i
HUỲNH TRUNG VIÊN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CHIM YẾN (AERODRAMUS SPP.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN
CHỈ THỊ PHÂN TỬ CYTOCHROME B CỦA DNA TY THỂ
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: ThS. NGUYỄN THỊ ANH THƢ

Nha Trang, 07/2013
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC & MƠI TRƢỜNG


MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH vii
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHIM YẾN 4
1.1.1. Hệ thống phân loại 5
1.1.2. Đặc điểm hình thái 6
1.1.3. Vị trí địa lý và phân bố 8
1.1.4. Tập tính và hành vi của chim yến 9
1.1.5. Các đặc điểm có thể định danh bằng hình thái 10
1.1.6. Vấn đề bảo tồn đa dạng chim yến hiện nay 11
1.2. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 13
1.2.1. Lông chim 13
1.2.2. Tổng quan về hệ gen ty thể (mtDNA) 14
1.2.3. Đặc điểm của hệ gen ty thể 18
1.2.4. Cytochrome b (Cytb) 19
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CHIM YẾN TRÊN
THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 21
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới 21
1.3.2. Các nghiên cứu ở trong nƣớc 24
1.4. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 24
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 26
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
iv

v DANH MỤC VIẾT TẮT
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool.
bp: Base pair.
Cytb: Cytochrome b.
Cytb FW1: Mồi xuôi (forward primer).
Cytb RV2: Mồi ngƣợc (reverse primer).
Cs.: cộng sự cùng nghiên cứu.
dATP: Deoxyadenosine triphosphate.
dCTP: Deoxycytidine triphosphate.
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate.
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate.
dTTP: Deoxythymidine triphosphate.
DNA: Deoxyribonucleic acid.
MP: thuật toán Maximum Parsimony.
ML: thuật toán Maximum Likehood.
mtDNA: Mitochondrial DNA – hệ gen ty thể.
mRNA: RNA thông tin (Messenger RNA).
NCBI: National Center for Biotechnology Information.
NJ: thuật toán Neighbor-Joining.
SB: đệm Sodium Borate.
PCR: Polymerase Chain Reaction.
RNA: Ribonucleic acid.
T
a
: Annealing temperature (nhiệt độ lai).
T
m


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Một số loài đại diện của các họ Apodidae (Aerodramus fuciphagus),
Hemiprocnidae (Hemiprocne coronata), Trochilidae (Archilochus alexandri) 04
Hình 1.2: Chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) 06
Hình 1.3: Phân bố của các loài yến Aerodramus fuciphagus, Aerodramus maximus,
Collocalia spp. tại các khu vực địa lý khác nhau 07
Hình 1.4: Cấu tạo lông chim 10
Hình 1.5: Hệ gen ty thể ở gia cầm và động vật có vú và Xenopus 13
Hình 1.6: Cấu trúc của protein cytochrome b 14
Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu chim yến trong nghiên cứu 19
Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 24
Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng tách chiết từ mẫu lông và mô cơ chim yến Côn
Đảo 31
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ mẫu lông yến Côn Đảo 32
Hình 3.3: Giao diện sử dụng phần mềm Sequencher trong quá trình xử lý trình tự
thô 33
Hình 3.4: Cây phát sính loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus
fuciphagus thu tại Việt Nam 34
Hình 3.5: Cây phát sinh loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus
ficiphagus thu tại Việt Nam. A. terraereginae đƣợc sử dụng làm nhóm ngoại 36
Hình 3.6: Mạng lƣới haplotype của các phân loài chim yến 40
Hình 3.7: Biểu đồ phân bố haplotype chim yến Aerodramus fuciphagus trong nghiên
cứu theo khu vực địa lý 43
1 MỞ ĐẦU
Tổ yến (hay yến sào) hiện nay là một trong những loại thực phẩm, dƣợc phẩm
có nguồn gốc từ động vật có giá trị cao nhất thế giới. Từ hơn 400 năm trƣớc, ngƣời

Trung Quốc (Hobbs, 2004). Tuy nhiên, nhu cầu tổ yến từ thiên nhiên vẫn tạo nên một
áp lực nặng lên ngành công nghiệp khai thác tổ yến, dẫn đến sự suy giảm nguồn lợi tổ
yến trong những thập kỷ trƣớc tại nhiều quốc gia (Francis, 1987).
Nhƣ vậy, việc khai thác tổ yến có nguồn gốc từ thiên nhiên và việc nuôi chim
yến tại các khu nhà nuôi đã phát sinh ra một số vấn đề nhƣ ảnh hƣởng đến nguồn lợi tổ
chim yến, ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của quần thể chim yến. Ngoài ra
việc tạo nhà nuôi chim yến còn có khả năng thu hút những loài yến vốn không phải bản
xứ đến sinh sống, ảnh hƣởng đến sự phân bố quần thể chim yến tại khu vực có nhà
nuôi chim yến. Thực tế này đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn
một cách hợp lý và kịp thời để nguồn tài nguyên tổ yến tránh bị khai thác quá mức.
Đồng thời vạch ra phƣơng hƣớng bảo vệ quần thể loài chim yến tự nhiên trong tƣơng
lai.
Hiện nay những nghiên cứu về chim yến ở Việt Nam hầu hết chỉ đƣợc thực hiện
ở mức độ khảo sát, thu thập mẫu và dữ liệu liên quan đến phân loại, mô tả hình thái và
giá trị kinh tế của loài chim yến tố trắng (Aerodramus fuciphagus) (Nguyen và cs.,
2002), ấp nở chim yến nhân tạo, nuôi chim trong nhà để lấy tổ, di đàn và nhân đàn
chim yến (Nguyễn Quang Phách, 1993). Các nghiên cứu liên quan đến phát sinh loài
và đa dạng di truyền quần thể của chim yến ở Việt Nam còn nhiều hạn chế.
Việc phân tích mối quan hệ phát sinh loài dựa trên các đặc điểm hình thái (hình
dạng, màu sắc, hành vi tập tính, khả năng định vị bằng tiếng vang, ) chƣa thể cung
cấp đƣợc kết quả chính xác, đặc biệt đối với các loài có quan hệ gần gũi, hoặc giữa các
3 phân loài vì chúng có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau. Vì vậy việc sử dụng các chỉ
thị phân tử để định danh loài và xác định chính xác mối quan hệ phát sinh loài là điều
rất cần thiết (Lee và cs., 1996).
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền
chim yến (Aerodramus spp.) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử Cytochrome b của
DNA ty thể”. Đề tài bao gồm các mục tiêu sau:

(họ Hirundinidae) nhƣng thực ra chúng không có quan hệ họ hàng gần với những loài
chim trong họ này. Sự giống nhau giữa yến và nhạn là do tiến hóa hội tụ phản ảnh kiểu
sinh sống tƣơng tự dựa trên việc bắt các côn trùng làm thức ăn trong khi đang bay
(Thomassen và cs., 2005). Họ yến đƣợc chia thành 2 phân họ là Apodinae và
Cypseloidinae. Phân họ Apodinae bao gồm 79 loài khác nhau, đƣợc chia thành 3 tông:
Collocaliini (28 loài), Chaeturini (24 loài) và Aponidi (27 loài), trong khi phân họ
Cypseloidinae bao gồm 13 loài khác nhau. Nhƣ vậy trong họ yến có tất 19 giống, 92
loài (Alaine, 2004).
5 Việc phân loại yến nói chung là phức tạp, với ranh giới giữa các chi và loài còn
nhiều tranh cãi, đặc biệt là ở tông Collocalini. Phân tích hành vi và kiểu phát ra âm
thanh bị thất bại do tiến hóa song song, trong khi các phân tích về các đặc điểm hình
thái và các chuỗi DNA khác nhau đã sinh ra các kết quả chƣa rõ ràng và thậm chí có
phần mâu thuẫn (Thomassen và cs., 2005).
Hiện nay nhiều nhà khoa học đã nhất trí xếp các loài chim yến có thể dò tìm
đƣờng trong bóng tối, sống và làm tổ ở nơi có cƣờng độ ánh sáng mờ tối đến tối vào
giống Aerodramus. Giống này có nhiều loài, trong đó một số loài có chung đặc điểm là
cho tổ ăn đƣợc (Medway, 1977).
1.1.1. Hệ thống phân loại
Hệ thống phân loại của chim yến tổ trắng (chim yến hàng) Aerodramus
fuciphagus (, Taxonomic Serial No.: 554970):
- Giới: Animalia
- Ngành: Chordata
- Phân ngành: Vertebrata
- Lớp: Aves
- Bộ: Apodiformes
- Họ: Apodidae
- Phân họ: Apodinae

ngón hƣớng về phía trƣớc và 1 ngón hƣớng về
phía sau nhƣ các loài chim thông thƣờng khác.
Các loài chim yến khác nhau sẽ có đặc điểm
về lớp lông khác nhau, đây cũng chính là đặc
điểm để nhận diện giữa các loài yến khác
nhau. Các vị trí lông thƣờng đƣợc sử dụng để
nhận biết là phần chân, lƣng và lông đuôi.
Chúng bay bằng cách đập cánh và lƣợn theo
từng quãng, cánh khi bay có xu hƣớng nghiêng về phía dƣới. Các loài chim yến ở các
khu vực nhƣ Borneo, Philippine và New Guinea đƣợc cho là rất khó phân biệt. Thậm
chí ở một vài loài, việc phân biệt chúng gần nhƣ là không thể (Chantler & Driessens,
1995; Nguyen và cs., 2002).
Chim yến cũng là loài chim sống trên không nhiều (có thể ở liên tục trên không
đến 40 tiếng). Thậm chí là ăn, ngủ và giao phối khi đang bay. Con đực và con cái có
hình dáng tƣơng tự nhau. Khi giao phối, đầu tiên con đực sẽ thực hiện các động tác bay
lƣợn trên không để hấp dẫn con cái, sau đó việc giao phối đƣợc thực hiện ngay tại trên
không (Nguyen và cs., 2002).
Đối với loài chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus), kích thƣớc của chúng
vào khoảng 12cm (chiều dài thân), đôi cánh khỏe, sải cánh dài 12 – 15cm, phần đuôi
nhọn và chẻ ra theo hình chữ V. Trọng lƣợng cơ thể đa dạng, tùy theo cá thể, nơi sống.
Trung bình từ 9 – 18g. Hiện các dữ liệu trên thế giới về trọng lƣợng của loài
Aerodramus fuciphagus chỉ nằm ở phân loài A. f. vestitus và A. f. fuciphagus, đối với
phân loài A. f. amechanus thì các thông tin về trọng lƣợng hầu nhƣ chƣa đƣợc nghiên
cứu (Nguyen và cs., 2002).
Hình 1.2: Chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus).
(Nguồn:
)
8
o
đến 115
o
Đông, chủ yếu
tập trung ở vùng Đông Nam Á, nhiều nhất ở Indonesia (Kalimantan, Sumatera, Java,
Bali ) tiếp đến là Thái Lan, Malaysia, Việt Nam… Ở Indonesia chủ yếu là phân loài
Aerodramus fuciphagus, ngoài ra còn có A. f. micans, A .f. vestitus. Thái Lan có cả
phân loài A. f. germani và loài Aerodramus maximus, đã đƣợc khai thác tổ để bán từ
thế kỉ 18. Malaysia có cả 2 phân loài A. f. amechanus và A. f. germani (phân bố ở vùng
Peninsula), và loài Aerodramus maximus. Philippines chỉ thấy phân loài A. f. germani.
Singapore: có phân loài A. f. germani nhƣng rất ít. Ngoài ra, Campuchia, Myanmar,
Lào, Brunei cũng thấy có phân bố loài yến Aerodramus fuciphagus. Ở Việt Nam theo
tài liệu của CITES cho biết có cả A. f. fuciphagus và A. f. germani (Nguyen và cs.,
2002).
1.1.4. Tập tính và hành vi của chim yến
Các nghiên cứu về hoạt động của chim yến Aerodramus fuciphagus cho thấy
chúng hoạt động chủ yếu vào ban ngày. Thời gian chúng rời hang và về hang trở lại
vào khoảng 12 tiếng (rời hang khoảng 5:28 – 5:36 sáng và về hang lúc 16:55 – 17:15
cùng ngày). Tuy nhiên thời gian này giao động tùy thuộc theo chu kì chiếu sáng và các
hoạt động của chim yến tại các thời điểm khác nhau (mùa sinh sản, thời điểm bình
thƣờng). Vào mùa sinh sản, chúng rời hang 1 lần/ngày khi ghép đôi và làm tổ, 2
10 lần/ngày khi vào thời kì đẻ và ấp trứng, 4 – 5 lần/ngày khi vào thời kì nuôi và chăm sóc
con (Đinh Thị Phƣơng Anh, 2011).
Các giác quan (mắt, mũi và tai) của chim yến rất tốt, do đó chúng có thể nhận
biết đƣợc kẻ thù và nguy hiểm ở môi trƣờng xung quanh. Hầu hết chim yến sống theo
bầy đàn, tuy nhiên cũng có một số cá thể thích sống đơn lẻ, những cá thể này thƣờng
khó khăn trong việc đƣa về nuôi tại nhà nuôi (Nguyen và cs., 2002; Nguyễn Quang


136mm, hầu hết
các phân loài
đều dài hơn
125mm)
146mm, hầu hết
các phân loài
đều dài hơn
123mm)
110 – 125mm)
Cổ chân
Phủ long
Không đƣợc phủ lông
Miệng
Sâu và cong
Cong nhẹ
Lông ở đỉnh đầu
Đen
Đen nhạt
Đuôi
Đuôi chẻ nhƣng
hơi nông
(khoảng 2 –
3mm)
Đuôi chẻ quan
sát rõ (khoảng 7
– 10mm)
Đuôi chẻ mức
vừa phải
(Khoảng 6 –

loài Aerodramus fuciphagus (Nguyen và cs., 2002).
1.1.6. Vấn đề bảo tồn đa dạng chim yến hiện nay
Theo Lim và Cranbrook (2002), hiện đang có hai luồng ý kiến trái ngƣợc nhau
trong việc bảo tồn các loài chim yến. Luồng ý kiến thứ nhất ủng hộ việc nuôi chim yến,
12 trong khi luồng ý kiến còn lại thì phản đối rất mạnh mẽ (Lim & Cranbrook, 2002).
Luồng ý kiến phản đối việc nuôi chim yến cho rằng, việc ủng hộ nuôi chim yến sẽ làm
mất đi ý thức bảo vệ đa dạng tự nhiên của con ngƣời đối với quần thể sinh vật tự nhiên
tại các khu vực đảo có chim yến sinh sống, trong khi việc bảo vệ này đặc biệt có ý
nghĩa đối với các khu vực đảo đá vôi ở Đông Nam Á, nơi đƣợc biết đến là đa dạng sinh
học về các loài thực vật, động vật, điển hình nhƣ sự có mặt của loài dơi Cheiromeles
torquatus (Clements và cs., 2006). Đối với luồng ý kiến ủng hộ việc nuôi chim yến, lý
do đƣợc đƣa ra là vì việc nuôi chim yến không hề loại bỏ tác động của con ngƣời đến
quần thể yến tự nhiên, ngƣợc lại còn thúc đẩy việc can thiệp vào bảo vệ chim yến trong
tự nhiên, vì khi đó quần thể chim yến trong tự nhiên sẽ chính là nguồn giống dự trữ cho
việc nuôi chim yến. Do đó sẽ luôn có một lƣợng lớn chim yến đƣợc duy trì, việc này
còn có ý nghĩa trong việc giảm thiểu nguy cơ giao phối cận huyết trong các quần thể
chim yến (Aowphol và cs., 2008).
Tuy nhiên, vấn đề hiện nay là cần phải có những nghiên cứu quan sát cụ thể đến
quần thể chim yến đảo để có thể đƣa ra những quyết định can thiệp cho phù hợp, nhất
là khi ngày càng có những nghiên cứu cho thấy sự sụt giảm về số lƣợng cũng nhƣ quần
thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus (Chantler & Driessens, 1995; Lau &
Melville, 1994; Lim & Cranbrook, 2002; Sankaran, 2001). Thêm nữa, những yếu tố
chƣa thể lƣờng trƣớc của nền kinh tế có thể ảnh hƣởng rất lớn đến việc nuôi chim yến.
Nếu vì một lý do nào đó, nghề nuôi chim yến thất bại thì hậu quả sẽ trút lên quần thể
chim yến nhà. Khi đó, áp lực sẽ đƣợc đặt lên quần thể chim yến trong tự nhiên. Thực tế
đã cho thấy khi đại dịch cúm gia cầm tái phát và xuất hiện ở chim yến, đã có hơn
10.000 cá thể chim yến nuôi trong nhà tại Ninh Thuận bị tiêu diệt để dập tắt dịch bệnh


Hình 1.4: Cấu tạo lông chim.
(Nguồn: )
Thành phần cấu tạo chủ yếu của lông là keratin. Xét theo chiều dài, lông là một
cấu trúc bị keratin hóa dần từ gốc đến ngọn. Càng xa khỏi gốc thì mức độ keratin hóa
càng mạnh, các tế bào bị mất dần DNA và trở thành một chuỗi protein ở phần ngọn. Ở
gốc lông còn chứa nhiều tế bào sống (Aowphol và cs., 2008).Đây cũng chính là yếu tố
quyết định trong quá trình tách chiết DNA từ lông chim. Phần gốc lông càng chứa
nhiều tế bào sống thì quá trình tách chiết càng dễ hơn.
Việc tách chiết DNA từ lông đã tạo điều kiện đơn giản hóa việc tách chiết DNA
từ gia cầm, đặc biệt là khi việc tách chiết DNA từ máu gặp nhiều khó khăn nhƣ phụ
thuộc vào kích thƣớc và tuổi của đối tƣợng lấy mẫu (Moiseyeva và cs., 2003).
1.2.2. Tổng quan về hệ gen ty thể (mtDNA)
Theo U.S. National Library of Medicine, ty thể là những cấu trúc bên trong tế
bào có nhiệm vụ chuyển đổi năng lƣợng từ thức ăn thành dạng năng lƣợng mà các tế
bào có thể sử dụng đƣợc. Mặc dù hầu hết DNA của cơ thể đều nằm trong các nhiễm
sắc thể trong nhân tế bào, ty thể cũng có một lƣợng nhỏ DNA của riêng mình. Vật liệu
15 di truyền này đƣợc biết đến nhƣ DNA ty thể (Mitochondrial DNA – mtDNA). Ở ngƣời,
mtDNA có khoảng 16.500bp đại diện cho một phần nhỏ của tổng số DNA trong các tế
bào (U.S. National Library of Medicine, 2012).
MtDNA của động vật có dạng vòng, nhỏ (kích thƣớc 15 – 20kb), bao gồm
khoảng 37 gen mã hóa cho 22 tRNA, 2 rRNA và 13 mRNA. Các mRNA chủ yếu mã
hóa cho các protein tham gia vào việc vận chuyển điện tử và phosphoryl oxi hóa của ty
thể. Hệ gen ty thể đƣợc sắp xếp trật tự một cách hiệu quả: không có các đoạn intron, có
các vùng đệm tại khung đọc hoặc trong một số trƣờng hợp có thể là chồng chéo lên
nhau. Vùng điều khiển chính là vùng không mã hõa, chịu trách nhiệm quy định chuỗi
nặng (H), chuỗi nhẹ (L) và sao chép nhân rộng chuỗi H (Kvist, 2000).

vị DNA polymerase γ của ty thể, các thành phần của RNA polymerase của ty thể, yếu
tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài
chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều đƣợc mã hóa bởi DNA nhân
(Sorenson & Fleischer, 1996).
Gen tRNA đƣợc xác định bởi một chuỗi amino acid. Bên ngoài vòng tròn đại
diện cho chuỗi nặng (H) và bên trong vòng tròn là chuỗi nhẹ (L). Chiều của quá trình
phiên mã và chuỗi sao chép đƣợc hiển thị với các đầu mũi tên. Khi không có đầu mũi
tên đƣợc đánh dấu, gen đƣợc phiên mã từ chuỗi nặng (H) theo chiều kim đồng hồ. Các
vùng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đƣợc đánh dấu bằng màu xám đen tối (hình 1.6)
(Desjardins & Morais, 1991; Mindell và cs., 1998).
Mặc dù tính năng của mtDNA đối với các loài động vật có xƣơng sống hầu nhƣ
là giống nhau, tuy nhiên mtDNA của gia cầm vẫn có một số khác biệt đáng chú ý:
- Hệ gen ty thể của gia cầm có sự khác biệt so với các loài động vật có vú và
lƣỡng cƣ. Gen ND5 (nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit
5) đƣợc theo sau bởi cytochrome b, tRNAThr và tRNAPro, ND6 và tRNAGlu
17 theo chiều 5’→ 3’ của chuỗi nhẹ (Desjardins & Morais, 1990, 1991; Quinn &
Wilson, 1993).
- Vùng sao chép của chuỗi nhẹ đƣợc tìm thấy giữa tRNACys và tRNAAsn ở một
vài loài động vật có xƣơng sống khác lại không xuất hiện ở hệ gen của gia cầm
(Desjardins & Morais, 1990).
- Gen COI (cytochrome oxidase I) xuất hiện một khởi đầu khác thƣờng: codon
GTG (thay vì ATG), ngoài ra còn có bằng chứng về một tỷ lệ thấp của thymine
tại những vị trí im lặng trong vùng mã hóa (Quinn, 1997).
- Nghiên cứu gần đây cũng đã tìm ra đƣợc một trật tự sắp xếp gen mới ở mtDNA
gia cầm (loài thuộc các bộ Picidae, Cuculidae, Passeriformes và Falconiformes).
Trật tự sắp xếp này có thể có nguồn gốc độc lập, vì nó đƣợc tìm thấy ở các đơn
vị phân loài khác nhau (Mindell và cs., 1998).