BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH

ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM
MEN RHODOTOR ULA SP TRÊN
MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN
một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp được sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta-caroten
đó là Rhodotorula sp.
Beta-caroten một hợp chất có hoạt tính sinh học cao có vai trò quan trọng đối với con người và động vật.
Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng tỷ lệ beta-caroten trong thức ăn gắn liền với việc giảm nguy cơ của
nhiều căn bệnh ung thư, trẻ hóa làn da, giảm tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch,… Với những lợi ích như vậy, ứng
dụng quá trình lên men bán rắn từ những phụ phẩm dồi dào và rẻ tiền của các ngành như công nghiệp thực
phẩm, nông nghiệp,… Đây cũng chính là mục tiêu của đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men
Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn”.
1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Lựa chọn ra môi trường bán rắn thích hợp nhất cho việc nuôi cấy nấm men đỏ Rhodotorula sp.
- Tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy.
- Thử nghiệm sản xuất và kiểm tra hàm lượng beta-caroten trong chế phẩm từ nấm men đỏ Rhodotorula sp
trên môi trường tối ưu.
1.3 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI
Khảo sát những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm men đỏ Rhodotorula sp trên môi trường bán
rắn thông qua việc tận dụng các nguồn nguyên vật liệu phụ phẩm rẻ tiền từ các ngành nông nghiệp, công
nghiệp, công nghiệp thực phẩm,… để thu được lượng sinh khối cao nhất.
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN
2.1.1 Tổng quan về nấm men [2], [6], [7], [12]
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản vô tính theo lối
nảy chồi. Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi
(Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota).
Nấm men phân bố hết sức rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực phẩm, rau quả,… Đặc biệt
chúng hiện diện nhiều ở các môi trường chứa đường, pH thấp: đất trồng nho và cây ăn quả.
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin và lipid. Vì vậy chúng được
sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến rượu trắng, rượu vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người và gia
súc, làm nở bột mì, gây hương nước chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên
nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2), Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm men có

ngoài. Khi tế bào ở trạng thái đối với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất
dự trữ nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được sử dụng – dinh dưỡng nội bào.
Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục vụ cho sinh trưởng hoặc
là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào.
· Dinh dưỡng cacbon [12], [4]
Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm men bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác nhau như đường, rượu,
acid hữu cơ, acid amin,…. Hầu hết các loài nấm men đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase
và cellulase. Vì vậy, nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose.
Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm men sử dụng đặc biệt là đường glucose
thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các loài nấm men. Glucose được coi như nguồn
carbon vạn năng đối với vi sinh vật.
Tỷ số đường sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài nấm men. Đối với các nguồn carbon khác như rượu
và acid hữu cơ thì đặc điểm này là giống nhau ở tất cả các loài nấm men. Các loài Saccharomyces lên men rượu
vang sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose và galactose, với rafinose chỉ sử dụng được một phần. Với
lactose, melibiose, dextrin, pentose và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được.
Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men
sinh trưởng tốt sẽ được ưu tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế tiếp các nguồn carbon trong canh trường được
gọi là tính đa dưỡng của nấm men. Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết.
Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất như nhau. Các loài khác
nhau (dù là một giống) sẽ đồng hóa các nguồn dinh dưỡng khác nhau.
Những disaccharide (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ
thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men. Các acid hữu cơ cũng chiếm một vị trí quan trọng trong
trao đổi chất của nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men. Chúng cũng có thể
là nguồn dinh dưỡng carbon và năng lượng duy nhất.
Các acid béo có mạch carbon tương đối dài (từ 6 ÷ 10) nấm men chỉ sử dụng ở nồng độ trong môi trường
rất thấp (0,02 ÷ 0,05 %). Ở nồng độ cao sẽ ức chế nấm men phát triển. Acid béo có từ C12 ÷ C17 carbon trong
phân tử được sử dụng tùy thuộc vào từng chủng loại nấm men.
· Dinh dưỡng nitơ [12], [4]
Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi
trường.

2
PO
4
, K
2
HPO
4
hoặc dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P và K.
Trong dịch đường hóa từ tinh bột thường đủ P đáp ứng nhu cầu của nấm men, rỉ đường củ cải cũng như rỉ
đường mía thường thiếu P, vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường acid orthophosphoric hoặc supephosphat.
Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (-SH) của một số
enzyme CoA. Bởi vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp
được protein. Những chất chứa lưu huỳnh như acid amin (cystine, cysteine, metionine), vitamin (tiamin, biotin)
và một số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men. Trong môi trường nuôi cấy
nấm men thường có (NH
4
)
2
SO
4
làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh. Trong môi trường với hàm lượng lưu
huỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men. Nhưng ở nồng độ 1mg/l lưu huỳnh đã kìm hãm quá trình này. Do
vậy, khi sử dụng các nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, cần phải
thận trọng.
· Các ion K
+
, Ca
2+,
Mg
2+

· Họ: Sporidiobolaceae
· Giống: Rhodotorula
Hình 2.1. Nấm men Rhodotorula sp [20], [21]
Hình 2.2. Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [19]
Nấm men Rhodotorula sp còn được gọi là nấm men sinh sắc
tố carotenoid (carotengensis), là một trong rất ít các chi nấm men
có khả năng tổng hợp tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene,
torularhodin.
Năm 1921, A. Harden là người đầu tiên phân lập được loài Rhodotorula mucilaginose, tiếp sau đó năm
1928 Harison và nhiều nhà khoa học khác đã phân lập được 34 loài, trong đó phổ biến nhất là 3 loài
Rhodotorula glutinus, Rh. Mucilaginosa và Rhodotorula gracilis. Năm 2000, Krutzman và Fell cho rằng giống
nấm men Rhodotorula sp gồm 45 loài, theo mô tả của tác giả cho rằng loài Rh. mucilaginosa trước đó có tên gọi
là Rh. rubra, loài này tạo ra enzyme urease, không đồng hoá nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc
nhiệt độ 40
o
C và loài Rh. rubra thực ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh. glutinis, tên gọi Rh. ruba ở một số tài
liệu hiện nay không còn nữa và được thay thế bằng tên mới là Rh. mucilaginosa. [10] [11]
Riêng tác giả người Nhật Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố carotenoide để chia giống nấm
men Rhodotorula sp thành hai giống phụ là: Rhodotorula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 610nm) và Flavotorrula
(hấp thụ tối đa ở bước sóng 450nm).
Theo Lodder (1971), Koneman E.W. và Robert (1983), thì Rhodotorula sp thuộc cơ thể đơn bào, nhóm
nấm men không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ty hay sợi khuẩn ty giả và là nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng
nhiệt độ hoạt động từ 20 - 40
0
C.Chúng phân bố rộng rãi ở khắp nơi: trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây:
táo, dưa hấu, dâu tây, dâm bụt,…
Khi quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm men Rhodotorula sp có dạng hình tròn, oval, elip đến dạng thon
dài hoặc gậy. Kích thước tế bào dao động trong khoảng 2 ÷ 5 μm chiều rộng, 2,5 – 10 μm chiều dài tùy thuộc
vào điều kiện nuôi cấy và độ tuổi.
Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi ghồ ghề, mịn và nhớt. Mép

Rh. Graminis Hồng Tròn cầu
9
Rh. Ingeniosa Kem Tròn cầu
10
Rh. Javanica Kem Dài
11
Rh. Lactosa Vàng, hồng hoặc
đỏ
Tròn cầu Không khí
12
Rh. Marina Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Con tôm
13
Rh. Minuta Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí, biển
14
Rh. Mucilaginosa
(rubra)
Kem, hồng hoặc
đỏ
Dài Nước, không khí,
…
15
Rh. Muscorum Kem hoặc nâu Gậy
nhạt
16
Rh. Pallida Kem hoặc hồng Tròn cầu Nước biển, dưa
leo ngâm
17
Rh. Pilatii Kem Tròn cầu Cây tùng bách
18 Rh. Pilimanae
Hồng hoặc đỏ

chất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào.
d. Nhân
Ở Rhodotorula sp đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu. Nó được bao bọc bởi lớp màng bên
trong là lớp dịch nhân. Nhân thường có hình bầu dục và hình cầu. Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấm
men có chứa protein và acid nucleic. Ở trạng thái lên men nhân tăng 20 - 30 lần so với ở trạng thái hô hấp.
e. Các thành phần khác
- Không bào: là nơi chứa đựng protease.
- Hạt không bào: thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào, nguồn năng lượng cho tế
bào, tham gia điều hoà các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào.
- Ty thể: cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào.
- Riboxom: tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men.
- Volutin: không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những điều kiện đặc biệt như khi
nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phoshat vô cơ. Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C : N và
sự có mặt của S cũng như của vitamin. Volutin đóng vai trò quan trọng sau:
+ Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào.
+ Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào.
+ Làm nguồn năng lượng cho tế bào.
2.2.3.2 Sinh sản [3], [4], [11]
Đa số loài của nấm men Rhodotorula sp sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh. pilimanae, Rh. pilatii, Rh.
javaniti, Rh. ingniosa, Rh. diffluens và Rh. bogoriensis. Ngoài ra, Rhodotorula sp còn sinh sản theo kiểu phân
đôi nhưng giống Rhodotorula sp không có kiểu sinh sản theo hữu tính.
a. Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi
Đầu tiên hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính giữa. Tế bào mẹ bắt đầu phát
triển một chồi con. Hạch một phần chuyển vào chồi và một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển
sang chồi con. Khi chồi con gần bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập. Đây là phương pháp sinh sản
vô tính chủ yếu nhất ở nấm men.
b. Sinh sản bằng hình thức phân đôi
Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ dần tới khi đứt hẳn và
tạo thành hai tế bào con độc lập. Hai tế bào con này giống hệt nhau và đều mang một nửa vật chất di truyền của
tế bào mẹ.

chất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch
thể, lên men bán rắn,… chỉ từ giống Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như:
nấm men, nấm mốc, vi khuẩn.
2.3 BETA CAROTENE (β-Carotene)
2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids
2.3.1.1 Tổng quan về Carotenoids
a. Định nghĩa [22]
Carotenoids là các sắc tố hữu cơ tự nhiên được tìm thấy trong thực vật và một số cơ thể sinh vật quang
hợp, thực vật, tảo, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
b. Lịch sử của carotenoids [17], [18], [19], [20]
Nghiên cứu sớm nhất về carotenoids là những ngày đầu của thế kỷ 19. Carotenoid đã được phân lập lần
đầu tiên trong lịch sử bởi Wackenroder vào năm 1831 (thu lập trên cà rốt) và nhiều phát hiện khác về
carotenoids đã được đặt tên trong suốt những năm 1800 dù cấu trúc của chúng vẫn chưa được biết.
Đến tận năm 1907 nhờ kinh nghiệm mà Willstatter và Mieg đã thiết lập được công thức của beta-caroten
C
10
H
56
và cấu trúc này đã được giải thích bởi Karrer trong năm 1930 -1931. Và trong năm 1919, Steenbock
đã đưa ra giả thiết là có thể có mối quan hệ giữa beta-caroten và vitamin A.
Năm 1837 Berzelius đã gọi sắc tố có màu vàng trong là cây là xanthophylls. Và thập niên 1950,
carotenoids đã được sinh tổng hợp để sử dụng như là một chất màu thực phẩm.
Trong năm 1954 Roche đã bắt đầu sản xuất thương mại carotenoids. Có rất nhiều nghiên cứu đã được thực
hiện trong những năm 1970 – 1980 để xác định sự phù hợp của beta-caroten để sử dụng trong thực phẩm và
hoạt động của nó trong cơ thể người. Và trong những năm đầu thập niên 80 beta-caroten được đề nghị có thể
hữu ích trong việc phòng chống ung thư và nó là một chất chống oxy hoá.
Ngày nay số lượng các carotenoids tìm thấy trong tự nhiên lên đấn 700 hợp chất với các màu sắc khác
nhau. Các carotenoids chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và vi sinh vật.
c. Danh pháp và cấu tạo [4]
Có hai cách gọi tên carotenoids:

của chúng cũng rất khác nhau như dạng hình kim dài (lycopen, δ-carotene), hình khối lăng trụ đa diện
(α-carotene), dạng hình thoi (β-carotene), kết tinh vô định hình (γ-carotene).
Nhiệt độ nóng chảy cao, khoảng 130 – 220
0
C.
Độ hòa tan thay đổi tùy loại dung môi. Tinh thể carotenoid không tan trong nước, tan tốt trong các dung
môi như chloroform, dichloromethane. Hầu như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo và các dung môi không
phân cực.
Các carotenoid tự do tạo màu kem, vàng, cam, hồng, đỏ tùy theo loại hợp chất, nguồn nguyên liệu, điều
kiện nuôi trồng, thời tiết,… dạng caroteneoprotein tạo dãy màu từ xanh lá, tím, xanh dương và đen. Khi đun sôi
sẽ chuyển sang màu đỏ cam do protein bị biến tính, phức hợp với carotenoid bị phá huỷ, màu carotenoid trở lại
bình thường.
Do hệ thống nối đôi liên hợp nên carotenoid dễ bị oxy hóa mất màu, hoặc đồng phân hoá, hydro hóa tạo
màu khác. Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu là nhiệt độ, phản ứng oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp, ion
kim loại, ánh sáng, tác dụng của enzyme (peroxidase, lipxidase, lipperoxidase)…
2.3.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp Carotenoids trong sinh vật [4],[17],[20]
Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn:
· Giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ).
· Giai đoạn tổng hợp các enzyme - giai đoạn này xảy ra trong tối.
· Giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng.
Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpenoids gồm 5 carbon ban đầu. Giai đoạn hai là hình thành các hợp
chất C40. Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoid. Có nhiều hệ enzyme khác
nhau được sử dụng vào giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp các sterol và carotenoid, chúng có chung con
đường là thông qua farnesyl pyrophosphate. Giống Rhodotorula sp thông qua tổng hợp acid mevalonic tương tự
với con đường tổng hợp carotene của các vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid khác (Scharf và Simpson, 1968).
class="bi x5 y12e w8 h14"
Hình 2.6. Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị [4]
Neuroaporen
Lycopene
Lycopene

Phytoen
(phytoffuene Phytoene
Desaturase
ζ-carote
GGPP
(PPPP)
Phytoene
Synthase
GGPP
Synthase
FPP
(Nerosporene)
γ-caroten
Hình 2.7. Con đường
tổng hợp carotenoid ở
thực vật và vi sinh vật.
[16]
Theo Hornero-Mendez
D. và Britton G. (2002 )
có ít nhất 700 loại
carotenoid đã được mô tả
theo 2 con đường sinh
tổng hợp đã được biết.
Phần lớn là c á c carotenoid do các loài thực vật và
vi sinh tổng hợp theo con đường C40. Như vậy có nhiều chứng cứ chắc
chắn rằng sự hình thành carotenoid trong nấm men
theo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất bão hòa. Tuy
nhiên kết quả về sự hình thành vòng chưa rõ Nhưng nhìn
c h u n g , quá trình sinh tổng hợp carotenoids trong sinh vật
đ ư ợ c thực hiện qua hai giai đoạn

Tinh thể beta-carotene có dạng hình lăng trụ 6 mặt màu tím đậm nếu kết tinh từ dung môi
benzen-methanol, nếu kết tinh từ dung môi petroleum ether có dạng lá hình thoi gần như vuông, màu đỏ. Dung
dịch beta-carotene loãng có màu vàng. Beta-carotene có độ hấp thu cực đại trong chloroform tại bước sóng
497nm và 466nm. Vì có 2 vòng β- ionone ở 2 đầu nên β - carotene có hoạt tính provitamin A mạnh nhất.
Beta-caroten là một chất chống oxi hoá vì vậy mà nó có thể được dùng để chống lại một số bệnh ung thư
và căn bệnh khác. Beta-caroten là một chất tự nhiên hiện diện trong những trái cây và rau quả màu vàng xanh.
Trong cơ thể, beta-caroten nằm trong vitamin A và nó được sử dụng như là một chất bổ sung của vitamin A để
ngăn chăn hoặc điều trị những chứng thiếu hụt vitamin A.
Beta-carotene tự nhiên gồm hai dạng đồng phân. Một đồng phân quan trọng là 9 – cis beta – carotene,
đồng phân còn lại là all – trans beta – carotene. Các đồng phân này đều có công thức phân tử giống nhau nhưng
cách sắp xếp của chúng trong không gian ba chiều lại khác nhau. Các đồng phân như vậy thường có những đặc
tính sinh hóa học rất khác biệt. Hợp chất 9 – cis beta – carotene là thành phần chống oxi hóa chủ yếu của
beta-carotene. Trong khi đó, loại beta-carotene tổng hợp chỉ chứa loại đồng phân all – trans beta – carotene có
khả năng chống oxi hóa rất thấp.
2.3.2.3 Sinh tổng hợp β-Carotene [18]
Hiện nay, có hai chu trình sinh tổng hợp β-Carotene được biết đến nhiều nhất, cả hai chu trình này đều là
sự kết hợp đối xứng của các mạch cacbon.
· Chu trình sinh tổng hợp β-Carotene do Badische Anilin- & Soda-Fabrik đề xuất.
Ở chu trình này sự sinh tổng hợp β-Carotene được Badische Anilin- & Soda- Fabrik giải thích dựa trên sự
kết hợp của hai phân tử hữu cơ đều có mạch cacbon bằng 20: C20 + C20
Quá trình sinh tổng hợp β-Carotene được Badische Anilin- & Soda-Fabrik đề xuất.