TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING
TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM
TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING
TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM
TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

ii
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm hiểu sự khác nhau về kiểu gen của
WSSV ở hai thời điểm và hai khu vực khác nhau bằng phương pháp PCR -
Genotyping (ORF94 và ORF125). Kết quả cho thấy có sự khác nhau về kiểu
gen của WSSV ở năm 2006 và năm 2008 và cả ở 2 khu vực Cà Mau và Bạc
Liêu khi phân tích 231 mẫu ở 23 ao, thuộc 2 đợt thả giống liên tiếp trong cùng
một ao nuôi ở mô hình quãng canh cải tiến (QCCT) thuộc tỉnh Cà Mau 2008
và so sánh kiểu gen của các dòng virus này với các nghiên cứu trước đây (năm
2006). Kết quả nghiên cứu cho thấy, năm 2008, kiểu gen thuộc ORF94 có 12
nhóm vùng lặp lại (VLL), từ 4 - 16 vùng lặp lại trong đó 11-VLL chiếm tỉ lệ
cao nhất (35,8%, 43/120 tổng số mẫu), ORF125 có 8 nhóm vùng lặp lại từ 3 -
14 vùng lặp lại, trong đó 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất (53,8%, 64/119 tổng số
mẫu). Năm 2006 cho thấy có 5 nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125, từ 4 - 8
vùng lặp lại (Cà Mau) và có 6 nhóm từ 3 - 8 vùng lặp lại (Bạc Liêu), trong đó
kiểu gen có 6-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất ở cả hai khu vực (Cà Mau là 59,7%,
Bạc Liêu là 24,1%). Sự nhiễm nhiều kiểu gen (ORF94 và ORF125) của
WSSV trong cùng 1 ao ở mô hình nuôi QCCT năm 2008 là phổ biến và sự
nhiễm kép nhiều kiểu gen trong cùng một mẫu tôm cũng phong phú hơn so
với năm 2006. Nghiên cứu còn cho thấy, sự nhiễm bệnh ở các đợt nuôi tôm
liên tiếp ở mô hình QCCT chủ yếu là do nguồn tôm giống gây ra. Từ đó có thể
thấy khả năng ứng dụng tốt phương pháp PCR Genotying trong nghiên cứu tác
nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú.
2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm 7
2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng
kỹ thuật PCR - genotyping 8
2.3 Phương pháp chẩn đoán PCR 9
2.3.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 9
2.3.2 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR 9
2.3.3 Úng dụng của kỹ thuật PCR 10
Chương III - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 11
3.2 Vật liệu nghiên cứu 11
3.2.1 Dụng cụ và hoá chất 11
3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 11
3.3 Phương pháp nghiên cứu 12
3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV 12
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

iv

3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping 14
Chương IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16
4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008 16
4.1.1 Kết quả phân tích PCR-WSSV-IQ2000 16
4.1.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping 19
4.1.2.1 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF94 19
4.1.2.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF125 25
4.2 Kết quả phân tích mẫu axit nucleic trử năm 2006 với PCR-Genotyping
thuộc ORF125 30
4.3 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau
và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 33
4.4 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau

và năm 2008 34
Bảng 4.10 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau vào năm 2006
và năm 2008 35
Bảng 4.11 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Bạc Liêu vào năm 2006
và năm 2008 36
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

vi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996) 5

trong những bệnh gây thiệt hại đáng kể đến năng suất tôm nuôi.
Bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus (WSSV) gây ra trên tôm xuất
hiện sớm nhất ở Đài Loan năm 1991, sau đó thì phân bố rộng khắp nơi ở các
khu vực nuôi tôm trên thế giới. WSSV gây bệnh trên tôm nước mặn, tôm nước
ngọt và được phát hiện nhiễm trên nhiều đối tượng khác nhau. Từ khi bệnh
xuất hiện đến nay có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về phương thức lan truyền,
vật chủ cảm nhiễm, độc lực, thành phần cấu tạo và đã hoàn thành về phân loại
học WSSV, vv,…và đặc biệt đã giải trình tự bộ gen ba dòng WSSV ở Đài
Loan, Trung Quốc và Thái Lan. Khi so sánh 3 bộ gen này với nhau, tìm thấy
sự thay đổi về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 trên 3 dòng
virus này. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, vai trò ứng dụng của việc tìm hiểu
sự thay đổi kiểu gen thuộc ba vùng mã hoá này là rất lớn.
Theo nghiên cứu của Dieu et al., (2004) và Hoa et al., (2005) cho thấy dựa
vào sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 của
WSSV có thể xác định được nguồn gốc, phạm vi lan truyền của bệnh từ nơi
phát sinh và cũng như sự khác nhau của các dòng WSSV. Do đó, các vùng lặp
lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu
về dịch tể học của WSSV ở Việt Nam.
Vì vậy, đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR Genotyping trong nghiên cứu
tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú” được thực hiện nhằm
mục tiêu:
Tìm hiểu các vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm
trắng trên tôm sú thu ở Bạc Liêu và Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
Nội dung nghiên cứu

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
Chương II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình bệnh đốm trắng trên tôm
2.1.1 Trên thế giới
Trong khoảng thời gian 1991 - 1992 bệnh đốm trắng xuất hiện và gây chết
nhiều tôm nuôi ở một tỉnh của Đài Loan và sau đó đến hai tỉnh của Trung
Quốc. Đến năm 1994, bệnh này lan rộng và xâm nhập vào các trại nuôi ở nam
Nhật Bản, Thái Lan, Indonesia và bờ biển phía tây của Ấn Độ. Sau đó một
năm, bệnh xuất hiện ở cả khu vực Thái Bình Dương đã làm thiệt hại nặng, sau
3 năm bệnh lan khắp nơi trong các trại nuôi qui mô nhỏ ở Bắc Mỹ. Từ năm
1998 đến 1999 bệnh bắt đầu xuất hiện ở Nam Mỹ, đầu tiên là ở Ecuador sau
đó là Peru và tiếp tục đến các nước ở khu vực Thái Bình Dương. Không quá
10 năm bệnh xuất hiện và lan rộng khắp toàn cầu, gây thiệt hại lớn cho nền
kinh tế. Ước lượng rằng qua 10 năm bệnh đã làm thiệt hại khoảng 20 - 30 tỉ
USD.(Trích dẫn từ Caleb McClennen, 2004).
Khi bệnh xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 1992, sản lượng tôm giảm trên
70%, thiệt hại hơn 2 tỉ USD trong 3 năm liên tiếp. Đến năm 2001 Trung Quốc
lại thiệt hại trên 200.000 triệu tấn. Ước đoán tổng thiệt hại lên tới là 15 tỉ
USD. Ở Thái Lan, sản lượng thiệt hại khoảng 34.000 triệu tấn/năm. Cho đến
năm 1994 làm sản phẩm tồn lại khoảng 265.000 triệu tấn, thiệt hại khoảng 1,6
tỉ USD. Ở Indonesia cũng có tình trạng tương tự, sản lượng tôm khi bệnh chưa
bộc phát là 17.000 triệu tấn/năm từ 1985 - 1991. Khi bệnh xuất hiện làm nền

trắng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh có 67 ha bị bệnh virus
đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Ở các tỉnh Quảng Bình, Quảng
Trị, Thừa Thiên Huế, cũng có đến hơn 100 ha nuôi tôm bị bệnh.
Tại các tỉnh miền Trung và Nam Trung Bộ, theo Phòng Bệnh học thủy sản
(Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III), địa phương có tỷ lệ diện tích nuôi tôm bị
bệnh thấp nhất là Khánh Hoà (14,3%), cao nhất là Ninh Thuận (52,4%). Tỷ lệ
nhiễm bệnh virus đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này có giảm.
Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ
khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng trên
mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Bệnh
do virus đốm trắng gây chết tôm hàng loạt làm tác hại lớn đến năng suất, sản
lượng tôm của khu vực (
banvebenhtom.htm).

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV
2.2.1 Hình thái học của WSSV
WSSV có hình que, màng bao khép kín. Vỏ virus dài khoảng 210 - 380 nm và
rộng nhất khoảng 70 - 167 nm. Có một đuôi phụ nằm ở cuối của virion, đôi lúc
không quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996).

trò quan trọng để điều kiểm sự phát sinh bệnh đốm trắng trên tôm (Trích dẫn
từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008).
2.2.3 Gen và phân loại học
Bộ gen của WSSV có dạng vòng, phân tử ADN sợi đôi với A+T khoảng 59%
được phân bố đồng nhất với nhau. Kích cở gen thay đổi theo từng vùng địa lý
như dòng WSSV ở Thái Lan là 293 kbp (van Hulten et al. 2001), Trung Quốc
là 305 kbp (Yang et al. 2001) và dòng WSSV ở Đài Loan là 307 kbp (Chen et
al. 2002). WSSV có kích thước gen lớn nhất, chỉ nhỏ hơn một số loại virus
như virus gây bệnh ở A mip (1 181 404 bp), virus gây bệnh ở canarypox (359
853 bp), virus từ tảo nâu Ectocarpus (335 593 bp) và virus từ trùng đế giày
Paramecium (PBCV-1) (330 743 bp)(van Hulten et al. 2001b).
Phân tích trình tự gen cho thấy, bộ gen của WSSV nằm trong khoảng 531 đến
684 ORFs với mã mở đầu là ATG. Trong đó, 181-184 ORFs có khả năng mã
hoá protein chức năng có kích cở khoảng 51 - 6077 aminoacid, tương ứng với
92% thông tin di truyền nằm trong bộ gen (van Hulten et al. 2001a; Yang et
al. 2001). Khoảng 21 - 29% ORF mã hoá cho prôtêin của WSSV hoặc tham
gia nhận dạng các protein đã biết khác như DNA polymerase (Chen et al.
2002), các tiểu đơn vị lớn và tiểu đơn vị nhỏ của ribonucleotide, thymidine
kinase, thymidylate kinase, chimeric thymidine-thymidylate kinase,
thymidylate synthase, dUTPase / 2 PK (Yang et al. 2001),…Ba ORF (151,
366 và 427 của dòng virus ở Thái Lan) có khả năng mã hoá các protein phức
tạp của WSSV. Các nghiên cứu gần đây, cho thấy rằng WSSV cũng có 3 gen
sớm (immediate early - IE) (ORFs 126, 242 và 418 của dòng virus ở Đài
Loan). Các gen này phiên mã độc lập tổng hợp prôtêin trong bộ máy của tế
bào vật chủ. Những gen IE có ý nghĩa quan trọng để quyết định vật chủ cảm
nhiễm và có chức năng điều chỉnh các yếu tố gây nhiễm bệnh (Liu et al.
2005).
Phân tích chuỗi DNA polymerase và thành phần của một vài ORFs đã biết để
mã hoá cấu trúc protein của WSSV, tìm thấy sự khác biệt với nhóm
baculovirus, điều đó đã chứng minh rằng WSSV không có mối quan hệ với

cở gen lớn nhất (312 kbp), khả năng gây độc chậm hơn [thời gian gây chết
(LT50) = 14 ngày] so sánh với dòng virus khác (WSSV-TH) với kích cở gen
nhỏ hơn (292 kbp) (LT50 = 3.5 ngày). Kết quả này là do virus có kích cỡ gen
nhỏ hơn thuận lợi cho quá trình sao chép của virus (Marks, 2005).
2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm
WSSV gây bệnh chủ yếu trên các loài giáp xác 10 chân. Ít nhất 18 loài tôm
nuôi hoặc tôm ngoài tự nhiên, 8 loài thuộc nhóm động vật vỏ giáp kín thân
(caridean), 7 loài tôm hùm, 7 loài tôm, 38 loài cua, 6 loài giáp xác không
thuộc bộ 10 chân, Các thành viên thuộc ngành Chaetognata và Rotifera, giun
nhiều tơ và vài loài ấu trùng nước cho kết quả dương tính với kỷ thuật PCR.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
Tuy vậy, trong đó là những loài cảm nhiễm với WSSV ở mức thử nghiệm,
trong thực tế chỉ 1 vài loài thu từ ngoài tự nhiên dương tính với WSSV bằng
phương pháp PCR. Nhưng nhận định cho thấy các loài này không là vật chủ
thiết yếu của WSSV, nhưng chúng có khả năng là vật chủ trung gian gây bệnh.
(Trích dẫn từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008).
2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật
PCR-genotyping
Vào năm 2003 Wongteerasupaya et al., ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping để
xác định số lần lại của trình tự 54 bp bằng đoạn mồi ORF94. Kết quả cho thấy
đã tìm ra được 12 dòng WSSV với số lần lặp lại khác nhau như 6-, 7-, 8-, 9-,
10-, 11-, 12-, 14-, 15-, 17-, 19-, 20- vùng lặp lại. Trong đó các mẫu có 8 vùng
lặp lại chiếm đa số. Các mẫu tôm này được thu từ 55 ao tôm phát bệnh ở Thái
Lan. Qua đó cho thấy tiềm năng sử dụng trong nghiên cứu về dịch tể học của
bệnh đốm trắng trong việc tìm hiểu nguồn gốc gây bệnh và ngăn ngừa việc lây
lan.
Tiếp sau đó Dieu et al., (2004) nghiên cứu dịch tể học phân tử của virus gây
bệnh đốm trắng trên tôm ở VN. Mẫu được thu ở 8 nơi khác nhau ở Việt Nam,
trong đó 6 mẫu thu tại bờ biển miền Trung và 2 mẫu thu tại miền Nam - Việt

những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một
đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động
của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành mạch đơn,
phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy
(Tm) của chúng, thường là ở 94 - 95
o
C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
- Giai đoạn lai: ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các
mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Đây là giai đoạn quyết định
tính đặc hiệu của phản ứng.
- Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 72
o
C tạo điều kiện tốt
cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo ngyên tắc
bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymeraza hoạt
động. (Trích dẫn từ Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
2.3.2 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR như ADN khuôn, enzyme, mồi
và nhiệt độ gắn mồi, nồng độ các nucleotide, nồng độ Mg
+
, số lượng chu kỳ
phản ứng,…nhưng đáng quan tâm nhất là cặp mồi được chọn phải đặc trưng
cho trình tự DNA cần khuếch đại và DNA thật tinh sạch thì phản ứng PCR
mới tối ưu (trích dẫn từ Trần Thị Mỹ Duyên, 2006).

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
Chương III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: Từ 25/12/2008 – 30/04/2009
Địa điểm phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thuỷ
sản - Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và hoá chất
Dụng cụ:
- Que nghiền - Máy ly tâm
- Eppendorf 1,5ml, 0,5 ml, 0,2ml - Cân điện tử
- Bộ pipette, găng tay - Máy vortex
- Đầu col 200µl và 1000µl. - Bếp nhiệt khô
- Máy ủ - Máy sấy chân không
- Máy PCR - Bộ điện di
- Thiết bị chụp ảnh gel - Lò vi sóng (microwave),
Hoá chất:
- Ly trích: CTAB Solution, Dissolve solution, ethanol 95%, Chloroform, dung
dịch TE.
- Khuếch đại: nước cất tiệt trùng, dung dịch Buffer 10X, MgCl
2
25mM, dNTP
mix 10 mM, Taq ADN Polymerase, mồi ORF 94 - F, mồi ORF 94 - R và mồi
ORF 125 flank (Forward, Reverse).
- Điện di: Agarose, Ethidium bromide, 6X loading Dye, thang ADN 1 kb plus
(Invitrogen) và thang ADN 100 bp plus.
3.2.2 Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu axit nucleic trữ năm 2006 (67 mẫu - Cà Mau và 87 mẫu - Bạc

C trong 5 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong phía trên
sang eppendorf mới có chứa 300 µl ethanol 95%.
Lắc đều, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa ADN với 200 µl ethanol
70%, để lắng xuống. Làm khô ADN và hoà tan trong TE. Bảo quản ADN ly
trích ở -80
o
C.
Khuếch đại ADN Thực hiện phản ứng PCR 2 bước
+ Phản ứng PCR bước 1: 8 µl/phản ứng
First PCR PreMix 7,5 µl
IQzyme ADN Polymerase 2 U/µl 0,5 µl
+ Phản ứng PCR bước 2: 15 µl/ phản ứng
Nested PCR PreMix 14 µl
IQzyme ADN Polymerase 2 U/µl 1 µl
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
PCR bước 1 (First PCR):
94
o
C trong 2 phút
15 chu kỳ: 94
o
C trong 20 giây
62
o
C trong 20 giây

C, rồi đổ
dung dịch agarose từ từ vào khay đựng gel. Thường bề dày của gel chỉ cần cao
hơn đáy của lược khoảng 0,3 - 0,5 cm, bề dày của gel không quá 0,8 cm.
Điện di: Cẩn thận cho mẫu, thang ADN, đối chứng âm, đối chứng dương vào
trong từng giếng. Sau đó, điện di với dòng điện 90V trong thời gian khoảng 50
phút.
Đọc kết quả: kết quả điện di được ghi nhận với thiết bị chụp ảnh gel (Vilber
Loumart).
- Mẫu dương tính được phát hiện với các trường hợp: (i) hiện vạch
tương ứng 296 bp và 848bp (mẫu nhiễm rất nhẹ); (ii) hiện vạch tương
ứng 296 bp (mẫu nhiễm nhẹ); (iii) hiện vạch tương ứng 296 bp và 550
bp (mẫu nhiễm trung bình); (iv) hiện vạch tương ứng 296 bp và 550 bp
và vạch trên 848bp (mẫu nhiễm nặng)
- Mẫu âm tính hiện vạch tương ứng 848 bp (nội chuẩn của tôm).
- Nếu mẫu không hiện vạch nào là do chất lượng ADN ly trích kém.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping
Phương pháp PCR-genotyping dùng để xác định số vùng lặp lại thuộc
ORF94 (Wongteerasupaya et al., 2003, do Trần Thị Mỹ Duyên tối ưu năm
2006).
Thành phần phản ứng: (25µl/phản ứng)

Hóa chất Nồng độ
Nước
PCR buffer 1X
MgCl

o
C trong 20 giây
72
o
C trong 1 phút
và
72
o
C trong 10 phút
20
o
C trong 1 phút.
Cách đọc kết quả:
Xác định số vùng lặp lại 54 bp với công thức X = x + 54*n
Trong đó, X : là chiều dài sản phẩm
n : là số lần lặp lại của trình tự 54 bp
x : là khoảng cách từ vị trí con mồi đến vùng lặp lại (bp)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
Phương pháp PCR-genotyping dùng để xác định số vùng lặp lại thuộc
ORF125 (Bui Thị Minh Dieu et al.,2004, do Nguyễn Thị Thuý Hằng tối ưu
năm 2008)
Thành phần phản ứng: (25µl/phản ứng)

Hóa chất Nồng độ
Nước
PCR buffer

1X


C trong 30 giây
52
o
C trong 30 giây
72
o
C trong 1 phút
và 72
o
C trong 7 phút
Cách đọc kết quả:
Xác định số vùng lặp lại 69bp với công thức X = x + 69*n
Trong đó, X: là chiều dài sản phẩm (bp)
n: là số lần lặp lại của trình tự 69 bp
x: là khoảng cách từ vị trí con mồi đến vùng lặp lại (bp)

Tên mồi Trình Tự
ORF125 flank - Forward 5'-CGA AAT CTT GAT ATG TTG TGC-3'
ORF125 flank - Reverse 5'-CCA TAT CCA TTG CCC TTC TC-3'
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
Chương IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008


88 143
231 62Qua kết quả trên, cho thấy các ao thu mẫu mặc dù ít thấy dấu hiệu bệnh lý và
tỉ lệ chết rất thấp (theo thông tin thu mẫu) nhưng khi phân tích mức độ nhiễm
bệnh lại khá cao chiếm 62% so với tổng số mẫu phân tích. Mẫu dương tính ở
đợt thả giống lần 1 (chiếm 75%) cao hơn so với mẫu tôm ở đợt thả giống lần 2
(chiếm 58%) và mẫu cua (chiếm 42%) (Hình 4.1). Ở tôm nuôi lần 1, tôm
nhiễm ở cả 3 mức độ nhẹ (+), trung bình (++) và nặng (+++), nhiễm nhẹ xuất
hiện nhiều nhất (chiếm 45% so với tổng số mẫu tôm nuôi lần 1) nhưng ở tôm
nuôi lần 2 tôm chỉ nhiễm nhẹ hoặc nhiễm nặng (nhiễm vừa chiếm 0%). Đối
với các mẫu cua những mẫu dương tính chỉ nhiễm ở mức độ nhẹ (+) không
thấy mức độ nhiễm nặng và nhiễm vừa (Thông tin chi tiết bảng Phụ lục II).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17


diện tích 200m
2
cho đến khi tôm trưởng thành. Kết quả cho thấy rằng đàn tôm
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - +
848

bp630 bp

333 bp

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version