BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI
HỌC BÌNH
DƯƠNG
KHOA CÔNG NGHỆ
SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT
NGHIỆP CỬ
NHÂN CNSH
ĐỀ TÀI:
KHẢO SÁT
ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY
NẤM MEN
RHODOTOR
ULA SP
TRÊN
MÔI
TRƯỜNG
BÁN RẮN
GVHD: Th.S NGUYỄN MINH KHANG
Th.S TRƯƠNG HUỲNH HUY
SVTH: NGUYỄN THANH TRÚC
BÌNH DƯƠNG – 2009


TRƯỜNG ĐẠI HỌC
BÌNH DƯƠNG
KHOA CÔNG NGHỆ
SINH HỌC

nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất trong các ngành y dược, năng lượng
khai khoáng và bảo vệ môi trường.
Đối với Việt Nam, một đất nước nông nghiệp việc ứng dụng xử lý và tái chế các nguồn phế phụ phẩm từ
động vật và thực vật trong các ngành sản xuất nông nghiệp và công nghệ thực phẩm, biến đổi những nguồn
nguyên liệu rẻ tiền để tạo ra những sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường mang lại
hiệu quả kinh tế cho xã hội.
Vitamin A có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người và vật nuôi. Nguồn nguyên liệu thực vật và
vi sinh vật được xem là các nguồn cung cấp dồi dào sắc tố carotenoid nói chung và tiền vitamin A nói riêng. Và
một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp được sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta-caroten
đó là Rhodotorula sp.
Beta-caroten một hợp chất có hoạt tính sinh học cao có vai trò quan trọng đối với con người và động vật.
Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng tỷ lệ beta-caroten trong thức ăn gắn liền với việc giảm nguy cơ của
nhiều căn bệnh ung thư, trẻ hóa làn da, giảm tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch,… Với những lợi ích như vậy, ứng
dụng quá trình lên men bán rắn từ những phụ phẩm dồi dào và rẻ tiền của các ngành như công nghiệp thực
phẩm, nông nghiệp,… Đây cũng chính là mục tiêu của đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men
Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn”.
1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Lựa chọn ra môi trường bán rắn thích hợp nhất cho việc nuôi cấy nấm men đỏ Rhodotorula sp.
- Tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy.
- Thử nghiệm sản xuất và kiểm tra hàm lượng beta-caroten trong chế phẩm từ nấm men đỏ Rhodotorula sp
trên môi trường tối ưu.
1.3 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI
Khảo sát những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm men đỏ Rhodotorula sp trên môi trường bán
rắn thông qua việc tận dụng các nguồn nguyên vật liệu phụ phẩm rẻ tiền từ các ngành nông nghiệp, công
nghiệp, công nghiệp thực phẩm,… để thu được lượng sinh khối cao nhất.

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN
2.1.1 Tổng quan về nấm men [2], [6], [7], [12]

- Cacbon: 25 – 50
- Nitơ: 4.8 – 12
- Protein ( N x 6.25): 30 – 75
- Lipid: 2 – 5
Chất khô của tế bào nấm men gồm có 23 – 28 % là chất hữu cơ và 5 – 7 % chất tro.
Chất hữu cơ gồm có (%): Protein 13 -14 %, glucogen 6 – 8 %, xenluloza 1,8 -2 %, chất béo 0,5 – 2 %.
· Dinh dưỡng nấm men [12]
Dinh dưỡng nấm men thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng. Đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng
nội bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên
ngoài. Khi tế bào ở trạng thái đối với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất
dự trữ nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được sử dụng – dinh dưỡng nội bào.
Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục vụ cho sinh trưởng hoặc
là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào.
· Dinh dưỡng cacbon [12], [4]
Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm men bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác nhau như đường, rượu,
acid hữu cơ, acid amin,…. Hầu hết các loài nấm men đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase
và cellulase. Vì vậy, nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose.
Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm men sử dụng đặc biệt là đường glucose
thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các loài nấm men. Glucose được coi như nguồn
carbon vạn năng đối với vi sinh vật.
Tỷ số đường sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài nấm men. Đối với các nguồn carbon khác như rượu
và acid hữu cơ thì đặc điểm này là giống nhau ở tất cả các loài nấm men. Các loài Saccharomyces lên men rượu
vang sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose và galactose, với rafinose chỉ sử dụng được một phần. Với
lactose, melibiose, dextrin, pentose và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được.
Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men
sinh trưởng tốt sẽ được ưu tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế tiếp các nguồn carbon trong canh trường được
gọi là tính đa dưỡng của nấm men. Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết.
Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất như nhau. Các loài khác
nhau (dù là một giống) sẽ đồng hóa các nguồn dinh dưỡng khác nhau.
Những disaccharide (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ

Phospho: tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các nucleoproteic, acid nucleic,
polyphosphate, phospholipid,…. Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác
nhau, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng. Nấm men sử dụng rất tốt
nguồn phospho vô cơ là orthophosphate. Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau khi được hoạt hóa
sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp.
Khi không đủ phospho trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi đáng kể liên quan tới sự
phá vỡ nhu cầu sử dụng hydratcacbon và nitơ. Nhu cầu sinh lý về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào
khoảng 10 ÷ 13 mgP.
Người ta thường dùng KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
hoặc dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P và K.
Trong dịch đường hóa từ tinh bột thường đủ P đáp ứng nhu cầu của nấm men, rỉ đường củ cải cũng như rỉ
đường mía thường thiếu P, vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường acid orthophosphoric hoặc supephosphat.
Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (-SH) của một số
enzyme CoA. Bởi vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp
được protein. Những chất chứa lưu huỳnh như acid amin (cystine, cysteine, metionine), vitamin (tiamin, biotin)
và một số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men. Trong môi trường nuôi cấy
nấm men thường có (NH
4
)
2
SO
4
làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh. Trong môi trường với hàm lượng lưu

quy mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây,…làm nguồn
vitamin bổ sung vào môi trường.
2 NẤM MEN RHODOTORULA SP
2.2.1 Phân loại [20]
Theo phân loại Harison (1927) nấm men Rhodotorula sp thuộc:
· Giới: Nấm (fungi)
· Ngành: Basidiomycota
· Lớp: Urediniomycetes
· Bộ: Sporidiales
· Họ: Sporidiobolaceae
· Giống: Rhodotorula
Hình 2.1. Nấm men Rhodotorula sp [20], [21]
Hình 2.2. Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [19]
Nấm men Rhodotorula sp còn được gọi là nấm men sinh sắc
tố carotenoid (carotengensis), là một trong rất ít các chi nấm men
có khả năng tổng hợp tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene,
torularhodin.
Năm 1921, A. Harden là người đầu tiên phân lập được loài Rhodotorula mucilaginose, tiếp sau đó năm
1928 Harison và nhiều nhà khoa học khác đã phân lập được 34 loài, trong đó phổ biến nhất là 3 loài
Rhodotorula glutinus, Rh. Mucilaginosa và Rhodotorula gracilis. Năm 2000, Krutzman và Fell cho rằng giống
nấm men Rhodotorula sp gồm 45 loài, theo mô tả của tác giả cho rằng loài Rh. mucilaginosa trước đó có tên gọi
là Rh. rubra, loài này tạo ra enzyme urease, không đồng hoá nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc
nhiệt độ 40
o
C và loài Rh. rubra thực ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh. glutinis, tên gọi Rh. ruba ở một số tài
liệu hiện nay không còn nữa và được thay thế bằng tên mới là Rh. mucilaginosa. [10] [11]
Riêng tác giả người Nhật Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố carotenoide để chia giống nấm
men Rhodotorula sp thành hai giống phụ là: Rhodotorula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 610nm) và Flavotorrula
(hấp thụ tối đa ở bước sóng 450nm).
Theo Lodder (1971), Koneman E.W. và Robert (1983), thì Rhodotorula sp thuộc cơ thể đơn bào, nhóm

Rh. Bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy
5
Rh. Diffluens Kem Tròn cầu,
elip
6
Rh. Fujisanense Kem hoặc hồng Gậy Cây nho dại
7
Rh. Glutinis Hồng hoặc đỏ Tròn cầu
8
Rh. Graminis Hồng Tròn cầu
9
Rh. Ingeniosa Kem Tròn cầu
10
Rh. Javanica Kem Dài
11
Rh. Lactosa Vàng, hồng hoặc
đỏ
Tròn cầu Không khí
12
Rh. Marina Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Con tôm
13
Rh. Minuta Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí, biển
14
Rh. Mucilaginosa
(rubra)
Kem, hồng hoặc
đỏ
Dài Nước, không khí,
…
15

b. Màng nguyên chất
Màng nguyên sinh gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzym permerase.
Trong thời kì còn non màng nguyên sinh chất bám sát lấy thành tế bào làm cho khả năng trao đổi chất của
nấm men gặp khó khăn. Ngược lại ở thời kì tế bào già màng nguyên sinh chất co lại, tạo thành khoảng trống
giữa tế bào và chất nguyên sinh vì thế mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn. Hai hiện tượng
này được gọi là co nguyên sinh và trương nguyên sinh chất.
c. Nguyên sinh chất
Tế bào còn non thì nguyên sinh chất càng đồng nhất, càng về già càng mất tính đồng nhất do xuất hiện
nhiều không bào và hạt voluten. Thành phần bao gồm: nước, protit, lipit, gluxit, muối khoáng và enzym. Tế bào
chất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào.
d. Nhân
Ở Rhodotorula sp đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu. Nó được bao bọc bởi lớp màng bên
trong là lớp dịch nhân. Nhân thường có hình bầu dục và hình cầu. Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấm
men có chứa protein và acid nucleic. Ở trạng thái lên men nhân tăng 20 - 30 lần so với ở trạng thái hô hấp.
e. Các thành phần khác
- Không bào: là nơi chứa đựng protease.
- Hạt không bào: thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào, nguồn năng lượng cho tế
bào, tham gia điều hoà các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào.
- Ty thể: cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào.
- Riboxom: tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men.
- Volutin: không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những điều kiện đặc biệt như khi
nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phoshat vô cơ. Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C : N và
sự có mặt của S cũng như của vitamin. Volutin đóng vai trò quan trọng sau:
+ Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào.
+ Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào.
+ Làm nguồn năng lượng cho tế bào.
2.2.3.2 Sinh sản [3], [4], [11]
Đa số loài của nấm men Rhodotorula sp sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh. pilimanae, Rh. pilatii, Rh.
javaniti, Rh. ingniosa, Rh. diffluens và Rh. bogoriensis. Ngoài ra, Rhodotorula sp còn sinh sản theo kiểu phân
đôi nhưng giống Rhodotorula sp không có kiểu sinh sản theo hữu tính.

· Myo-inositol: -
· Đồng hoá nitrat: +/-
· Cơ chất giống tinh bột : -
· Phản ứng DBB: +
· Hoạt hoá Ureaza: +
· Coenzym : Q9 hoặc Q10
· Xylose : -
Hình 2.3. Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp [19]
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên nhiều các nguồn cơ
chất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch
thể, lên men bán rắn,… chỉ từ giống Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như:
nấm men, nấm mốc, vi khuẩn.
2.3 BETA CAROTENE (β-Carotene)
2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids
2.3.1.1 Tổng quan về Carotenoids
a. Định nghĩa [22]
Carotenoids là các sắc tố hữu cơ tự nhiên được tìm thấy trong thực vật và một số cơ thể sinh vật quang
hợp, thực vật, tảo, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
b. Lịch sử của carotenoids [17], [18], [19], [20]
Nghiên cứu sớm nhất về carotenoids là những ngày đầu của thế kỷ 19. Carotenoid đã được phân lập lần
đầu tiên trong lịch sử bởi Wackenroder vào năm 1831 (thu lập trên cà rốt) và nhiều phát hiện khác về
carotenoids đã được đặt tên trong suốt những năm 1800 dù cấu trúc của chúng vẫn chưa được biết.
Đến tận năm 1907 nhờ kinh nghiệm mà Willstatter và Mieg đã thiết lập được công thức của beta-caroten
C
10
H
56
và cấu trúc này đã được giải thích bởi Karrer trong năm 1930 -1931. Và trong năm 1919, Steenbock
đã đưa ra giả thiết là có thể có mối quan hệ giữa beta-caroten và vitamin A.
Năm 1837 Berzelius đã gọi sắc tố có màu vàng trong là cây là xanthophylls. Và thập niên 1950,