BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * * * *
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO
DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon)
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * *
THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO
DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon)
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức Thành
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005
LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định
nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóa luận đã được hoàn thành. Tôi
xin chân thành cảm tạ:
 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ

Ở các nồng độ thử nghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml):
Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus
hoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus.
Hợp chất B và D
2
có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml), 5
(mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml).
iv
MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ...............................................................................................................iii
Tóm tắt....................................................................................................................vi
Mục lục....................................................................................................................v
Danh sách các hình...............................................................................................viii
Danh sách các bảng và sơ đồ .................................................................................ix
PHẤN 1 MỞ ĐẦU..................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề..............................................................................................1
1.2 Mục đích, yêu cầu..................................................................................2
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................3
2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới....................................................3
2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam.......................................4
2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú..............................................6
2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây
hội chứng đốm trắng trên tôm sú...........................................................7
2.4.1 Tác nhân gây bệnh....................................................................7
2.4.2 Khu vực phân bố.......................................................................7
2.4.3 Ký chủ.......................................................................................8
2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền..................................8
2.4.5 Cơ chế xâm nhập......................................................................9

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN......................................20
4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược
đối với virus gây hội chứng đốm trắng......................................................20
4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D
2
.....................................20
4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B.......................................21
4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M......................................23
vi
4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV
và hợp chất D
2
, B ở các nồng độ khác nhau....................................23
4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D
2
.............................................27
4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B..............................................29
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................32
vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA
WSSV
từ hỗn hợp
dịch chiết virus được ủ với hợp chất D
2
trong thời gian 2 giờ...........................20
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA
WSSV

Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo
dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV)......................................18
Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV
trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các
nồng độ khác nhau.............................................................................................19
ix
PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề.
Trong những thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc
biệt là các sản phẩm thủy sản ngày càng tăng cao. Vì thế, sản lượng thủy sản không thể
đáp ứng được nhu cầu thị trường, trong khi nguồn lợi thủy sản ngày càng giảm do khai
thác quá mức. Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc
biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và là một nhu cầu cần
thiết.
Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta cũng phát triển mạnh trong vài thập kỷ gần đây,
đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các tỉnh ven biển. Nghề nuôi tôm nước ta phát triển chủ yếu
mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế. Điều đó dẫn đến sự suy
thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh. Khoảng 20 năm gần
đây, dịch bệnh tôm xảy ra ở khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm. Một trong
những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đó là bệnh đốm trắng ( White Spot
Desease ) do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Thiệt hại có thể lên đến 100 %
quần đàn từ 3 - 7 ngày kể từ khi phát hiện tôm bệnh. Có nhiều phương pháp phòng trị
bệnh đốm trắng như dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… nhưng còn tồn tại nhiều
mặt hạn chế và mức độ thành công chưa cao.
Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật rất
phong phú. Thảo dược từ xưa đã được ứng dụng phòng trị bệnh có hiệu quả trong y học
và thú y. Tuy nhiên trong lĩnh vực thuỷ sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi. Thử
nghiệm một số hợp chất thảo dược trong phòng trị bệnh ở các đối tượng nuôi thuỷ sản là
hướng nghiên cứu mới và cần khai thác. Được sự đồng ý của Trung tâm Quốc gia Quan
trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ (MCE)

lợi còn có mặt trái của nó. Trong suốt 2 thập kỷ qua, nghề nuôi tôm trên thế giới đã có
rất nhiều thay đổi và trải qua nhiều khó khăn. Dịch bệnh đã liên tiếp xuất hiện ở nhiều
khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Á, trong đó bệnh do virus ảnh
hưởng nghiêm trọng đến nền công nghiệp nuôi tôm. Ước tính tổng thiệt hại do virus gây
ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD. Bệnh do virus gây hội chứng
đốm trắng trên tôm sú đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công
nghiệp của các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia và Ấn Độ. Bệnh đốm trắng xuất
hiện đầu tiên vào năm 1992 – 1993 ở Bắc Á, sau đó là các khu vực khác trên thế giới.
Tên một số quốc gia và năm phát hiện bệnh đốm trắng được trình bày ở Bảng 2.1:
Bảng 2.1: Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng.
Tên quốc gia Đài Loan Trung Quốc Ấn Độ Thái Lan Nhật Indonesia Úc Việt Nam
Năm phát hiện 1992 1993 1994 1994 1994 1994 1994 1994
Tỷ lệ gây chết do virus có thể lên đến 100 % trong vòng 3 - 10 ngày kể từ khi có
dấu hiệu đầu tiên.
3
2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam.
Hoạt động nuôi tôm biển ngày càng đóng vai trò quan trọng ở nước ta. Tôm nước
lợ là đối tượng nuôi chủ lực ở các tỉnh ven biển. Diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 546.757
ha (2003), trong đó diện tích nuôi thâm canh là trên 15.534 ha (chiếm khoảng 2,84 %
tổng diện tích nuôi tôm), nuôi bán thâm canh trên 20.116 ha (chiếm 3,67 %), còn lại là
nuôi quảng canh cải tiến và quảng canh. Năm 2003, diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh là
32.423 ha, chiếm 3,2 % gây nhiều thiệt hại cho người nuôi tôm. Các tỉnh duyên hải
Nam Bộ có tổng diện tích nuôi lớn nhất, chiếm 87,17 % của cả nước với 476.528 ha.
Năm 2003 sản lượng nuôi tôm nước lợ đạt hơn 200.000 tấn.
Trong cơ cấu mặt hàng xuất khẩu của Việt Nam trong năm 2003, tôm sú vẫn là
mặt hàng chủ lực. Khối lượng đạt trên 123.600 tấn, chiếm khoảng 25 %, nhưng về giá
trị chiếm khoảng 50 %, đạt hơn 1 tỷ USD.
Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 đã báo động trên
toàn quốc dịch bệnh tôm đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng. Trong năm 1994, tổng diện
tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị

tôm chết. Tôm sú nuôi sau 1 - 2 tháng bệnh đốm trắng xuất hiện và gây tôm chết hàng
loạt.
Tôm sú bố mẹ khi đánh bắt ở biển khơi hoặc trong các đầm phá có hiện tượng bị
bệnh đỏ mang sau khi đánh bắt 3 - 4 ngày, tỷ lệ chết tới 80 - 100 %, thời gian tôm bị
bệnh và chết nhiều vào tháng 3 – 4 (sau tết). Kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử thấy có
xuất hiện các thể virus hình que và test PCR dương tính với bệnh đốm trắng.
Năm 2003, phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật PCR của 145 mẫu tôm sú và
tôm chân trắng (Lipopenaeus vannamei) nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng
Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hoá và Hà Tĩnh ) và tôm post đưa từ Quảng Nam
và Đà Nẵng chuyển ra Bắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng của tôm post
đưa từ miền Trung (Đà Nẵng, Quảng Nam) là 23,08 %; tôm sú nuôi thương phẩm ở các
tỉnh phía Bắc là 26,92 %; tôm chân trắng là 13,33 %.
Phân tích tỷ lệ lưu hành bệnh WSSV theo tháng trên tôm sú nuôi thương phẩm
thì thấy tháng 7, 8, 9 có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (0,25 – 0,4); tháng 6 tỷ lệ thấp hơn
(0,12) và tháng 5 chưa phát hiện thấy tôm nhiễm bệnh.
Các bệnh trên tôm xảy ra chủ yếu là do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV),
ngoài ra còn xuất hiện bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do
dinh dưỡng và gần đây còn xuất hiện bệnh phân trắng, teo gan tụy ở một vài nơi.
Các bệnh thường gặp trên tôm nuôi thường được phân chia thành hai loại bệnh
truyền nhiễm và không truyền nhiễm trong đó chủ yếu là do bệnh truyền nhiễm.
5
Từ tình hình dịch bệnh chung ở trên cho thấy để phát triển bền vững nghề nuôi
tôm đòi hỏi phải kết hợp rất nhiều yếu tố quan trọng như nghiên cứu hoàn thiện quy
trình sản xuất giống và nuôi tôm thịt, các vấn đề về dinh dưỡng và môi trường, đồng
thời không kém phần quan trọng đó là nghiên cứu các tác nhân gây bệnh để tìm ra
những biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả.
2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú.
Môi trường nước gồm một loạt các thông số tác động đến sự sinh trưởng và tái
sản xuất của sinh vật. Ở điều kiện bình thường thì giữa sinh vật (vật chủ ), nguồn bệnh
và môi trường giữ trạng thái cân bằng, bất cứ sự phá vỡ cân bằng nào đều có thể gây

nhưng không có tế bào tạo ra kháng thể và không có sự bảo vệ đặc hiệu chống lại tác
nhân lạ. Vì vậy sự nhiễm virus dai dẳng tồn tại hiển nhiên trong cơ thể tôm. Vì thế việc
tăng cường sức đề kháng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản thuộc nhóm giáp xác không
thể dựa vào việc sử dụng các loại vaccin mà chủ yếu là các biện pháp tăng cường hiệu
quả đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môi trường nuôi và
sử dụng các chất kích thích miễn dịch.
2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên
tôm sú.
2.4.1 Tác nhân gây bệnh.
Bệnh đốm trắng được xem là bệnh nguy hiểm và gây hậu quả nghiêm trọng nhất
đến ngành nuôi tôm công nghiệp. Bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1993.
Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu,
kích thước 70 x 300 nm.
Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kilodalton. Vỏ bao
có 2 lớp protein VP28 và VP 19; nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24 và Vp15.
Nhân có cấu trúc DNA sợi đôi ( dsDNA ): không có thể ẩn ( Occlusion body ).
Khi bị nhiễm bệnh đốm trắng, tôm rất yếu và mềm vỏ do các đốm trắng (nên gọi
là bệnh đốm trắng) có đường kính từ 0,5 – 2 mm, hiện rất rõ ở dưới vỏ kitin. Đốm trắng
là chất đọng lại không bình thường của muối canxi bởi biểu bì vỏ kitin. Khi đã thấy rõ
dấu hiệu này thì tôm chết rất nhanh.
2.4.2 Khu vực phân bố.
Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, sau đó bệnh
lan rộng ra khắp khu vực Châu Á và trên thế giới. Dịch bệnh được phát hiện trước tiên ở
Đài Loan năm 1992, Trung Quốc 1993, sau đó là Nhật, Indonesia, Thái Lan, Malaysia,
Ấn Độ, Việt Nam, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ 1995). Bệnh đã làm giảm nghiêm trọng
sản lượng tôm ở các quốc gia trên.
7

Trích đoạn Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược

---