BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
oOo
NGUYỄN HỒ DUNG NGHI XÁC ĐỊNH SEROVAR VÀ MỐI QUAN HỆ
DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG XOẮN
KHUẨN LEPTOSPIRA PHÂN LẬP TỪ LN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị Phạm Trung Hiếu, Nguyễn Thị
Thắm, Lê Đình Hải, Phạm Duy Hưng trong Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân
viện Thú y miền Trung đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi hoàn thiện về một
số kỹ năng và thao tác trong phòng thí nghiệm và dành cho tôi những tình cảm
tốt đẹp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn Phan Thị Ngọc Ẩn, Nguyễn Thị Thu
Hằng đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Đặc biệt tôi xin chân thành
cảm ơn đến gia đình và các bạn sinh viên cùng lớp 51CNSH đã luôn ủng hộ,
động viên, giúp đỡ và đồng hành chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi trong suốt 4 năm
học và trong thời gian thực hiện đề tài này. Đấy thật sự là điều quý báu vô giá đối
với tôi.
Một lần nữa, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến tất cả.
Nha Trang, tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Hồ Dung Nghi
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LEPTOSPIRA 2
1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 3
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA 4
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo và hình thái. 4
1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy 5
1.2.3. Sức đề khángcủa Leptospira 5
2.4.3.2. Thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại gen 16s rRNA 21
2.4.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR 21
2.4.3.4. Thực hiện phản ứng PCR để giải trình tự gen 21
2.4.3.5. So sánh trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA 22
2.5. XỬ LÍ SỐ LIỆU 23
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SEROVAR CÁC CHỦNG LEPTOSPIRA 24
3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ 27
3.2.1. Kết quả phát hiện gen độc lực LipL32 27
3.2.2. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng
Leptospira phân lập từ lợn 29
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
4.1.KẾT LUẬN 34
4.2. KIẾN NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số serogroup Leptospira thường gặp của các loài Leptospira 7
Bảng 1.2. Một số serovar Leptospira thường gặp gây bệnh ở vật nuôi 8
Bảng 1.3. Các serovar Leptospira sử dụng chủ yếu trong chẩn đoán huyết thanh 10
Bảng 2.1. Kháng huyết thanh chuẩn kháng Leptospira dùng trong nghiên cứu 15
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 20
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR phát hiện gen LipL32 của Leptospira 20
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR 20
Bảng 2.5. Trình tự nucleotide của các cặp mồi dùng để giải trình tự
nucleotide trên gen 16s rRNA 21
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR để giải trình tự gen 22
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng PCR để giải trình tự gen 22
Bảng 2.8. Các chủng Leptospira tham chiếu từ ngân hàng gen 23
CSLD : Cơ Sở Dữ Liệu
EMJH : Ellinghausen, Mc Cullough, Johnson, Harris
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
IZSVe : Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
LPS : Lipopolysaccharide
MAT : Microscopic Agglutination Test
PCR: Polymerase Chain Reaction
1
LỜI MỞ ĐẦU
Ngành chăn nuôi là một trong những ngành đóng vai trò quan trọng đối
với một nước nông nghiệp như Việt Nam, đặc biệt là chăn nuôi gia súc. Ngành
chăn nuôi lợn với tổng đàn lợn đạt 27,8 triệu con, tổng lượng thịt cung cấp ước
tính đạt 3,2 triệu tấn (tính đến cuối năm 2011) [1], là nguồn cung cấp thịt chủ
yếu nhất cho thị trường cả nước.
Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn luôn phải đối mặt với nhiều khó khăn như
tình hình dịnh bệnh cũ và mới xảy ra quanh năm. Đặc biệt, bệnh Leptospirosis do
xoắn khuẩn Leptospira đã tồn mấy chục năm cho tới nay vẫn không kiểm soát
được các nguồn lây nhiễm, gây ra nhiều thiệt hại nặng nề do cơ chế gây bệnh và
sự phá hủy các tổ chức bên trong cơ thể của Leptospira đến nay vẫn chưa được
làm rõ. Bệnh với các triệu chứng lâm sàng như sốt, vàng da, viêm gan, thận, rối
loạn tiêu hóa, rối loạn sinh sản. Leptospira gây bệnh ở nhiều đối tượng gia súc,
vật nuôi, và kể cả con người với khả năng lây lan cao nên không chỉ gây thiệt hại
lớn cho ngành chăn nuôi mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Do đó, tiến
hành nghiên cứu về Leptospira là vô cùng cấp bách.
Mỗi loại gia súc đều có thể nhiễm một hay nhiều serovar xoắn khuẩn khác
nhau. Leptospira gây bệnh trên lợn có nhiều serovar, mỗi serovar có một đặc tính
riêng về tính kháng nguyên và hệ gen. Leptospira ở lợn khu trú một lượng lớn
trong thận và thải ra ngoài qua nước tiểu, đây là nguồn lây nhiễm nguy hiểm cho
người và vật nuôi. Việc xác định các serovar gây bệnh trên lợn từ mẫu thận và
tại Nhật là L. icterohaemorrhagiae [35]. Năm 1918 các nhà khoa học Nhật phân
lập được xoắn khuẩn gây bệnh “sốt mùa thu’’ ở lợn là L. autumnalis.
Các yếu tố độc lực của Leptospira cũng được nghiên cứu. Năm 1997
Merien và cộng sự đã chứng minh được yếu tố độc lực của Leptospira chi phối
khả năng xâm nhiễm vào tế bào Vero và khả năng tiêu diệt tế bào lạ của chúng.
Đến năm 2000, Merien phát hiện ra loại protein liên quan đến độc lực này và chỉ
được tìm thấy trên các chủng Leptospira có độc lực [32]. Năm 2006, Bulach phát
hiện enzyme sphingomyelinase quyết định khả năng gây dung huyết của
Leptospira ở nhiều serovar khác nhau [17][40].
3
Về mặt di truyền, Fukunaga xác định được genome của Leptospira có kích
thước khoảng 3,9 – 4,6 Mb, có 2 hệ gen là 16sRNA và 23SrRNA [15][23]. Một
số gen đã được dòng hóa và phân tích chức năng như gen quy định quá trình tổng
hợp acid amin, rRNA, protein ở ribosome, RNA-polymerase, DNA repair, heat
shock protein, shingomyelinase, hemolysins, protein màng ngoài, quá trình sinh
tổng hợp LPS [12][30]. Gen LipL32 qui định protein gây độc LipL32 đặc trưng
cho các Leptospira nhóm có độc lực [18].
Nghiên cứu về cây phát sinh loài trên 2 gen LipL32 và 16s RNA của
Leptospiracho thấy có sự tương đồng cao giữa 2 cây phát sinh loài, điều này chỉ
ra rằng các chủng Leptospira có sự khác biệt về trình tự gen là kết quả của trôi
dạt di truyền. [18]
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Tại Việt Nam, bệnh do Leptospira được Ragiot và Souchard phát hiện lần
đầu tiên trên người năm 1931 [2]. Nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai và Nguyễn
Ngọc Hải cho thấy chuột là nguồn lưu trữ và lây nhiễm tự nhiên Leptospira đối
với gia súc và con người [5][6]. Theo Vũ Đình Hưng, các loại gia súc nhiễm
Leptospira với tỉ lệ rất cao, ở trâu 35,1 %, ở lợn 22, 9%, ở chó 26,47 %, đặc biệt
với công nhân chăn nuôi tỉ lệ nhiễm lên đến 56% [11]. Nghiên cứu của Vũ Đình
Hưng cho thấy gia súc thường mắc bệnh vào mùa mưa từ tháng 4 - 9 chiếm tỉ lệ
26,7 % [10]. Theo Nguyễn Văn Bình, tỉ lệ nhiễm của trâu bò ở các khu vực nội,
động mạnh theo kiểu xoáy và bật thẳng lò xo do cấu tạo ở mỗi đầu có một nội
roi. Màng trong của Leptospira gồm cytoplasmic liên kết chặt chẽ với lớp vỏ
5
peptidoglycan và được bao phủ bởi lớp màng ngoài gồm protein, lipid và
Lipopolysaccharide (LPS) [24]. LPS tạo nên tính kháng nguyên chủ yếu của
Leptospira, có đặc tính miễn dịch và cấu trúc tương tự như LPS của các vi khuẩn
gram âm nhưng độc tính thấp hơn [30]. Ngoài ra, các loại protein cấu trúc và
protein chức năng cũng góp phần tạo nên lớp màng ngoài của Leptospira, chủ
yếu là các lipoprotein [26].
Leptospira không thể quan sát được khi nhộm Gram, chỉ có thể quan sát
được dưới kính hiển vi quang học nền đen, kính hiển vi quang học phản pha,
hoặc theo phương pháp nhuộm bạc cổ điển Warthin – Starry.
1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy tối ưu để Leptospira sinh trưởng: môi trường đặc hiệu,
hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ khoảng 28-30
o
C , pH từ 7,2 – 7,6. Trong điều kiện tối
ưu, thời gian thế hệ của Leptospira là 3 – 15 giờ nên thời gian nuôi cấy và phân
lập thường rất lâu, từ 2 – 30 ngày [21].
Môi trường nuôi cấy Leptospira bắt buộc phải có các chất dinh dưỡng sau:
acid béo mạch dài, vitamin B2, B12, muối amonium [21]. Môi trường đặc hiệu
cho Leptospira được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là EMJH (Ellinghausen, Mc
Cullough, Johnson, Harris) với thành phần chính là acid oleic, albumin huyết
thanh bò và polysorbate (Tween 80) [30]. Albumin huyết thanh bò có vai trò như
một chất giải độc và Tween 80 là nguồn cung cấp acid béo. Một vài chủng
Leptospira cần bổ sung pyruvate hoặc huyết thanh thỏ vào môi trường khi nuôi
cấy. Khi phân lập Leptospira từ mẫu bệnh phẩm, có thể bổ sung kháng sinh vào
môi trường như 5 – fluorouracil, gentamincin, nalidixic acid hoặc rifampicin [21].
1.2.3. Sức đề khángcủa Leptospira
Xoắn khuẩn là loài có sức chống chịu kém với các tác nhân môi trường
[43]. LPS có tính kháng nguyên rất mạnh và là kháng nguyên chủ yếu của
Leptospira.
Khả năng dung huyết của Leptospira có ở nhiều serovar khác nhau và có
ít nhất 7 gen sphA-like được phát hiện ở các chủng Leptospira có độc lực, bao
gồm cả gene sphH [17].
Lipoprotein bề mặt Loa22 cũng là một yếu tố độc lực quan trọng của
Leptospira, đóng vai trò chủ chốt trong cơ chế gâ
y bệnh của xoắn khuẩn này
[41].
Ngoài ra, gen hemO mã hóa cho enzyme gây độc cũng có vai trò trong quá
trình gây bệnh của Leptospira [33].
Protein bề mặt LipL32 là độc lực đặc trưng và mang tính kháng nguyên
của Leptospira, có khả năng bám lên lamini, collagen và fibronectin của vật chủ
và có tính bảo toàn cao ở các loài Leptospira gây bệnh [27] [28]. LipL32 có mặt
7
trong vật chủ suốt quá trình xâm nhiễm của Leptospira [18]. Cũng giống như
protein giải phóng bề mặt (Lig–protein có khả năng bám lên fibronectin của vật
chủ), LipL32 chỉ giải phóng mạnh trên bề mặt khi Leptospira nhân lên trong cơ
thể vật chủ, trên môi trường nuôi cấy nhân tạo LipL32 chỉ được giải phóng rất ít.
Do đó Leptospira thường mất khả năng gây bệnh mặc dù cấu trúc kháng nguyên
không thay đổi khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo [31] [34].
1.2.5. Các serovar Leptospira
Hiện nay đã phát hiện được trên 260 serovar khác nhau dựa vào cấu trúc
đặc hiệu của kháng nguyên LPS (Lipopolysaccharide) trên bề mặt tế bào và cấu
trúc di truyền của Leptospira [30].
Bảng 1.1. Một số serogroup thường gặp của các loài Leptospira [30]
STT Loài
Serogroup
1 L. interrogans
Icterohaemorrhagiae, Canicola, Ponoma, Australi
Icterohaemorrhagiae, Bataviae.
10 L. weilii
Celledoni, Icterohaemorrhagiae, Sarmin, Javanica, Mini,
Tarassovi, Hebdomadis, Pyrogenes, Manhao, Sejroe.
11 L. inadai
Lyme, Shermani, Icteroh
aemorrhagiae, Tarassovi, Tarassovi,
Manhao, Canicola, Panama, Javanica.
12 L. parva
Turneria
8
Các serovar gây bệnh thường mang tính đặc trưng loài như Canicola chủ
yếu gây bệnh ở chó, Bratislava ở ngựa và lợn, Hardjo ở bò, Australis và Pomona
ở lợn [14] [16] [19] [20] [25].
Bảng 1.2. Một số serovar thường gặp gây bệnh ở vật nuôi [12], [21],
[30], [39]
TT Vật nuôi Serovar
1 Bò
Hardjo, Pomona, Australis, Bratislava, Sejroe,
Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola
2 Lợn
Bratislava, Australis, Pomona, Grippotyphosa, Canicola,
Tarassovi, Icterohaemorrhagiae
3 Chó
Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Pomona,
Copenhageni
4 Ngựa
Bratislava, Pomona, Grippotyphosa,
Icterohaemorrhagiae, Hardjo
hủy cơ chất thành sản phẩm có màu, dùng phổ quang kế để định lượng phản ứng.
1.3.3. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFAT)
Là phản ứng dựa trên nguyên tắc kháng nguyên - kháng thể, trong đó
kháng nguyên hoặc kháng thể kháng Leptospira được nhuộm màu huỳnh quang
(thường dùng Fluorescein isothiocyanat) có màu xanh lục, Rodamin có màu đỏ
gạch. Kháng nguyên hoặc kháng thể chẩn đoán (nghi ngờ) được cố định trên
phiến kính, nhỏ kháng thể hoặc kháng nguyên đã nhuộm màu huỳnh quang lên,
nếu tương ứng sẽ có phản ứng gắn kết kháng nguyên – kháng thể, rửa không trôi,
soi kính hiển vi huỳnh quang thấy phát sáng. Ngược lại nếu không tương ứng khi
rửa sẽ bị trôi, soi kính không thấy phát sáng. Đây là phản ứng cho kết quả nhanh,
chính xác được dùng nhiều trong chẩn đoán huyết thanh.
1.3.4. Phản ứng vi ngưng kết (MAT)
Nguyên tắc của phản ứng MAT là sự liên kết trực tiếp giữa kháng thể
kháng Leptospira với kháng nguyên là các chủng Leptospira sống tạo nên các
ngưng kết có thể phát hiện được dưới kính hiển vi.
Kháng nguyên của Leptospira chủ yếu là các protein màng ngoài như LPS
và lipoprotein LipL32. Trong đó, các epitopes LPS là các kháng nguyên chính
kích hoạt đáp ứng miễn dịch. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho kháng nguyên
10
Leptospira phần lớn là kháng thể IgM và IgG [13]. Do đó các phương pháp huyết
thanh học thường sử dụng hai loại kháng thể này để chẩn đoán bệnh hoặc phát
hiện các serovar Leptospira.
Phản ứng MAT được sử dụng trong điều tra huyết thanh học toàn đàn,
kháng nguyên phải sống, không tự ngưng kết và có ít nhất từ 150 – 300
Leptospira trên một vi trường. Đối với chẩn đoán bệnh, huyết thanh chẩn đoán
được pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10 → 1/50 để thực hiện phản ứng MAT
định tính (tức là chỉ xác định xem trong huyết thanh có kháng thể Leptospira hay
không để loại bỏ những mẫu huyết thanh âm tính, chỉ giữ lại các mẫu huyết
thanh (+) để làm phản ứng MAT định lượng). Huyết thanh (+) được pha loãng,
sau đó chia ra các lỗ trên khay nhựa, số lỗ tương ứng với số Serovar đã có, nhỏ
nhóm chứng tỏ các chủng Leptospira trên lợn có quan hệ di truyền gần. Gen
LipL32 qui định tính độc lực của Leptospira và chỉ có ở nhóm có độc lực cao.
Dùng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu được thiết kế trên gen LipL32 để kiểm tra
các chủng Leptospira phân lập từ lợn thuộc nhóm nào. Nếu phản ứng dương tính
tức chủng Leptospira đó thuộc nhóm có độc lực, nếu phản ứng âm tính chủng đó
thuộc nhóm không có độc lực.
LipL32 có khối lượng 32kDa, là một trong những loại protein có nhiều
nhất trong Leptospira, có tính kháng nguyên mạnh [28]. LipL32 có là lipoprotein
có trong cấu trúc màng ngoài của Leptospira, có tính bảo tồn cao cả về mặt di
truyền lẫn miễn dịch [45], do đó chúng triển vọng cao trong ứng dụng sản xuất
vaccine. Vì các đặc tính trên, gen LipL32 mã hóa cho protein LipL32 là gen tiêu
biểu để chẩn đoán bệnh do Leptospira bằng phương pháp PCR .
Toàn bộ cấu trúc gen LipL32 đã được xác định, chúng có 816 base, mã
hóa cho 1 đoạn polypeptide gồm 272 acid amine, trong đó chứa 1 tín hiệu peptide
có 19 acid amine gắn với 1 tín hiệu lipoprotein chỉ vị trí phân cắt
peptidase[37][28].
Một nghiên cứu trên các trình tự gen của 6 chủng Leptospira gồm: L.
kirschneri serovar grippotyphosa chủng RM52, L. interrogans serovar lai,
L.interrogans serovar pomona chủng RZ11, L. noguchii serovar fortbragg chủng
12
Fort Bragg, L. borgpetersenii serovar hardjo dòng 203, và L. santarosai serovar
Tropica. So sánh các trình tự DNA LipL32 6 chủng Leptospira, cho thấy mức độ
bảo tồn gen giữa các chủng rất cao, với mức tương đồng trình tự DNA trung bình
là 96,4% (khoảng 93,5-99,6%). Hầu hết các trình tự sai khác đều là gen im lặng,
cho thấy có áp lực tiến hóa đã tác động lên hệ gen của Leptospira để duy trì
protein LipL32. So sánh trình tự acid amine của 6 LipL32 trên cho thấy tỉ lệ
tương đồng acid amin trung bình là 97,8% (khoảng 95,2 - 98,.6%). Sử dụng các
trình tự trên để thực hiện phân tích cây phát sinh loài. Kết quả cho thấy có sự
tương đồng cao giữa 2 cây phát sinh loài thực hiện trên gen LipL32 và 16s RNA
của Leptospira, điều này chỉ ra rằng các chủng Leptospira có sự khác biệt về
giữa chúng. Hệ gen bảo tồn 16s RNA mang tính đặc trưng cao của loài, thích hợp
là đối tượng phân tích để xác định mức độ quan hệ di truyền. Giải trình tự gen
16s RNA của các chủng, sau đó tiến hành xử lý, so sánh và phân tích các trình tự
này bằng phần mềm BioEdit để cho ra kết quả mức độ tương đồng. Mức độ
tương đồng cao cho thấy các chủng có mối quan hệ di truyền gần và ngược lại.
14
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thời gian nghiên cứu.
Đề tài được tiến hành từ ngày 25/2/2013 đến ngày 31/5/2013
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Nghiên cứu vi trùng – Phân viện thú y miền Trung, Nha Trang –
Khánh Hòa.
2.1.3 .Đối tượng nghiên cứu.
Các chủng Leptospira phân lập từ lợn.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác định serovar của các chủng xoắn khuẩn Leptospira
- Xác định một số đặc tính di truyền phân tử của các chủng xoắn khuẩn
Leptospira
+ Khả năng mang gen LipL32 mã hóa yếu tố độc lực Lipoprotein
+ Quan hệ di truyền của các chủng Leptospira
2.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.3.1. Hóa chất, sinh phẩm.
Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA: theo bộ Kit High pure PCR
template preparation do Roche (Đức) sản xuất.
o PBS
o Lysozyme
o Binding Buffer
o Nước
o GoTaq Green master mix (Promega, USA)
o Mồi xuôi và mồi ngược (IDT, USA)
o Đối chứng dương
o Đối chứng âm
o DNA Marker (100bp, Promega)
Hóa chất dùng cho điện di
o Đệm TBE 10X
o Agarose
o Thuốc nhuộm ethidium bromide
16
2.3.2. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Dùng cho phản ứng MAT
Micropipette các loại
Ống eppendorf các loại vô trùng
Đầu típ các loại vô trùng
Ống nghiệm 10ml vô trùng
Găng tay cao su
Multistepper
Đĩa nhựa 96 lỗ đáy chữ U
Nắp đậy đĩa 96 lỗ
Phiến kính
Tủ ấm Prolabo, Pháp
Kính hiển vi điện tử nền đen Trung Quốc
Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 Bio II A (Telstar Technologies)
Dùng cho phản ứng PCR và điện di
Đầu típ các loại vô trùng
Micropipette các loại vô trùng
Ống eppendorf các loại vô trùng
Găng tay chuyên dụng
Chuẩn bị đĩa 96 lỗ: đánh dấu số đĩa và sơ đồ mẫu
●
Cho 50µl huyết thanh có chứa kháng thể chuẩn vào lỗ đĩa tương ứng
với từng serovar
●
Cho 50µl mẫu kháng nguyên vào lỗ tương ứng với từng serovar
●
Đối chứng dương 100%: cho 50µl huyết thanh đối chứng dương vào lỗ
tương ứng với từng serovar.
●
Đối chứng dương 50%: cho 75µl huyết thanh đối chứng dương vào lỗ
tương ứng với từng serovar.
●
Đối chứng âm: cho 50µl nước muối sinh lý vào lỗ tương ứng với từng serovar.
●
Đậy nắp đĩa và ủ ấm 30
0
C ± 2
0
C trong vòng 2 giờ.
●
Đọc kết quả: lấy 5-10µl hỗn dịch kháng nguyên-huyết thanh nhỏ lên
kính và đọc kết quả ngưng kết dưới kính hiển vi nền đen với vật kính x10 và x30.
Mẫu huyết thanh được đánh giá dương tính khi có sự ngưng kết giữa kháng
nguyên - Kháng thể ở mức độ 50% trở lên, xem dưới kính hiển vi thấy hình
ngưng kết đám mây.
●
Lưu ý: Phản ứng có giá trị khi đối chứng âm không có hiện tượng
ngưng kết; Đối chứng dương 100% có mức ngưng kết ít nhất là 50% và đối
chứng dương 50% có 50% Leptospira bị ngưng kết.
o Chèn ống có lọc (ống nhỏ có lọc màu trắng) vào ống thu hoạch (ống lớn)
o Hút 500µl dung dịch mẫu cho vào ống lọc
o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút
Bước 6:
o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch
o Bổ sung 500µl Inhibitor removal buffer vào ống lọc
Copyright: Tài liệu đại học ©