều ưu điểm vượt trội,
được sử dụng để che phủ trên bề mặt nhãn cầu đạt hiệu quả cao. Màng ối là
một chất nền lí tưởng để nuôi cấy tế bào gốc biểu mô giác mạc trên thực
nghiệm [30].

12 1.2.2. Chuẩn bị màng ối làm nền nuôi cấy.
Màng ối được sử dụng làm nền sinh học (giá đỡ sinh học) trong nuôi
cấy tế bào BMVR. Do tính chất của màng ối gần giống màng đáy của biểu
mô giác mạc nên tế bào biểu mô giác mạc có khả năng bám dính, phát triển,
tăng sinh và di cư trên nền màng ối. Mặt khác, khi tấm biểu mô đã phát triển
trên màng ối thì dễ dàng được thu hoạch để cấy ghép.
Chuẩn bị màng
ối cho nuôi cấy là một bước quan trọng, hầu hết các
tác giả đều chuẩn bị và bảo quản màng ối người theo phương pháp mà Lee S.
H., Tseng S. C. G., Prabhasawat P. và cộng sự mô tả:
- Màng rau được thu nhận có chọn lọc từ những ca mổ lấy thai có
kiểm soát, không mắc HIV, viêm gan và giang mai.
- Làm sạch máu và rửa bằng PBS (Phosphate-Buffered Salin) có pha
kháng sinh, kháng nấm .

của tế bào; sau đó dùng nạo biểu mô nạo nhẹ nhàng rồi rửa sạch bằng PBS
vô trùng [39]. Cũng với nồng độ men này nhưng theo Yiqui Du, Jing Chen
thì chỉ ủ trong 30 phút
. Jun Shimazaki và cộng sự (2002) lại loại bỏ biểu mô
của màng ối bằng cách ngâm tấm màng ối vào ammonium 10%, và nạo bỏ
biểu mô một cách nhẹ nhàng [18]
Koizumi N. và cộng sự (2000) đã nghiên cứu so sánh sự phát triển của
tế bào biểu mô VRGM nuôi cấy trên màng ối để nguyên và loại bỏ biểu mô,
tác giả thấy tế bào biểu mô phát triển trên màng ối đã loại bỏ biểu mô nhanh
hơn, tế bào tầng hoá tốt hơn so với màng
ối còn biểu mô, khoảng gian bào
giữa các tế bào hẹp hơn, giữa các tế bào có nhiều thể liên kết hơn. Sự khác
biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001) [23]. Nhưng Fukuda K. (1999)
thì cho rằng biểu mô màng ối có chứa những yếu tố tăng trưởng, yếu tố phát
triển biểu bì EGF, yếu tố phát triển giác mạc bào KGF, yếu tố phát triển thần
kinh NGF. Chính những yếu tố này sẽ giúp TBBM phát triển và phân chia
[13].
Về vấn
đề rã đông màng ối sau bảo quản lạnh hiện cũng có sự khác
nhau giữa các tác giả: Theo Lee S. H. và Tseng S. C. G. thì màng ối sau bảo
quản lạnh sẽ được để trong tủ nuôi cấy 37
o
C, 5% CO
2
qua đêm trước khi sử
dụng [26], [43], [47]. Đa số các tác giả khác chỉ để ở nhiệt độ phòng trước
khi sử dụng từ 15- 30 phút [15], [21], [44].
Nhiều tác giả đã nghiên cứu xem có sự khác nhau giữa việc sử dụng
màng ối tươi và sử dụng màng ối bảo quản? Theo Sato H. và cộng sự (1998)
thì các yếu tố tăng trưởng tồn tại trên màng ối bảo quản giảm 50% so với

vựng rỡa nuụi cy khỏc nhau trong nghiờn cu ca cỏc tỏc gi. Liu S. và
cộng sự (2006) đã xử lý mảnh bằng dispase II (1,2 UI/ml trong dung dịch
muối đẳng trơng của Hank không có Mg
2+
và Ca
2+
) ở 37
o
, 5% CO
2

trong 10 phút [28]. Nakamura.T và cộng sự (2004) lại xử lý mảnh mô vựng
rỡa bằng 0,25% trypsin và 0,02% EDTA trong 5 phút [ 32]. Nng ca
dispase hoc trypsin cú th khỏc nhau trong cỏc nghiờn cu. Mt s tỏc gi
ỏp dng nuụi cy bng dch treo TBBMVR: Cỏc t bo biu mụ vựng rỡa
c tỏch riờng r thnh dng dch treo; sau ú c nuụi cy trờn nn mng
i [21], [28] .

15 1.3.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường thông dụng nhất sử dụng cho nuôi cấy tế bào gốc là môi
trường Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) có nồng độ glucose
cao. DMEM là môi trường nuôi cấy đệm bicarbonate được thiết kế để duy trì
pH từ 7,2 đến 7,4 với nồng độ CO
2
là 5% và 95% không khí. Do vậy, điều
khiển nồng độ CO
2
1.3.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc VRGM
Có hai phương pháp đang được sử dụng để nuôi cấy tế bào gốc vùng
rìa giác mạc: Tạo tấm tế bào biểu mô giác mạc từ mảnh vùng rìa và tạo tấm
biểu mô giác mạc từ dịch treo các tế bào biểu mô vùng rìa. Năm 2007, Alex
J. và cộng sự đã tổng kết 17 báo cáo nuôi và ghép vùng rìa cho bệnh nhân,
thấy có tới 11 báo cáo đã dùng phương pháp thứ nhất [6] . Mảnh tổ ch
ức lấy
từ vùng rìa đặt lên trên mặt màng đáy của màng ối, và được ngâm trong dung
dịch nuôi cấy. Dung dịch bao gồm chất dinh dưỡng và các chất kích thích
tăng sinh và di chuyển của tế bào biểu mô vùng rìa trên bề mặt của màng ối,
quá trình này diễn ra trong khoảng từ 14 đến 28 ngày. Kỹ thuật “air lifting”
được một số tác giả sử dụng nhằm tạo điều kiện cho cho lớp tế bào nuôi cấy
tiếp xúc với không khí và kích thích sự t
ăng sinh và biệt hóa tế bào biểu mô
thành nhiều lớp. Một số tác giả khác cũng sử dụng thêm một lớp ở dưới đáy
của hệ thông nuôi cấy trên, lớp này có 3T3 fibroblasts. 3T3 fibroblasts là các
tế bào được tách ra từ bào thai của chuột, chúng có khả năng tăng sinh mạnh,
có vai trò thúc đẩy sự phát triển và di cư tế bào biểu mô nuôi cấy, đặc biệt
cho tổ chức da và giác mạc. Phương pháp tạo tấm biểu mô giác mạc từ
dịch
treo các tế bào biểu mô vùng rìa được sử dụng trong 6 nghiên cứu. Từ mảnh
mô vùng rìa giác mạc , dùng enzym tách lấy các tế bào biểu mô, dịch treo
gồm các tế bào biểu mô vùng rìa riêng lẻ hoặc thành từng đám tế bào và
nuôi cấy trên các chất liệu khác nhau như kính tiếp xúc, mảnh collagen hay
paraffin, hoặc tấm fibrin hoặc màng ối. Quá trình nuôi cấy cũng mất khoảng
từ 14 đến 21 ngày. Năm 2000, Koizumi N. và cộng sự đã công bố kết quả
nghiên cứu nuôi cấ
y tế bào biểu mô VRGM trên màng ối để nguyên biểu mô