MỤC LỤC
Trang
Mở đầu 1
Chương 1 Tổng quan 4
1.1. Giới thiệu về protein và axít amin 4
1.2. Định nghĩa và cấu trúc axít amin 13
1.3. Tính chất hóa lý của protein và axít amin 14
1.4. Tổng quan về các phương pháp định lượng protein và axít amin 17
Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 29
2.1. Nội dung và mục tiêu nghiên cứu 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 31
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thuốc thử sử dụng 42
2.4. Phương pháp thu thập mẫu thực phẩm để phân tích 44
Chương 3.Kết quả và thảo luận 46
3.1. Khảo sát chọn loại chất dẫn xuất cho axít amin 47
3.2. Tối ưu hóa các điều kiện tách và xác định axít amin bằng HPLC 49
3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và xây dựng đường
chuẩn của phương pháp phân tích 62
3.4. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân mẫu 69
3.5. Lược đồ quy trình phân tích đối với các mẫu thực phẩm 84
3.6. Đánh giá thống kê phương pháp phân tích 87
3.7. Phân tích mẫu thực tế 103
Kết luận 133
Danh mục công trình tác giả 114
Tài liệu tham khảo 116
Phụ lục 1 125
Phục lục 2 127
Phục lục 3 128
Phục lục 4 133

HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Ile
Isoleucin
KPH
Không phát hiện (dưới ngưỡng phát hiện của phương
pháp)
Leu
Leucin
Lys
Lysin
Met
Methionin
Ninhydrin
Tricetohydrinđen hydrat
OPA
Ortho-phthalaldehyd / ortho-phthaldialdehyd
Phe
Phenylalanin
PITC
Phenyl isothiocyanat
Pro
Prolin
RP-HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược
Ser
Serin
Thr
Threonin
Tyr

Bảng 3.16: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 1 (150 - 30ppb) 88
Bảng 3.17: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 2 (790 - 80ppb) 89
Bảng 3.18: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 3 (1490 - 150 ppb) 89
Bảng 3.19: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá quả 91
Bảng 3.20: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu cá quả 92
Bảng 3.21: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin đối với mẫu cá thu 93
Bảng 3.22: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin đối với mẫu cá thu
93
Bảng 3.23: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu hạt đậu 94
Bảng 3.24: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu tương
95
Bảng 3.25: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu đậu phụ 96
Bảng 3.26: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu phụ 97
Bảng 3.27: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng các axít amin trong mẫu sữa đậu nành 97
Bảng 3.28: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu các axít amin trong mẫu sữa đậu nành
98
Bảng 3.29: Độ thu hồi ở nồng độ thứ nhất 100
Bảng 3.30: Độ thu hồi ở nồng độ thứ hai 101
Bảng 3.31: Độ thu hồi ở nồng độ thứ ba 102
Bảng 3.32: Hàm lượng axít amin trong cá nước ngọt (g/100g) 104
Bảng 3.33: Hàm lượng axít amin trong cá nước mặn (g/100g) 105
Bảng 3.34: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu hạt đậu tương 109
Bảng 3.35: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu đậu phụ 110
Bảng 3.36: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu sữa đậu nành 111
Bảng 3.37: Hàm lượng axít amin trong một số loại thịt (g/100g) 114
ex = 250;

em = 395) 50
Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC
trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ PDA
(

= 254nm) 50
Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM, cột RP18 (150mm
x 4,6mm x 5

m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex=250;

em=395)
52
Hình 3.6: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM,cột RP18 (150mm x
4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex=250;

em=395)
52
Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn axít glutamic, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9



ex = 250;

em = 395) 59
Hình 3.11: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng 1,2ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex =
250;

em = 395), pha động chạy theo chế độ gradient 60
Hình 3.12: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex = 250;

em = 395), pha động theo chế độ gradient 60
Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng 0,8ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex =
250;

em = 395), pha động theo chế độ gradient 60

C, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x
3,9

m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex = 250;

em = 395) 71
Hình 3.22: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy
phân 72 Hình 3.23: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu tương bằng HCl
6M ở 110
o
C, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex = 250;

em = 395) 73
Hình 3.24: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nhiệt độ thủy phân đậu
nành bằng HCl 6M 74
Hình 3.25: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương bằng
HCl 6M, ở 125
o
C, trong 20 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9


7
0,25M, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex= 250;

em = 395) 80
Hình 3.30: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được dẫn
xuất ở 65
o
C, thời gian 10 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex = 250;

em = 395) 81
Hình 3.31: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được dẫn
xuất ở 65
o
C, thời gian 5 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex = 250;



m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex = 250;

em = 395) 108
Hình 3.36: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex = 250;

em = 395) 108
Hình 3.37: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu thịt gà, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9

m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (

ex = 250;

em = 395) 113

1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước trên thể giới đang phải tiếp
tục giải quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng. Trong khi đó, thừa dinh

2
cũng có nhiều nhóm vitamin B, axít folic, vitamin B12, vitamin E, bên cạnh đó cá
cũng là nguồn cung cấp các chất khoáng quý, dao động từ 1 - 1,7g/100g, có khi lên
tới 3g/100g, gồm các yếu tố vi lượng như: đồng, kẽm, i ốt. Mỡ cá không những có
đầy đủ thành phần axít béo không no mà nó còn chứa axít béo thiết yếu DHA.
Ngoài ra trong mỡ cá còn chứa axít béo Omega-3, có tác dụng bảo vệ hệ thống tim
mạch. Việc tiêu thụ axít béo này cũng làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch và cao
huyết áp [12]. Theo nhận định của FAO mức tiêu thụ cá tại Việt Nam vào khoảng
18,72 kg/người/năm. Cá là nguồn thực phẩm quý bổ sung lượng protein đáp ứng
nhu cầu sinh hoạt của người dân.
Trong chế độ ăn của người Châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, các
thực phẩm từ đậu tương chiếm một vị trí quan trọng. Theo kết quả tổng điều tra
dinh dưỡng năm 2000 của Viện Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ
đã tăng lên đáng kể trong năm 2000, với khoảng 6g/người/ngày so với
2,8g/người/ngày trong năm 1990. Đậu phụ, loại thực phẩm giàu đạm thực vật thông
dụng ở Việt Nam cũng có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4g/người/ngày trong năm
2000 so với 6,8g/người/ngày trong năm 1990 [13].
Axít amin là một thành phần quan trọng của cơ thể. Axít amin tạo nên tế bào,
phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virus. Axít amin là một
phần của enzym và hệ thống hormon. Nó tạo nên ARN (axit ribo nucleic), ADN
(axit deoxy nucleic) vận chuyển oxy đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của
các cơ. Axít amin cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein. Protein khi vào cơ
thể được chuyển hóa thành 20 axít amin, trong đó có 8 axít amin thiết yếu không
được tạo ra từ cơ thể, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin,
tryptophan và valin. Sự thiếu hụt axít amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết,
dị ứng [81].
Trên thế giới, phương pháp truyền thống phân tích axít amin được đưa ra và
phát triển bởi Moore và Stein [63, 64, 65, 66] là tách và xác định các axít amin tự
do bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất sau cột (ninhydrin hoặc O-
phtalaldehyd). Kỹ thuật này đã được áp dụng hơn 40 năm cho kết quả tốt trong

thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh dưỡng.
Vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu tối ưu hóa các
điều kiện để tách và xác định một số axít amin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC). 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về protein và axít amin
1.1.1. Lịch sử phát hiện ra protein và axít amin [3, 6, 54]
Khái niệm protein (protit hay đạm) ngày nay rất quen thuộc với chúng ta,
song trước đây chỉ mới đầu thế kỷ thứ 19 người ta vẫn coi protein là một vấn đề bí
ẩn và khó hiểu.
Quan niệm xưa của Hypocrates cho rằng mọi thức ăn chỉ có một chất dinh
dưỡng phổ biến đã tồn tại cho đến thế kỷ 19. Tuy nhiên vào năm 1816 nhà y học
Pháp Franois Magendie (1783-1855) đã chỉ ra rằng các hợp chất chứa nitơ trong
thực phẩm là thiết yếu đối với chó và nhà y học Anh William Prout (1785-1850)
năm 1834 đã phân biệt được saccarin, chất béo và albumin trong nhóm các chất
dinh dưỡng. Nhà hóa học và y học Hà Lan Gerard Mulder (1802-1880) đã dùng
thuật từ protein lần đầu tiên vào năm 1839 (từ tiếng Hy Lạp protos nghĩa là đầu
tiên) từ đó protein được xem là chất dinh dưỡng quan trọng nhất.
Trong thế kỷ 19 phần lớn các axít amin được phân lập và xác định được cấu
trúc. Vào năm 1906, nhà hóa sinh Anh F. G. Hopkins (1861-1947) đã thấy rằng
dùng ngô là nguồn protein duy nhất không thể duy trì sự sống của súc vật thí
nghiệm trừ phi được bổ sung thêm tryptophan, điều đó xác định tính thiết yếu của
một số axít amin. Phát hiện đó đã mở đường cho rất nhiều công trình xác định giá
trị sinh học của protein, chủ yếu bởi các nhà khoa học Mỹ trong khoảng thời gian từ
1890 - 1924 (K. Thomas 1909, Osborn et al. 1919, Mitchell 1924).
Sau khi 2 axít amin cuối cùng được xác định (methionin vào năm 1922 và
threonin vào năm 1935) người ta đã có thể điều chỉnh chất lượng protein dựa vào

Protein phân tử lớn được hấp thu trong ruột, dưới tác dụng của nhiều loại
enzim tiêu hóa (như pepsin, tripsin, peptase) phân giải thành peptid ngắn và axít
amin trong dạ dày. Sau đó được hấp thu trong ruột non, theo tĩnh mạch chủ vào bên
trong gan.
Axít amin trong máu có 3 nguồn là từ protein trong thức ăn, từ sự phân giải
protein mô và từ sự chuyển hóa hydrat carbon và lipit.
Đường đi của axít amin trong máu là: 6
 Hợp thành protein mô.
 Hợp thành các protein đặc thù như enzim, hormon, kháng thể,…
 Sản sinh ra urê, muối amoni và các chất có chứa nitơ khác.
 Ôxy hóa thành khí carbonic, nước và urê, đồng thời sinh ra năng lượng.
Trong tình trạng bình thường tốc độ ra vào của các axít amin trong máu gần
như là ngang nhau, cho nên hàm lượng axít amin trong máu của người bình thường
là tương đối ổn định.
1.1.4. Công dụng sinh lý của protein [6, 54]
Chủ yếu có những mặt sau:
 Cấu thành và bồi bổ các tổ chức của cơ thể
 Thành phần cấu thành các enzim và các hormon
 Cấu thành các kháng thể
 Điều tiết áp lực thẩm thấu
 Cung cấp năng lượng
Thiếu protein sẽ làm cho trẻ nhỏ sinh trưởng, phát triển chậm và không tốt; ở người
lớn sẽ gây sút cân, teo cơ, thiếu máu, dễ mệt mỏi, sức đề kháng thấp dễ bị chấn
thương, gẫy xương lâu liền, sau khi bị bệnh, phục hồi chậm; thiếu protein nặng sẽ
xuất hiện phù nề do dinh dưỡng.
1.1.5. Giá trị dinh dưỡng của protein [6, 54, 68]
Hàm lượng và chất lượng của thức ăn, chủ yếu chỉ giá trị protein trong thức

quá sự hỗn hợp giữa các loại thức ăn từ thực vật đơn thuần.
- Chủng loại thức ăn phối hợp với nhau càng nhiều càng tốt.
- Các loại thức ăn phải ăn cùng đồng thời, bởi vì sau khi một axít amin đơn nhất
được hấp thu vào cơ thể, thường cần phải dừng lại trong máu gần 4 tiếng; sau
đó đến các cơ quan tổ chức, rồi mới hợp thành protein của các cơ quan tổ chức;
và các axít amin mà protein được hợp thành ở các tổ chức cơ quan đòi hỏi phải
đến một cách đồng thời thì mới phát huy được tác dụng tương hỗ giữa các axít
amin để tạo nên protein của các cơ quan tổ chức.
Lượng cung cấp protein.
Hiện nay vẫn chưa có những chứng cứ đầy đủ cho thấy lượng nhu cầu 8
protein chịu sự ảnh hưởng của cường độ lao động, nhưng khi sự hấp thu năng lượng
từ bữa ăn tăng lên thì lượng hấp thu protein cũng tăng lên. Lượng cung cấp protein
trong bữa ăn hàng ngày do Hiệp hội dinh dưỡng Trung Quốc đề ra được tính toán
dựa theo mức năng lượng chiếm 11- 14% tổng năng lượng, trong đó ở trẻ em và
thanh thiếu niên là 13 - 14%, để đảm bảo cho nhu cầu sinh trưởng phát triển; ở
người lớn là 11 - 12% tức có thể bảo đảm duy trì được chức năng sinh lý bình
thường. Việc bổ sung năng lượng của những người lao động chân tay cực nặng chủ
yếu là từ thức ăn loại hạt cốc, mức protein chiếm trong đó tương đối thấp, nhưng
vẫn có thể đạt được 11% tổng năng lượng.
1.1.6. Nguồn protein [6]
Các thức ăn chủ yếu cung cấp protein cho cơ thể có thể là: các loại thịt gia
cầm, gia súc và các loại thuỷ sản, hàm lượng protein trong đó thường là 10 - 20%;
trong sữa tươi các loại là 1,5 - 3,8%; trong trứng các loại là 11 - 14%; trong đậu khô
các loại là 20 - 40% - là loại có hàm lượng protein tương đối cao trong các loại thức
ăn từ thực vật; các loại quả cứng như lạc, hồ đào, hạt sen, cũng chứa 15 - 30%
protein; hạt cốc các loại thường chỉ chứa 6 - 10% protein; khoai các loại chiếm 2 -
3% protein. Về việc cung cấp protein trong bữa ăn hiện nay nên xem xét trên cơ sở

sữa, tạo thành hợp chất đường amino, là loại mà các enzim tiêu hóa không thể
phân giải được và cũng không thể hấp thu được. Phản ứng này gọi là phản ứng
Melade, xảy ra trong khi tàng trữ và tăng nhiệt quá mức đối với thức ăn, sẽ làm
cho hàm lượng lysin vốn đã có tương đối ít trong sản phẩm hạt ngũ cốc lại càng
giảm xuống. Vì vậy, tăng thêm một lượng lysin thích hợp vào trong thức ăn sẽ
cải thiện được tình trạng dinh dưỡng của những người sống ở vùng dùng hạt
ngũ cốc làm lương thực chính.
- Trytophan: Một trong những loại axít amin cần thiết, một loại chất dẫn truyền
thần kinh quan trọng có thể tạo ra trong não người, chất 5- hydroxytryptamin có
tác dụng trung hoà adrenalin và noradrenalin, đồng thời cải thiện được thời gian
liên tục của giấc ngủ. Khi chất 5-hydroxytryptamin trong não động vật giảm, sẽ
có biểu hiện hành vi không bình thường, kể cả mất ngủ, Ngoài ra, chất 5-
hydroxytryptamin còn có trong các tổ chức tiểu cầu và tế bào niêm mạc ruột, 10
có tác dụng làm co mạch máu rất mạnh. Con người khi bị thương trong cơ thể
sẽ phóng thích chất 5-hydroxytryptamin để cầm máu.
- Phenylalanin và tyrosin: Phenylalanin là loại axít amin cần thiết. Cơ thể có thể
chuyển hóa phenylalanin thành tyrosin, nhưng không thể xảy ra phản ứng
ngược lại. Trong những cơ thể bình thường, hầu như tất cả các phenylalanin
chưa được dùng để hợp thành protein đều sẽ chuyển hóa thành tyrosin. Cho
nên, khi tyrosin trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được phenylalanin.
Tyrosin trong cơ thể sẽ chuyển hóa thành noradrenalin và adrenalin do adrenal
medlla tiết ra, và chất mẫn triiodothryonin. Ngoài ra, hắc sắc tố được sinh ra ở
da và võng mạc mắt cũng là do tyrosin chuyển hóa thành nhờ tác dụng của các
enzim. Những người thiếu phenylalanin decarboxylase do nhân tố di truyền sẽ
không thể chuyển hóa phenylalanine thành tyrosine được, và sẽ mắc một loại
bệnh khiếm khuyết bẩm sinh, gọi là chứng phenylceton niệu. Bệnh nhân loại
này không thể tận dụng được protein trong thức ăn và không thể ăn uống được

trong nghiên cứu về dinh dưỡng ngoại khoa và dinh dưỡng cho vận động viên.
- Axit Glutamic: Là một loại hợp chất có liên quan tới công năng của hệ thần
kinh - tiền chất của r- reanal; dinatri glutamat là loại bột ngọt thường dùng.
- Histidin: Khử carboxyl (khử  COOH) dưới tác dụng của histidin decarbo-
xylase để hình thành nên histamin. Histamin có tác dụng giãn mạch rất mạnh,
đồng thời có liên quan tới rất nhiều phản ứng biến thái và chứng viêm.
Lượng nhu cầu các axít amin cần thiết được chỉ ra trong bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axít amin cần thiết
(mg/kg cân nặng/ngày)
Axít amin
Trẻ dưới
1 tuổi
Trẻ 2 tuổi
10-12
tuổi
Người lớn
Tỷ lệ
Histidin
28
?
?
(8- 12)
(2,9)
Isoleucin
70
31
30
10
2,9
Leucin

35
7
2,0
Tryptophan
17
12,5
4
3,5
1,0
Valin
93
38
33
10
2,9
Tổng cộng
714
352
261
84

Theo FAO/ WHO, 1983
* Tính theo người lớn
Trị số ước lượng về lượng nhu cầu axít amin được tổ chức Y tế thế giới
(WHO) và tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO) đưa ra căn cứ theo
các tài liệu nghiên cứu khác nhau, xem bảng 1.1.
Bảng 1.2: Đối chiếu các loại axít amin thiết yếu
Axít amin
Gạo
Tỷ lệ lượng đòi hỏi các axít

1,6
1,0
1,0
Val
5,5
3,4
2,9
Mô thức axít amin thiết yếu: thường lấy lượng nhu cầu về axít amin trong cơ
thể làm cơ sở. Thường là lấy một axít amin có lượng nhu cầu ít nhất là 1,0 rồi so
sánh với các axít amin cần thiết khác để tìm ra tỷ lệ của mỗi loại. Chẳng hạn như
lấy lượng nhu cầu axít amin cần thiết của người lớn làm ví dụ, thì lượng nhu cầu về
tryptophan là ít nhất, lượng nhu cầu mỗi ngày cho mỗi kilôgam cân nặng là 3,5 mg,
lượng nhu cầu về isoleucin là 10mg, vậy tryptophan : isoleucin = 3,5:10; nếu 13
tryptophan là 1,0 thì isoleucin là 2,8, cứ dựa vào đây mà suy ra (bảng 1.2). Với loại
Protein hấp thu được trong thức ăn, sau khi tiêu hóa, hấp thu mà càng tiếp cận được
với nhu cầu protein được tổng hợp trong cơ thể, thì hiệu suất tận dụng trong cơ thể
sẽ càng cao. Cho nên giá trị dinh dưỡng của protein thức ăn được quyết định bởi
axít amin cần thiết.
Axít amin hạn chế
Chỉ loại axít amin tương đối thiếu hụt khi đối chiếu giữa hàm lượng axít
amin cần thiết trong protein thức ăn, với mô thức axít amin cần thiết, loại axít amin
thiếu hụt nhất trong đó được gọi là axít amin hạn chế thứ nhất, tiếp đó là axít amin
thứ hai, thứ ba. Chẳng hạn các loại axít amin hạn chế thứ nhất, thứ hai, thứ ba trong
gạo sẽ lần lượt là lysin, methionin và phenylalanin (bảng 1.2).
1.2. Định nghĩa và cấu trúc axít amin
Trong hóa học, một axít amin là một phân tử chứa cả nhóm amin và nhóm
carboxyl (nhóm axít). Trong hóa sinh, thuật ngữ này còn để chỉ alpha axít amin:

trúc bậc 1 vẫn giữ nguyên làm cho tính chất của protein bị thay đổi đó là hiện tượng
protein bị biến tính.
Tính chất của protein sau khi biến tính:
- Giảm khả năng hòa tan do làm lộ các nhóm kỵ nước
- Giảm khả năng giữ nước
- Mất các hoạt tính sinh học
- Tăng khả năng tấn công Protease
- Làm giảm sức căng bề mặt
- Tăng độ nhớt nội tại
- Mất khả năng kết dính
1.3.2. Các tác nhân gây biến tính
* Nhiệt độ
Nhiệt độ cao làm biến tính protein làm các mạch của protein bị dãn ra. Vận
tốc biến tính phụ thuộc vào nhiệt độ, vận tốc tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 10
0
C
như vậy năng lượng liên kết làm bền cấu trúc của protein là yếu. Sự biến tính của
protein do nhiệt độ phụ thuộc vào bản chất và nồng độ của protein, hoạt độ nước, độ
pH, bản chất của các ion có mặt trong đó.
Sau khi biến tính nhiệt độ phân huỷ của protein bị giảm xuống là do xuất
hiện các nhóm kỵ nước ở bề mặt phân tử làm cho các phân tử protein bị giãn mạch
và tập hợp lại. 15
* Biến tính do xử lý cơ học
Các xử lý cơ học như nhào trộn cũng làm biến tính protein do phá huỷ cấu
trúc xoắn  của protein.
* Biến tính bởi các tia UV, X
Dưới tác dụng của tia UV và tia X các axít amin mạch vòng bị đứt vòng và

0
G
=
n
G


0

Trong đó:
0
G
: là năng lượng vận chuyển tự do

n
: số gốc axít amin
Nếu

0
G
> 5.85 kJ thì dịch thuỷ phân có vị đắng


0
G
< 5.43 kJ thì dịch thuỷ phân không có vị đắng
1.3.6. Tính chất hóa học của protein và axít amin
Do trong phân tử protein có nhiều chuỗi polipeptid nên ta có thể chia thành
các nhóm phản ứng sau:
- Phản ứng của liên kết peptid

- Axít amin có khả năng kết tinh
- Bền với nhiệt độ khoảng 100
0
C đến 200
0
C trong 2 giờ
- Khá bền trong môi trường axít, không bền trong môi trường kiềm
(trong môi axít chỉ có trytophan bị phá huỷ)
- Tính chất đồng phân quang học (hoạt quang)
- Tất cả các axít amin đều có đồng phân quang học (trừ Glycin)
- Đa số các axít amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L - axít amin (chỉ ở
dạng này thì các axít amin giá trị dinh dưỡng con người và động
vật).
1.4. Tổng quan về các phương pháp định lượng protein và axít amin
Các phương pháp thông thường định lượng axít amin dựa chủ yếu vào sự có
mặt của nitơ trong phân tử axít amin. Vì khối lượng phân tử của các axít amin khác
nhau, nên kết quả thường biểu thị bằng nitơ axít amin.
1.4.1. Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl [9]
Phương pháp định lượng nitơ toàn phần đơn giản và chính xác là phương
pháp Kjeldahl. Thực phẩm được vô cơ hóa bằng H
2
SO
4
đậm đặc có chất xúc tác.
Sau khi vô cơ hóa, nitơ tồn tại ở dạng muối amoni sunfat (NH
4
)
2
SO
4