ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
ĐOÀN NGỌC SƠN XÂY DỰNG HỆ THỐNG PCR ỨNG DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU CÁC CẢM BIẾN Y SINH MICRO-NANO
ĐOÀN NGỌC SƠN
XÂY DỰNG HỆ THỐNG PCR ỨNG DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU CÁC CẢM BIẾN Y SINH MICRO-NANO Chuyên ngành: Vật liệu và linh kiện Nanô
Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm
LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LIỆU VÀ LINH KIỆN NANÔ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THĂNG LONG
2.1. Kỹ thuật PCR 15
2.2. Hiệu ứng nhiệt điện 19
2.3. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của Pin Peltier 26
2.4. Các hình thức truyền nhiệt 30
2.5. Các phƣơng pháp điều khiển nhiệt độ 37
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM 40
3. 1. Thiết kế hệ thống 40
3.1.1. Sơ đồ khối của hệ thống 40
3.1.2. Khối điều khiển trung tâm 40
3.1.3. Khối đo đạc nhiệt độ 41
3.1.4. Khối điều khiển công suất 42
3.1.5. Khối truyền thông, phụ trợ khác 47
3.2. Xây dựng hệ thống 47
3.2.1. Xây dựng mạch điều khiển trung tâm 47
3.2.2. Xây dựng mạch đo đạc nhiệt độ 49
3.2.3. Xây dựng mạch điểu khiển công xuất TE 50
3.2.4. Xây dựng thử nghiệm kênh vi lƣu 51
3.3. Thử nghiệm hệ thống và kết quả 56
3.3.1. Khảo sát và hiệu chuẩn khối đo đạc nhiệt độ 56
3.3.2. Khảo sát và xây dựng thuật toán điều khiển PID 57
3.3.3. Khảo sát hệ thống với kênh vi lƣu 63
3.3.4. Khảo sát mẫu DNA trên hệ thống PCR 64
Chƣơng 4. KẾT LUẬN 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
IV
Hình 2.10. Các hình thức truyền nhiệt trong nhà dân dụng và công nghiệp 30
Hình 2.11. Dẫn nhiệt xảy ra trên vật liệu khi có chênh lệch nhiệt độ 31
Hình 2.12. Dẫn nhiệt trên tinh thể do lan truyền dao động nhiệt của các phân tử 32
Hình 2.13. Đáp ứng nhiệt tĩnh 38
Hình 3.1. Sơ đồ khối của hệ thống PCR 40
Hình 3.2. Sơ đồ chân của sensor nhiệt độ LM35 42
Hình 3.3. Thiết bị gia nhiệt TEC1-12706 và các thông số kĩ thuật 43
Hình 3.4. Bộ phận gia nhiệt của hệ thống PCR 44
Hình 3.5. Cấu tạo và kí hiệu của MOSFET kênh N và P 45
Hình 3.6. Cầu H sử dụng MOSFET kênh N và P 46
Hình 3.7. Sơ đồ mạch điện của IC điều khiển TE chuyên dụng của hãng TI 46
Hình 3.8. Nguồn chuyên dụng nuôi cho tất cả hệ thống PCR 47
Hình 3.9. Sơ đồ nguyên lí của mạch điều khiển trung tâm 48
Hình 3.10. Mạch điều khiển trung tâm 49
Hình 3.11. Sensor nhiệt độ được tích hợp vào kênh vi lưu PCR 49
Hình 3.12. Sơ đồ nguyên lí mạch cầu H sử dụng MOSFET 50
Hình 3.13. Mạch cầu H hoàn thiện 51
Hình 3.14. Thiết kế kênh dẫn vi lưu PCR bằng phần mềm đồ họa 53
Hình 3.15. Biểu đồ nhiệt độ và thời gian ép nhiệt tương ứng 54
Hình 3.16. Kênh vi lưu PCR được chế tạo hoàn thiện 55
Hình 3.17. Buồng gia nhiệt của hệ thống PCR 55
Hình 3.18. Đồ thị phụ thuộc của nhiệt độ và điện áp ra của sensor 56
Hình 3.19. Mô phỏng quá trình truyền nhiệt của hệ thống PCR 57
Hình 3.20. Đồ thị PV theo thời gian, ba giá trị K
p
(K
i
và K
d
là hằng số) 59
năm gần đây đang mang lại cho cuộc sống nhiều ―phép màu‖, những người bị bệnh
nan y đã có cơ hội chữa trị, các bệnh di truyền được phát hiện sớm, các ngành khoa
học liên quan cũng nở rộ: tách gen, nhận dạng vân tay DNA, xác định huyết thống…
Một trong những lĩnh vực y sinh đang được nghiên cứu nhiều nhất trong những
năm gần đây là chế tạo các cảm biến y sinh micro-nano kết hợp với kỹ thuật PCR.
PCR là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn DNA
trong ống nghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống.
Xây dựng được một hệ thống PCR hoàn thiện sẽ đem lại nhiều thuận lợi cho việc
nghiên cứu cũng như chế tạo các cảm biến y sinh tạo tiền đề tốt cho các nghiên cứu
khác. 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về công nghệ y sinh
Công nghệ Y - Sinh học (Biomedical Technology – Công nghệ y sinh) là một
lĩnh vực đa ngành, kết hợp những kiến thức khoa học về Kỹ thuật, Sinh học và Y học.
Đây là một ngành công nghệ có tiềm năng vô cùng lớn. Công nghệ y sinh ứng dụng
những kỹ thuật tiên tiến để phát triển các phương pháp nghiên cứu và chế tạo trang
thiết bị nhằm tìm hiểu các quá trình sinh học của con người và phục vụ an sinh cho
con người.
Công nghệ y sinh học cũng là một lĩnh vực liên ngành, ứng dụng các nguyên tắc
thiết kế, giải quyết vấn đề và kỹ thuật của các ngành như vật lý, toán học, tin học vào y
học và khoa học về sự sống để giúp cho vấn đề chăm sóc sức khỏe bệnh nhân được tốt
hơn cũng như tăng cường chất lượng sức khỏe con người.
Nhưng cũng do các môn khác nhau trong sinh học ngày càng đi sâu và mở rộng,
chúng tương tác và hỗ trợ nhau làm mất tính chất riêng biệt, sự hiểu biết của mỗi môn
đòi hỏi sự hiểu biết chung của cả các môn khác. Lấy ví dụ như sinh hóa học đã có một
thời là cơ sở cho mọi nghiên cứu sinh học, con người cũng như các sinh vật khác. Rồi
miễn dịch học đã thành một hướng tìm hiểu quan trọng về sự điều hòa đề kháng của cơ
thể sống đối với các tác nhân có hại cho sinh vật. Và gần đây nhất là sinh học phân tử
đi vào cấu trúc phân tử của sự sống đã trở thành một phần không thể thiếu được của
mọi ngành trong sinh học.
Như vậy, ngành y sinh học đã thành một ngành riêng có chỗ đứng rõ ràng trong
đào tạo cũng như trong lâm sàng không khác gì các ngành mà đối tượng là con người
bị bệnh như nội, ngoại, sản, nhi
Ngày xưa và cả hiện nay, ở một số nước chậm tiến, dù chưa có khái niệm đúng
đắn về ngành y sinh học, trong các bệnh viện vẫn có tổ chức một khoa xét nghiệm
gồm cả các phần về sinh hóa, huyết học, huyết thanh học, vi sinh, ký sinh trùng, nhưng
thường chúng hoạt động riêng rẽ, chủ yếu là thực hiện các kỹ thuật phát hiện theo yêu
cầu của thầy thuốc lâm sàng. Nói chung, những người làm ở bộ phận này chưa thấy
hết mối tương quan chặt chẽ giữa các môn với nhau, nhất là với lâm sàng.
Ngày nay, sự phát triển của mỗi môn không còn thể riêng biệt mà đòi hỏi một
hiểu biết chung hay một cái nền chung. 3
Hơn nữa, khoa học lâm sàng đã đạt đến một giai đoạn mà triệu chứng học đã
phát triển đến một giới hạn nếu không phải là nói quá, tột cùng rồi. Và chỉ có các môn
cơ sở mới có thể đem lại cho họ những hiểu biết, mới giúp họ thoát con đường kinh
nghiệm chủ nghĩa dẫm chân tại chỗ như y học cổ truyền đã phải trải qua. Không có
những phát minh mới của sinh học nói chung và y sinh học nói riêng thì họ không thể
nào biết được nguyên nhân gây bệnh cũng như cơ chế sinh lý bệnh sâu xa bên trong
cái biểu hiện bên ngoài mà người ta đã thấy hàng thế kỷ nay rồi.
4
Do đó mà xã hội cần ngành kỹ thuật y sinh bên cạnh các ngành khoa học thuần
tuý khác, như y học, vật lý , sinh học, …
Vậy kỹ thuật y sinh là một ngành khoa học lấy kỹ thuật làm phương tiện, sinh
học là cơ chế, còn y học là mục đích. Nghĩa là dùng các thiết bị kỹ thuật làm phương
tiện sinh ra các tác nhân tác dụng với tổ chức sống trong cơ thể. Từ đó hình thành các
hiệu ứng sinh học mà ta có thể định tính cũng như định lượng. Qua sự nghiên cứu này
giúp con người chúng ta có thể đánh giá cũng như thay đổi các trạng thái, chức năng,
cấu trúc trong cơ thể, nghĩa là chẩn đoán và điều trị bệnh.
Cho nên ―kỹ thuật y sinh được xem là bệ phóng cho các ngành kỹ thuật khác
xâm nhập sâu hơn vào các ứng dụng y sinh‖. Trước nhu cầu tất yếu của xã hội, một
ngành kỹ thuật mới, hiện đại đã ra đời. Đó là ngành kỹ thuật y sinh – Bio Medical
Engineering.
Đôi nét về những thành tựu nổi bật của công nghệ y sinh
Công nghệ Y - Sinh học là một lĩnh vực tương đối mới mẻ, đa phần các thành tựu
đạt được chỉ mới dừng ở mức độ nghiên cứu, bao phủ nhiều lĩnh vực khác nhau: tin
sinh học, chẩn đoán hình ảnh, xử lý hình ảnh, xử lý tính hiệu sinh lý học, cơ sinh học,
vật liệu sinh học với kỹ thuật sinh học, phân tích hệ thống, mô hình hóa 3 chiều
Ví dụ cụ thể về ứng dụng của kỹ thuật y sinh là việc phát triển và sản xuất các bộ
phận giả tương thích sinh học, thiết bị y học, thiết bị chẩn đoán và các thiết bị hình ảnh
như MRI và EEG, cũng như các loại thuốc.
Ngày nay, khi mà khoa học kỹ thuật phát triển vượt bậc thì nó đã gắn liền với đời
sống con người, hiện diện trong mọi lĩnh vực, với mục đích làm cho chất lượng cuộc
sống của con người ngày một nâng cao. Và y học không phải là một ngoại lệ.
Nếu một ngày bước chân vào một bệnh viện thì bạn sẽ thấy được sự phát triển
không ngờ của khoa học. Với những thiết bị kỹ thuật mà bạn có thể đọc thấy trong
1.2. Tổng quan về hệ thống PCR
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài
sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen".
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra
nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli
hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán
những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh ra, ông đã đoạt giải
Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông
đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên
nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.
DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng
nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ
sung.
Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực
hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở
96 °C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung
enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. 6 Hình 1.2. Các liên kết Hidrogen của hai sợi DNA bị phá vỡ ở nhiệt độ cao
Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian,
cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy
- Mặt phẳng của các bases nằm vuông góc với trục xoắn ốc, mặt phẳng của các
phân tử đường gần như thẳng đứng.
- Hai sợi của phân tử DNA được liên kết với nhau bởi các cầu nối hydrogen giữa
các bases: adenine-thymine; cytosine-guanine
2) Năm 1950's, Arthur Kornberg phân lập nghiên cứu enzyme DNA
polymerase từ E. coli (Pol I) và cơ chế sinh tổng hợp DNA (giải thưởng Nobel 1959).
- Tổng hợp DNA cần dNTPs.
- Muốn phát hiện được dNTPs đính vào phân tử DNA cần đánh dấu đồng vị
phóng xạ phân tử phosphate của dNTPs và kết tử DNA bằng tricloroacetic acid - TCA.
- Chọn E. coli làm đối tượng nghiên cứu vì vậy thu được một lượng lớn tế bào và
từ đó thu được một lượng lớn enzyme và nghiên cứu 1 enzyme quan trọng từ E. coli -
enzyme xúc tác sinh tổng hợp DNA - Ông đặt tên là DNA polymerase. Hiện nay là
DNA polymerase - chìa khóa mở đầu cho rất nhiều nghiên cứu sau này.
3) Năm 1969, Brock & Freeze: mô tả vi khuẩn thermus aquaticus chịu nhiệt.
4) Năm 1970, Klenow & Henningsen tạo ra mảnh Klenow bằng enzyme thủy
phân hoạt tính exonuclease đầu 5' của E. coli pol 1. 8
5) Ý tưởng của Cary Mullis và thí nghiệm của ông về phát minh PCR. (giải
thưởng Nobel năm 1993)
- Năm 1983, ông đã cân nhắc làm thế nào để sử dụng polymerase DNA với mồi
oligonucleotide để xác định một nucleotide được ở một vị trí nhất định trong một phân
tử DNA phức tạp, chẳng hạn như hệ gene của người. Trong ổ đĩa này ông đã phát
minh hay phát hiện ra phương pháp tạo bản sao DNA không giới hạn từ một bản sao
của DNA, và được gọi là phương pháp "phản ứng chuỗi polymerase (PCR)".
Sau công bố của Cary Mullis phải có những phát minh say đây thì chúng ta mới
có được PCR hoàn hảo như ngày nay:
- Năm 1984, ông đã tiến hành thí nghiệm đầu tiên thành công cùng với Klenow
Công nghệ vi lưu đòi hỏi sự kết hợp của các ngành Kỹ thuật, Vật lý, Hóa học,
Công nghệ vi chế tạo và Công nghệ sinh học. Công nghệ này đang từng bước trở thành
một công nghệ mũi nhọn cho phép chế tạo những vi hệ thống sử dụng vi thể tích chất
lỏng.
Những nghiên cứu trong công nghệ sinh học thường đòi hỏi một số lượng khá
lớn những trang thiết bị và phòng thí nghiệm, cụ thể là những phân tích DNA, những
nghiên cứu về các loại thuốc, những trang thiết bị thu thập thông tin về người bệnh
như film chụp X-quang, cắt lớp…
Hầu hết những quá trình nêu trên đều đòi hỏi phải khống chế và điều khiển được
dòng chảy của chất lỏng. Nhu cầu sử dụng thường xuyên và liên tục đòi hỏi những
thiết bị này phải nhỏ gọn, tiện dụng và có thế mang ra khỏi các phòng thí nghiệm.
Chính vì lẽ đó mà xu hướng ―càng nhỏ càng tốt‖ đang dần biến đổi ―thế giới lỏng‖
theo một cuộc cách mạng tương tự như cuộc cách mạng về công nghiệp điện tử khi
transistor ra đời.
Trên thực tế có rất nhiều những nghiên cứu, những ứng dụng trong công nghệ
sinh học cần phải thao tác với dòng chảy của chất lỏng trong những kênh dẫn rất nhỏ,
lĩnh vực này được gọi tên là vi lưu. Lĩnh vực này đòi hỏi sự nghiên cứu tổng hợp ba
vấn đề: nghiên cứu phương pháp mới nhằm chế tạo ra những hệ thống điều khiển chất
lỏng, nghiên cứu những phương pháp tích hợp những chức năng phức tạp của chất
lỏng vào trong một thiết bị, và nghiên cứu về cách thức, đặc điểm của chất lỏng khi nó
chảy trong những kênh dẫn siêu nhỏ.
Sự phát triển của công nghệ vi lưu đang góp phần tạo ra những phương pháp thí
nghiệm mới trong ngành sinh học cơ bản, ngành khoa học vật liệu và hóa lý.
Các hệ thống vi lưu gồm rất nhiều loại khác nhau tương ứng với nhiều ứng
dụng khác nhau như: những ứng dụng trong ngành công nghiệp in phun, trong pin
nhiên liệu lỏng, nghiên cứu hóa sinh, tổng hợp hóa chất, tách chiết DNA ra khỏi tế
bào, phân tích di truyền, phân tích PCR, bào chế thuốc.v.v…
Mọi hệ thống vi lưu đều được cấu thành từ những thành phần cơ bản như: máy
bơm, van, bộ trộn, bộ lọc, bộ chia… Trong ngành vi điện tử, kích thước của linh kiện
11
1.4. Tổng quan về hệ thống vi lƣu PCR
1.4.1. Hệ thống vi lƣu PCR
Việc thu nhỏ kích thước của sinh học và hóa học trong phân tích của các thiết bị
công nghệ vi-điện-cơ-hệ thống (MEMS) đã đặt ra một ảnh hưởng quan trọng trên các
lĩnh vực như chẩn đoán y tế, phát hiện vi sinh vật và sinh học phân tích khác.
Trong số rất nhiều các thiết bị thu nhỏ phân tích, các chuỗi phản ứng polymerase
vi mạch (PCR) / microdevices được nghiên cứu rộng rãi, và do đó sự tiến bộ lớn đã
được thực hiện trên các khía cạnh của vi gia trên chip (chế tạo, liên kết và đóng dấu),
lựa chọn vật liệu bề mặt, hóa học bề mặt và kiến trúc của buồng phản ứng, xử lý mẫu
chất lỏng cần thiết, kiểm soát của ba hoặc thermocycling nhiệt độ hai bước, phát hiện
các sản phẩm khuếch đại acid nucleic, tích hợp với các đơn vị phân tích chức năng
chẳng hạn như chuẩn bị mẫu, điện mao dẫn (CE), lai tạo DNA microarray, vv… Hình 1.5. Các thiết bị vi lưu trên chip cho hệ thống phân tích DNA
Trong đó bao gồm: (A) – phân loại, sàng lọc, phân tích các tế bài hoạt động
chống lại chất kích thích; (B) – ly giải tế bào; (C) – PCR và thu hồi DNA của kháng
thể đặc hiệu từ một ngăn riêng biệt.
Công nghệ vi lưu sẽ đại diện cho một công nghệ trung tâm trong nhiều hệ thống
thu nhỏ được sử dụng cho hóa học, sinh học và y tế ứng dụng, có tiến bộ hứa hẹn cách
mạng hóa nhiều quá trình phát hiện các mầm bệnh hoặc chất gây ô nhiễm môi trường.
Trong số các microfluidics, các dụng cụ PCR thu nhỏ (hay gọi là PCR
microfluidics) đã trở thành một công cụ rất quan trọng. Quá trình PCR được sử dụng 12
xác định, trên đó được gắn các mẫu dò DNA (probe) là các sợi đơn (single strand)
bằng các liên kết hoá học (cộng hóa trị) hoặc vật lý (hấp phụ, đơn phân tự lắp ráp -
Self Asembly Monolayer - SAM). Đây là phần thụ thể sinh học của chip DNA (còn
được gọi là DNA probe arrays).
Các mẫu dò DNA
Gene hoặc một trình tự xác định ngắn và với số lượng từ hàng trăm đến hàng
nghìn tùy thuộc vào mục đích sử dụng của chip và là thông số quyết định độ phức tạp
(complexity) của chip.
Nguyên lý hoạt động
Dựa trên khả năng nhận dạng (sensing) chọn lọc và tức thời các DNA đích
(target) khi các DNA mẫu dò và đích kết hợp với nhau tạo thành sợi kép nhờ sự ghép
cặp bổ sung giữa các base A, T, G, C trong quá trình lai phân tử:
– A-T và G-C.
– Nếu phân tử DNA đích liên kết với mẫu dò có trình tự là ATCGGC thì có thể
suy ra trình tự bổ sung của phân tử DNA đích này.
– RNA cũng tuân theo nguyên tắc ghép cặp base nghiêm ngặt khi kết hợp với
DNA.
– Do vậy rất dễ dàng suy luận trình tự của bất kỳ sợi RNA nào bắt cặp với DNA
trên microarray.
Ư
Ư
u
uđ
đ
i
i
ể
protein tạo cơ sở để gắn đặc hiệu vị trí với poly ethylene glycol. Các đuôi khác như
protein đặc hiệu biotin cũng đã đợc sử dụng để lai và cho kết quả tốt.
• Đối với các protein không tái tổ hợp, các phương pháp khác để lai có định
hướng dựa trên các nhóm chức năng sẵn có trong protein. Đại đa số phương pháp
được xây dựng cho các kháng thể đơn dòng và được thiết kế nhằm đảm bảo các vị trí
đặc hiệu kháng nguyên của kháng thể hướng ra khỏi bề mặt chip.
Ứng dụng của Biochip
Các lĩnh vực chính sử dụng công nghệ chip DNA là nghiên cứu kiểu gen, phát
hiện đa hình nucleotide đơn, phân tích sự biểu hiện gen, đột biến… Chip DNA được
ứng dụng trực tiếp trong các ngành y - dược để tìm kiếm dược phẩm, xác định độ an
toàn của thực phẩm & môi trường, trong quân sự để phát hiện vũ khí sinh học…
Hướng ứng dụng về kiểu gen: Kỹ thuật MicroArray có thể cho biết, nguyên nhân
lây nhiễm chính xác của bệnh nhân có triệu chứng giống cúm (như đau đầu, sốt cao và
khó thở). Bề mặt của MicroArray có thể được gắn các DNA đại diện cho các gen chỉ
xuất hiện trong những tác nhân gây bệnh chọn lọc và phòng thí nghiệm y học có thể
tách chiết và đánh dấu DNA từ mẫu mô lây nhiễm (ví dụ, từ dịch mũi của bệnh nhân).
Sự kết hợp giữa DNA của bệnh nhân với một số trình tự gen trên chip có thể cho biết
đâu là tác nhân gây bệnh. Tương tự, hiện nay nhiều chip đang được thiết kế nhằm xác
định các loại vi khuẩn than đặc biệt dùng trong khủng bố sinh học hay các mầm bệnh
khác xâm nhập vào cộng đồng.
Nghiên cứu sự biểu hiện gene: trên cơ sở xác định lượng mRNA có trong mẫu
mô. Các chip xác định trực tiếp lượng protein mặc dù rất phức tạp cũng đang được
nghiên cứu thiết kế. Các nhà sinh học tế bào thường sử dụng loại array này để thu thập
các thông tin về những protein chiếm ưu thế sau khi mô chịu tác động bởi những điều
kiện khác nhau. 15
Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR
cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một
lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng
2500 USD.
Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là những đoạn
ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường
là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của
sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một cách chính xác ở điểm
bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những
điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp
của sợi DNA mới.
Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm lẫn với nhiệt độ biến tính của DNA
trong chu kỳ đầu tiên của quá trình PCR—được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi
bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu.
Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi quá ngắn sẽ bám nhiều
vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài DNA bị
giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80 °C sẽ
gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt
nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75 °C.
Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng được sử dụng. Những đoạn mồi
này là hỗn hợp tương tự nhưng không giống hoàn toàn. Nó có thể thuận tiện nếu có
cùng gen cần khuếch đại từ những sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó có thể là
tương tự nhưng không giống nhau.
Người ta còn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồi được thiết kế dựa trên
chuỗi protein. Như nhiều codon có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thường rất khó để
suy ra codon nào dùng cho trường hợp đặc biệt. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit
amin isoleucine có thể là ―ATH‖, A có nghĩa là adenine, T là thymine, và H ứng với
adenine, thymine, hay cytosine. (Xem mã di truyền để hiểu them về codons) Sử dụng
đoạn mồi đã thoái hóa có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấn
đề có thể được giải quyết bằng phương pháp touchdown PCR.
18 Hình 2.2. Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ.
(1) Nóng chảy ở 96°C.
(2) Gắn mồi ở 68°C.
(3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase).
(4) Chu trình đầu tiên hoàn thành. Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu
trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ.
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí
nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA, ).
Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có
phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một khu vực riêng biệt. Ở giai
đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử
dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet. Thuốc thử dùng
trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này.
Copyright: Tài liệu đại học ©