TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

DIỆP THỊ DIỆU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75)
TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy – Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học

1,5 mM, nồng độ dNTPs là 200µM, nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 20 pmol,
nồng độ taq ADN polymerase là 2 U, nồng độ ADN chiết tách 1 µl. Tổng thể tích
cho mỗi phản ứng là 25 µl, (ii) điều kiện phản ứng được thực hiện theo chu kỳ
nhiệt là: máy được làm nóng đến 85
o
C. Sau đó đến giai đoạn 94
o
C trong 3 phút,
94
o
C trong 30 giây, 49
o
C trong 30 giây, 72
o
C trong 60 giây lặp lại 30 chu kỳ và
cuối cùng là 72
o
C trong 7 phút. Tổng thời gian khuếch đại khoảng 1giờ 20 phút.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

4.1. Ứng dụng qui trình PCR genotyping (ORF75) 22
4.2 Chu kỳ nhiệt 23
4.2.1 Chu kỳ phản ứng 23
4.2.2 Nhiệt độ gắn mồi 24
4.3 Hàm lượng ADN khuôn 25
4.4. Nồng độ mồi 25
4.5 Nồng độ MgCl
2
26
4.6. Nồng độ taq ADN polymerase 27
4.7 Điều kiện phản ứng 28
4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau khi đã tối ưu 29
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề xuất 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC 38

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 : Quá trình bộc phát bệnh đốm trắng ở châu Á và châu Mỹ (Escobedo-
Bonilla C. M. et al.,2008) 9
Bảng 4.1 Cường độ nhiễm WSSV của các mẫu tôm dùng trong nghiên cứu 21
Bảng 4.2 : Thành phần hóa chất được sử dụng để ứng dụng 30
Phụ lục 1: Thành phần hóa chât của phản ứng PCR genotyping (ORF75) trước
khi tối ưu 38
Phụ lục 2: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu
nồng độ taq 38

khác nhau 24
Hình 4.4: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ mồi 28
Hình 4.5: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ MgCl
2
27
Hình 4.6: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ taq ADN
polymerase 28
Hình 4.7: kết quả ba mẫu có cường độ nhiễm khác nhau 29
Hình 4.8: Kết quả ứng dụng 8 mẫu nhiễm WSSV thu ở Cà Mau 31
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU

Việt Nam là một nước có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển thủy
sản. Ngành thuỷ sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia.
Trong những năm gần đây phong trào nuôi tôm ở Việt Nam đã đạt những thành
tựu khả quan. Tuy nhiên, song song với việc tăng diện tích nuôi, tăng sản lượng,
tăng mức độ thâm canh thì bệnh dịch thủy sản là một mối nguy lớn đối với nghề
nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh do virus gây ra đã làm sản lượng tôm giảm
một cách đáng kể.
Với khả năng lan truyền bệnh và gây chết tôm hàng loạt, bệnh virus đã gây thiệt
hại lớn và ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của nhiều quốc gia có nghề nuôi
tôm phát triển. Đặc biệt là bệnh đốm trắng (White spot disease-WSD), bệnh đầu
vàng (Yellow head disease - YHD), bệnh đỏ đuôi (do Taura syndrome virus-
TSV)…. Vì hiện nay bệnh virus trên tôm chưa có thuốc đặc trị, nên công tác
phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết. Các phương pháp chẩn

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới
2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
Hiện nay, nghề nuôi tôm biển đã và đang giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế
của nhiều nước trên thế giới. Từ những năm 1980 với sự phát triển mạnh mẽ của
nghề nuôi tôm biển cả về qui mô và mức độ thâm canh đã làm cho sản lượng tôm
tăng vọt. Trong giai đoạn 2000-2003, sản lượng nuôi trồng thủy sản của châu Á
hiện chiếm tới 90% về sản lượng và 80% về giá trị nuôi trồng thủy sản của thế
giới.
Theo thống kê của FAO (2004), hàng năm tỉ lệ tăng trung bình của nuôi trồng
thủy sản tính từ năm 1970 đến năm 2002 là 8,9 %. Sản lượng nuôi trồng thủy sản

Sản số 4/2005).
Ở khu vực Đông Nam Á - bệnh đốm trắng được xem là nguy hiểm nhất đối với
tôm nuôi. Mọi nghiên cứu đều tập trung ngăn ngừa sự lây nhiễm và bùng nổ bệnh
đốm trắng ở các ao nuôi. Virus đốm trắng có thể nhiễm vào tôm nuôi từ giai đoạn
ấu trùng. Vì vậy, các biện pháp chọn lựa con giống tốt không mang mầm bệnh là
một trong những biện pháp góp phần làm hạn chế dịch bệnh (Nguyễn Văn Hảo,
2004).
2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta
2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Việt Nam là một nước có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi trồng thuỷ sản ở
khắp mọi miền đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt. Theo
điều tra sơ bộ của tổng cục thống kê năm 2007 tổng diện tích mặt nước nuôi trồng
thủy sản cả nước là 1008 nghìn ha trong đó diện tích nuôi tôm chiếm 625,6 nghìn
ha. Tôm luôn là đối tượng nuôi chủ lực của Việt Nam do giá trị xuất khẩu của
chúng cao. Diện tích nuôi tôm ngày càng tăng qua các năm, diện tích tôm nuôi
trong năm 2007 tăng gấp 2 lần so với măn 2000. Sự gia tăng diện tích nuôi được
biểu hiện qua hình 2.1 (số liệu của tổng cục thống kê, 2007)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5

0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
700.0
20002001200220032004200520062007
Năm

Trong những năm qua từ 1990- 2007, sản lượng tôm nuôi của nước ta tăng một
cách đáng kể. Tuy nhiên do sự phát triển quá ồ ạt của nghề nuôi tôm ven biển còn
dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, gây thiệt hại không nhỏ cho người
dân cũng như các ngành kinh tế liên quan. Vào giữa năm 1994, bệnh tôm xảy ra
rộng khắp các tỉnh phía Nam đã gây thiệt hại lớn về kinh tế và ảnh hưởng sâu
rộng về xã hội ở những nơi có bệnh (
Object=101262&news_ID=261151456).
Theo ước tính của Bộ Thuỷ sản (1996), dịch bệnh tôm ở các tỉnh ĐBSCL trong
các năm 1994-1995 đã ảnh hưởng tới 85.000 ha và gây thiệt hại 294 tỉ đồng. Và
trong các năm 2001, 2002 dịch bệnh tôm tiếp tục đe doạ và gây ảnh hưởng lớn ở
khu vực ĐBSCL. Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành:
cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm
nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên
Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị
chết trong cả nước. Nguy hiểm nhất là bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh
MBV, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh
phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Bệnh thường lan truyền từ mẹ sang con, lây lan
từ nơi này sang nơi khác, lây nhiễm từ nguồn tôm giống chưa sạch bệnh (thông
tin chuyên đề Bộ Thủy Sản 2/2005).
Bệnh do virus gây ra trên tôm đang là một thảm họa cho nền sản xuất nuôi trồng
thủy sản cho Việt Nam và thế giới. Hiện tại các loại virus gây bệnh trên tôm sú
đang phổ biến tại Việt Nam là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV – White
spot syndrome virus), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô
(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus -IHHNV), virus gây
còi (Monodon baculovirus- MBV), virus gây đầu vàng (Yellow head virus -
YHV ), …Trong đó, WSSV gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản
lượng tôm của khu vực (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Các tỉnh ở Bắc Trung Bộ
(2004) như Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh; Nghệ An có 9,1-
47,8% diện tích nuôi tôm bị bệnh đốm trắng; 25,6 - 30,4% bị bệnh MBV; 25-
54,5% bị bệnh đầu vàng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha

không nuôi mật độ quá dày, chọn mùa vụ nuôi thích hợp, không thả tôm nuôi khi
nhiệt độ thấp, thời tiết có nhiều biến động, ao nuôi phải được rào lưới xung quanh
để ngăn chặn cua còng mang mầm bệnh vào ao, phải có ao lắng xử lý nước trước
khi cấp vào ao nuôi, sử dụng hoàn toàn bằng thức ăn công nghiệp, tốt nhất không
nên sử dụng thức ăn tươi sống vì mầm bệnh dễ lây lan, tránh gây sốc cho tôm
(Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
2.3. Sơ lược về bệnh đốm trắng
Trong những năm 90 sản lượng nuôi tôm trên thế giới tăng chậm. Nguyên nhân
chủ yếu dẫn đến sự suy giảm này là do virus gây ra (Lotz, 1997). Những tác nhân
gây bệnh như vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng có thể dùng kháng sinh hoặc vacxin
để trị, còn tác nhân gây bệnh là virus thì không thể dùng cách như vậy để trị
(Teunissen et al., 1998). Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm nhất
đối với tôm nuôi hiện nay (Rosenberry, 2004 ).
Năm 1992, WSSV lần đầu tiên xuất hiện ở Đài Loan và gây thiệt hại lớn cho tôm
nuôi ở miền Bắc Đài Loan. Và bệnh đốm trắng nhanh chóng lây lan sang nhiều
nước ở Đông Nam Á. Cuối năm 1993 virus này được tìm thấy ở Nhật Bản và
trong những năm gây đây virus này nó đã xuất hiện và gây thiệt hại lớn cho nghề
nuôi tôm ở nhiều nước trên thế giới. Lúc đầu bệnh đốm trắng chỉ xuất hiện ở châu
Á nhưng cho đến tháng 11-1995 người ta đã phát hiện ra bệnh đốm trắng ở Mỹ
(Texas và South-Carolina) và nó đã gây chết hàng loạt tôm nuôi ở đây. Đầu năm
1999 nó đã được tìm thấy ở Nam Mỹ, và nó đã gây ra thiệt hại lớn cho các trang
trại nuôi tôm ở Nam Mỹ. Cuối năm 1999 bệnh đốm trắng xuất hiện ở Ecuador
(van Hulten ,2001). Đến năm 2002, bệnh đốm trắng được báo cáo là phát hiện
trên các loài giáp xác ngoài tự nhiên ở châu Âu (Pháp) và vùng Trung Đông
(Iran) (Rosebery, 2002 trích dẫn bởi Marks et al., 2005). WSSV xuất hiện ở nhiều
vùng khác nhau và với nhiều tên gọi khác nhau như hypodermal and
haematopoietic necrosis baculovirus (HHNBV) (Durand , 1997), third Penaeus
monodon non-occluded baculovirus (PmNOB III) (Wang , 1995), rod-

Durand et al. 1996;
Kasornchandra et al. 1998;
Rajan et al. 2000
1997 Việt Nam Bondad-Reantaso 2001
1998 Pe-ru Rosenberry 2001
1999
Philippin, Ecuador, Colombia,
Panama´ ,Honduras, Nicaragua,
Guatemala, Belice
Magbanua , 2 000; Bondad-
Reantaso et al. 2001; Hossain et
al. 2001; Wu et al. 2001
1999 -
2000
Mehico Bondad-Reantaso et al, 2001
2002 Pháp, Iran Dieu et al. 2004; Marks 2005
2005 Brazil APHIS-USDA 2005
2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV
WSSV có dạng hình trứng, có đuôi, acid nhân là ADN 2 mạch, không có thể ẩn,
chỉ có thể vùi trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày và tế bào biểu bì
dưới vỏ, cơ quan lympho (trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Trong hệ gen
của WSSV có A và T chiếm 59% (Escobedo-Bonilla et al., 2008), WSSV có kích
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
thước khá lớn đường kính khoảng 65-70 nm và dài 300 -350 nm (van Hulten el
al.; 2001).
WSSV là một trong những virus có hệ gen lớn nhất được phát hiện (khoảng
300kb). Kích cỡ hệ gen của WSSV khác nhau tùy theo từng vùng khác nhau,
virus được phân lập ở Thái Lan (WSSV- TH) là 292.967 bp (van Hulten et al.,
2001). Còn hệ gen của WSSV được phân lập từ Đài Loan (WSSV-TW) kích

(Lightner, 1996).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11 2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm
Virus này gây bệnh trên nhiều đối tượng tôm nuôi như F. setiferus and L.
vannamei (ở Mỹ), F. Chinensis và M. japonicus (Trung Quốc), P. monodon
(Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Đài Loan), M. japonicus (Nhật Bản). Ngoài ra,
WSSV còn có thể ký sinh trên các loài giáp xác khác ở vùng nước ngọt, nước lợ,
vùng nước mặn như cua biển và tôm hùm. Tuy nhiên WSSV không gây chết cho
những loài này mà những loài này chỉ là vật mang mầm bệnh (Lo et al., 1996).
WSSV không những gây bệnh cho các loài tôm nuôi mà còn gây bệnh cho các
loài tôm ngoài tự nhiên. Vì vậy cần phải có nhiều biện pháp để phòng bệnh hợp lý.
Virus này gây bệnh trên tất cả các giai đoạn tôm nuôi từ giai đoạn trứng cho đến
giai đoạn bố mẹ. Tuy nhiên bệnh thường gặp nhất là ở giai đoạn hậu ấu trùng, tiền
trưởng thành và trưởng thành. Và tỉ lệ chết cao nhất là khi tôm nuôi 1-2 tháng.
Bệnh thường xuất hiện khi tôm bị sốc (chẳng hạn như khi nồng độ muối thay đổi
đột ngột hoặc nhiệt độ nước xuống thấp dưới 30
0
C thì bệnh sẽ bệnh bộc phát
nhanh chóng) (Jiravanichpaisal , 2004)
2.3.4 Phương thức lây nhiễm
WSSV có thể lây theo chiều dọc và chiều ngang. Lây nhiễm theo chiều ngang chủ
yếu là do ăn thịt lẫn nhau (tôm khỏe ăn thịt tôm bệnh, hoặc ăn các thức ăn bị
nhiễm WSSV), hoặc lây nhiễm theo nguồn nước (Chou et al., 1998).
Theo Bùi Quang Tề (2006) bệnh đốm trắng lây truyền theo phương ngang là chủ
yếu. Virus này chủ yếu lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh
đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay bên trong ao nuôi tôm. Những
con tôm khỏe ăn những con tôm bị bệnh đốm trắng chết bị làm cho bệnh lây lan

Loan và Trung Quốc cho thấy sự tương đồng của 3 dòng WSSV là 99,32% và xác
định được một số vùng có trình tự lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125. Đây
là một trong những ORFs được sử dụng để phân tích sự khác nhau và các dòng
đặc trưng của WSSV (Pradeep et al., 2007).
ORF75 ở tất cả những WSSV được phân lập thì vùng ORF75 có 2 loại trình tự
lặp lại (repeat units- RUs), với kích cỡ là 102bp và 45bp. Trong đó, 45 nucleotide
đầu tiên của trình tự lặp lại 102 bp giống với trình tự lặp lại 45bp. Đối với ORF94
vùng lặp lại có kích thước là 54 bp, vùng lặp lại thuộc ORF125 có kích thước là
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
69 bp (Bui Thi Minh Dieu , 2004). ORF75 và ORF94 đều mã hóa cho đoạn
protein chỉ hiện diện trong virion của WSSV, vùng lặp lại của 2 ORFs này mã
hóa cho đọan protein có trình tự như sau: đầu tiên là arginine hoặc lysine, tiếp
theo là 2 alanine, đến 2 hoặc 3 proline sau đó là một dãy các acid amimo acid
(aspartate, glutamate) (Bui Thi Minh Dieu , 2004). Còn ORF125 có trình tự lặp
lại là 69 bp (Bui Thi Minh Dieu , 2004).
Ở Thái Lan Wongteerasupaya et al (2003) đã phân tích 65 mẫu tôm từ 55 ao để
xác định số lần lặp lại của trình tự lặp lại thuộc ORF94. Nghiên cứu đã phát hiện
như sau: trình tự lặp lại thuộc ORF94 có số lần lặp lại nằm trong khoảng 6 đến 20,
trong đó các mẫu có 8 vùng lặp lại chiếm đa số (32%).
Ở Việt Nam vào năm 2004, Bui Thi Minh Dieu et al cũng nghiên cứu về vùng lặp
lại thuộc ORF94 (6 ao ở miền Trung, 2 ao ở miền Nam). Kết quả được ghi nhận
như sau: số vùng lặp lại thuộc ORF94 của tôm bị bệnh đốm trắng ở Việt Nam
nằm trong khoảng 7 đến 17 vùng. Tiếp theo, năm 2006 Lê Vân Hải Yến đã khảo
sát vùng lặp lại thuộc ORF94 ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu
đã xác định ở Trà Vinh số vùng lặp lại thuộc ORF94 chỉ có 3 nhóm là: 5, 8, 9 còn
ở Sóc Trăng thì có số vùng lặp lại thuộc ORF94 là 5, 7, 8, 12. Trong đó các mẫu
có 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất (50% ở Sóc Trăng và 57,1% ở Trà Vinh).
Kế tiếp là nhóm tác giả Trần Thị Tuyết Hoa đã khảo sát 169 mẫu tôm bệnh đốm
trắng thu từ 19 ao ở Cà Mau, Bạc Liêu đã ghi nhận: ở ao nuôi tôm Bạc Liêu số

trên một ORF thì có số lần lặp lại không giống nhau trên một hoặc cả hai ORF
khác.
Từ những kết quả trên cho thấy cả 3 ORFs trên đều có ý nghĩa quan trọng trong
nghiên cứu dịch tể học của virus đốm trắng. Trong 3 ORFs trên thì ORF94 có vai
trò lớn nhất trong nghiên cứu dịch tể học, tiếp theo là ORF125 và ORF75
(Pradeep B, 2007).
2.4. Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự
(Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các
nhà nghiên cứu sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền trên toàn thế giới (Phạm
Thành Hổ, 2003).
Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng
hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi,
là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch
khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN
polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Một phản ứng PCR là một
chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước, mỗi bước kéo dài
khoảng vài chục giây đến vài phút, trình tự như sau :
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15

Bước 1: Biến tính (denaturation) nhiệt độ được nâng lên khoảng 94
0
C để làm biến
tính ADN từ dạng sợi đôi (dsADN) thành sợi đơn (ssADN).
Bước 2: Bắt cặp (anealing) trong bước này nhiệt độ trong buồng PCR hạ xuống
nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi, các đoạn mồi (primer) bắt cặp
theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích, đây là giai đoạn
quyết định nên tính đặc hiệu của sản phẩm PCR.

tối ưu phụ thuộc vào loại ADN polymerase,
ADN khuôn và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã có sẵn 1 lượng
nhất định ion Mg
2+
).
Nồng độ dNTPs: Lượng dNTPs thường được sử dung ở nồng độ 20- 200 µM của
mỗi loại dNTPs. Nếu mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ dẫn tới lỗi sao
chép của ADN polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Việc tăng dNTPs
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố
khác.
Mồi (Primer): Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại của một
đoạn ADN đặc trưng. Mồi luôn luôn gắn với ADN khuôn ở đầu 3’ và ADN
polymerase kéo dài tổng hợp theo chiều 5’- 3’. Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và
nồng độ trong phản ứng PCR là nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng
PCR. Khi chọn mồi cần tính toán đảm bảo Tm của mồi xuôi và mồi ngược không
chênh lệch nhau quá lớn. Trình tự ADN cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai
mồi không nên quá 1 kb. (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Chu kỳ phản ứng: trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40
chu kỳ cho một phản ứng. Vì phản ứng PCR diễn ra 2 giai đoạn. Giai đoạn đầu số
lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu. Sau đó hiệu quả
khuếch đại giảm do các nguyên nhân sau: (i) hoạt tính của enzyme polymerase
giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao. (ii) Sự cạn kiệt của các thành phần phản ứng.
(iii) Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau. (iv)
Sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
2.4.3 Ứng dụng của PCR
Phương pháp PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: kiểm tra huyết thống,
chẩn đoán bệnh di truyền, tách dòng gen, gây đột biến điểm, phân tích mẫu DNA

– Dụng cụ chiết tách: que nghiền, đầu col (xanh, vàng), pipet (1000µl, 200µl),
ống eppendorf, máy vortex, máy ly tâm, máy ủ, tủ hút…
– Dụng cụ khuếch đại: đầu col (xanh, vàng), pipet, ống eppendorf, tủ hút, máy
ly tâm, máy vortex, máy PCR…
– Dụng cụ điện di: đầu col vàng, pipet, lò vi sóng, bồn điện di, máy chụp hình
gel… PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
18
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Qui trình phát hiện WSSV: thực hiện theo qui trình hướng dẫn của công
ty Farming IntelliGene Technology Corporation, Đài Loan (kit IQ2000- WSSV)
Ly trích ADN: ADN được ly trích từ mang tôm sú với bộ chiết tách là DTAB –
CTAB.
– Chuẩn bị mẫu: cho khoảng 20mg mang tôm vào ống eppendorf (1,5ml) chứa
600µl dung dịch DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền tiệt trùng.
– Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 75
0
C trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
– Lắc đều mẫu, ly tâm nhẹ, sau đó thêm 700µl chloroform, lắc đều 20 giây nữa
và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
– Chuyển phần dung dịch ở trên sang ống eppendorf 1,5ml mới, thêm 100µl
dung dịch CTAB và 900µl nước cất, lắc đều, sau đó ủ ở 75
0
C trong 5 phút.
– Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
– Cẩn thận rút bỏ phần dung dịch trong ở trên, hòa tan phần còn lại bằng 150 µl
dung dịch hòa tan, ủ ở 75
0