Bộ y tế
Viện dinh dỡng
===== =====
Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện
Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) tối u hoá các điều kiện
phân tích một số acid amin trong cá Cơ sở quản lý: Cấp cơ sở
Chủ nhiệm đề tài: Thạc sỹ Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện: Khoa Hóa - ATVSTP

5750
05/4/2006


II. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Tìm các điều kiện tối u để phân tích acid amin trong cá bằng
phơng pháp sắc ký lỏng cao áp.
2.2. áp dụng và ổn định phơng pháp phân tích một số acid amin trên 5
loại cá nớc biển và 5 loại cá nớc ngọt thông dụng trên thị trờng phục vụ
cho khảo sát nguồn thực phẩm dầu acid amin, đặc biệt trong cá của Việt Nam.
III. Phơng pháp nghiên cứu
3.1. Hoá chất thuốc thử
Tất cả các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại hoá chất tinh khiết phân
tích. Acetonitril, natri borat, acid clohydric của hãng Merk (Đức), chất dẫn
suất 6-aminoquinoline, hỗn hợp chuẩn 17 acid amin của hãng Waters (Mỹ),
chất chuẩn đơn từng acid amin của hãng Prolabo (Pháp).
3.2. Hệ thống sắc ký lỏng
Hệ thống sắc ký lỏng đợc sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là
hệ thống acid amin với các detector PAD 2996, huỳnh quang 2475 và bộ bơm
mẫu tự động của hãng Water (Mỹ). Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid
amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18
(150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng Water. Thành phần pha động gồm đệm
borat, acetonitril, nớc cất tinh khiết chạy theo gradie. Tốc độ dòng là
1ml/phút và nhiệt độ cột là 35
o
C. Các acid amin đợc định lợng bằng
detector huỳnh quang với bớc sóng kích thích 340nm và bớc sóng phát xạ
450nm.
3.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) đợc pha từ dung dịch có chứa 2,5
mmol/àl cho tất cả các amino acid và 1,25 mmol/àl đối với cystine trong HCl
20 mmol để đợc dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100pmol/àl đối với 17
acid amin và 50 pmol/àl đối với cystein. Dung dịch chuẩn làm việc đợc bảo
quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -20

HCl 20 mmol
Để n
g
uội, đuổi HCl d tron
g
môi
trờng chân không
ủ ở nhiệt độ thích hợp
125
o
C
Cho vào ống nghiệm thành dày
+ HCL 15%
Cân chính xác 1g mẫu đã xử lý 3
IV. Kết quả và bàn luận
4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích
4.1.1. Khảo sát các loại dẫn suất acid amin
Để xác định đợc một số acid amin trong thực phẩm dựa trên những
điều kiện thí nghiệm sẵn có của phòng thí nghiệm Viện Dinh dỡng, chúng tôi
đã tiến hành dẫn suất các acid amin chuẩn bằng OPA (ortho-phtalaldehyt)
[hình 1] và dẫn suất bằng AMQ (6-aminoquinolin) [hình 2], qua khảo sát
chúng tôi thấy dẫn suất bằng OPA chỉ tách đợc 15 acid amin, còn dẫn suất
bằng AMQ tách đợc 17 acid amin và NH
3
với độ ổn định cao, nên trong
nghiên cứu chúng tôi chỉ tiến hành dẫn suất bằng AMQ.
Hình 1: Tách 15 acid amin bằng dẫn suất OPA

0,5 1,0 99 1 0
18,0 1,0 95 5 0
19,0 1,0 91 9 0
29,5 1,0 83 17 0
33,0 1,0 0 60 40
36,0 1,0 100 0 0
65,0 1,0 0 60 40
100,0 1,0 0 60 40
Detector:
Sử dụng detector PDA và huỳnh quang là hai loại detector phổ biến, có
độ nhạy cao.
Qua khảo sát độ phát hiện của các acid amin bằng detecto huỳnh quang
nhạy hơn nhiều so với detector PAD, nên chúng tôi chọn sử dụng detector
PAD để định tính (kiểm tra lại từng dạng phổ của từng pic acid amin đơn lẻ)
còn để định lợng chúng tôi sử dụng detector huỳnh quang với bớc sóng kích
thích 340nm và bớc sóng phát xạ 450nm.
4.1.3. Các điều kiện thuỷ phân mẫu
Để thuỷ phân các sản phẩm chứa acid amin có nhiều phơng pháp, tuỳ
theo đặc tính của từng mẫu thử, tuỳ theo mục đích định tính hay định lợng.

5
+ Thuỷ phân bằng acid
+ Thuỷ phân bằng kiềm
+ Thuỷ phân bằng acid mạnh có mặt chất trao đổi ion
+ Thuỷ phân bằng men.
Trong đề tài nghiên cứu này, của chúng tôi sử dụng phơng pháp thuỷ
phân bằng acid. Trong quá trình thuỷ phân, yếu tố ảnh hởng nhiều nhất đến
kết quả của mẫu phân tích là nhiệt độ thuỷ phân và thời gian thuỷ phân.
* Khảo sát nhiệt độ ảnh hởng đến quá trình thuỷ phân:
+ Chuẩn bị dung dịch để khảo sát: Chuẩn bị một hỗn hợp chuẩn các

5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468
Hàm lợng tính
đợc (
àg/ml)
4,0946 4,532 5,3170 5,3008 5,2799 5,2997 5,3093
Hiệu suất 76,58 84,76 99,45 99,14 98,75 99,12 99,32
Kết quả bảng 2 cho thấy nhiệt độ từ 120
O
C hiệu suất phản ứng đã đạt
đợc là cao nhất. Nên chúng tôi chọn 125
O
C để làm nhiệt độ thuỷ phân mẫu.
* Khảo sát thời gian ảnh hởng đến quá trình thuỷ phân:
Để khảo sát ảnh hởng của thời gian đến khả năng thuỷ phân acid amin,
chúng tôi khảo sát trên một dãy chuẩn acid amin và mẫu cá đợc thêm chuẩn
nh nhau, môi trờng HCl 6N, nhiệt độ thuỷ phân nh nhau 125
o
C, nhng thời
gian thuỷ phân khác nhau (16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 giờ). Kết quả khảo sát chỉ
ra ở bảng 3.
Bảng 3: ảnh hởng của thời gian thuỷ phân đến hiệu suất thuỷ phân của
acid amin (Lysine) trong cá.

7
Các điều kiện 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian (giờ) 16 18 20 22 24 26 28
Hàm lợng biết
trớc (
àg/ml)
5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468

2
2


=

=
n
mtbmi
S
n
i
Độ lệch chuẩn đợc tính theo công thức sau:
Độ lệch chuẩn tơng đối đợc tính theo công thức sau:
RSD = s*100/X
TB

9
B¶ng 4: KÕt qu¶ vÒ ®é lÆp l¹i hµm l−îng trong mÉu c¸ qu¶
C¸c th«ng sè
1 2 3 4 5 6 N x
TB
S RSD
C¸c acid amin
% % % % % % % (%)
Aspartic acid 0,721 0,693 0,724 0,695 0,737 0,742 6 0,719 0,021 2,878
Serine 0,795 0,774 0,786 0,772 0,783 0,799 6 0,785 0,011 1,387
Glutamic acid 1,234 1,425 1,243 1,229 1,354 1,343 6 1,305 0,081 6,219
Glycine 1,860 1,778 1,693 1,689 1,723 1,892 6 1,772 0,087 4,892
Histidine 0,656 0,697 0,621 0,637 0,656 0,672 6 0,657 0,027 4,042

Cysteine 26,467 26,634 26,600 26,467 26,647 26,652 6 26,58 0,088 0,330
Tyrosine 26,743 27,117 27,087 26,632 27,132 27,133 6 26,97 0,225 0,836
Valine 27,916 27,891 27,783 27,816 27,816 27,822 6 27,84 0,051 0,184
Methionine 28,466 28,351 28,333 28,366 28,368 28,372 6 28,38 0,046 0,164
Lysine 31,124 30,999 30,991 31,024 31,018 31,023 6 31,03 0,048 0,155
Isoleucine 31,951 31,82 31,818 31,854 31,842 31,845 6 31,86 0,049 0,154
Leucine 32,561 32,416 32,414 32,454 32,439 32,450 6 32,45 0,054 0,168
Phenylalanine 34,026 33,845 33,836 33,886 33,872 33,891 6 33,89 0,069 0,203

10
B¶ng 6: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i hµm l−îng ®èi víi mÉu c¸ thu
C¸c th«ng sè
1 2 3 4 5 6 N x
TB
S RSD
C¸c acid amin
% % % % % % % (%)
Aspartic acid 0,926 0,918 0,897 0,889 0,918 0,931 6 0,913 0,017 1,816
Serine 0,865 0,859 0,837 0,871 0,902 0,856 6 0,865 0,021 2,483
Glutamic acid 1,652 1,598 1,701 1,689 1,634 1,657 6 1,655 0,037 2,257
Glycine 1,298 1,386 1,357 1,403 1,387 1,279 6 1,352 0,051 3,809
Histidine 1,125 0,987 1,131 0,989 0,984 1,024 6 1,040 0,070 6,704
NH3 0,122 0,109 0,123 0,115 0,128 0,132 6 0,122 0,008 6,920
Arginine 1,787 1,902 1,783 1,856 1,798 1,905 6 1,839 0,057 3,090
Threonine 1,105 1,231 1,304 1,098 1,159 1,236 6 1,189 0,082 6,878
Alanine 0,762 0,756 0,802 0,812 0,789 0,745 6 0,778 0,027 3,489
Proline 0,598 0,612 0,631 0,597 0,689 0,587 6 0,619 0,038 6,063
Cysteine 2,639 2,574 2,702 2,564 2,316 2,655 6 2,575 0,137 5,320
Tyrosine 0,112 0,131 0,135 0,132 0,121 0,121 6 0,125 0,009 7,004
Valine 0,658 0,678 0,598 0,654 0,702 0,579 6 0,645 0,047 7,324


11
4.2.3. Xác định độ thu hồi của phơng pháp
Dựa vào việc thêm mẫu chuẩn vào mẫu thực, cùng với việc tiến hành
làm mẫu thực không có mẫu chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu
hồi nh sau.
M
2
Độ thu hồi = x 100%
M
1
M
1
: acid amin (àg) biết trớc (thêm vào).
M
2
: acid amin (àg) xác định đợc.
Dựa vào đờng chuẩn làm song song với mẫu thực chúng tôi thu đợc
kết quả của mẫu thêm chuẩn và đem so với giá trị cho vào, mỗi nồng độ làm
3 mẫu và lấy kết quả trung bình. Ta có kết quả ở bảng 8.
Bảng 8: Độ thu hồi của Lysine trong mẫu cá quả
Mẫu số
1 2 3 4 5 6 7
M
1
((àg)
0,2035 0,407 0,168 0,337 1,687 2,361 3,036
M
2
(àg)

14 Methionine Met 0,44 0,29 0,70 0,83 0,50
15 Lysine Lys 0,11 0,16 0,32 0,58 0,52
16 Isoleucine lle 0,25 0,20 0,42 0,62 0,40
17 Leucine Leu 0,49 0,39 0,83 1,27 0,81
18 Phenylalanine Phe 0,84 0,52 1,18 1,42 0,77
Tổng 8,20 6,12 14,61 19,52 12,18
Kết quả tại Bảng 9 cho thấy, trong thành phần của cá có đủ các acid
amin cần thiết cho cơ thể. Trong 5 loại cá nớc ngọt cá Rôfi cho thấy có tổng
hàm lợng các acid amin cao nhất 19,52 g%, thấp nhất là cá trắm 6,12 g%.
Trong cá trôi acid aspartic, Serine, Glycine, hàm lợng quá nhỏ không xác
định đợc.
Hình 6: Sắc đồ các acid amin trong mẫu cá thu

13

Bảng 10: Kết quả phân tích acid amin trong cá nớc mặn (g/100g)
TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá thu Cá nục Cá chim trắng Cá hồng Cá cam
1 Aspartic acid ASP 0,91 1,00 0,77 0,97 0,81
2 Serine Ser 0,87 0,94 0,75 0,82 0,76
3 Glutamic acid Glu 1,66 1,71 1,40 1,67 1,35
4 Glycine Gly 1,35 1,40 1,40 1,08 1,36
5 Histidine His 1,04 2,18 0,65 0,05 1,05
6 NH3 NH3 0,12 0,13 0,09 0,12 0,11
7 Arginine Arg 1,84 1,99 1,72 1,62 1,63
8 Threonine Thr 1,19 1,14 0,88 0,89 0,90
9 Alanine Ala 0,78 0,78 0,65 0,68 0,68
10 Proline Pro 0,62 0,63 0,57 0,53 0,60
11 Cysteine Cys 2,58 3,03 0,17 2,22 2,19
12 Tyrosine Tyr 0,13 0,12 0,87 0,09 0,11
13 Valine Val 0,64 0,76 0,51 0,60 0,57

Qua kết quả phân tích acid amin trong 10 loại cá (5 loại nớc ngọt, 5 loại
nớc mặn) cho thấy:
Trong cá nớc ngọt hàm lợng tổng acid amin từ 6,12- 19,52 g/100g, cá
Rôfi có tổng hàm lợng các acid amin cao nhất (19,52 g%), thấp nhất là cá
trôi 8,2 g%.
Hàm lợng tổng các acid amin trong cá nớc mặn nằm trong khoảng 13-
21g%, không có loại acid amin nào không xác định thấy. Cá nục cho hàm
lợng acid amin cao nhất 20,74 g%, sau đó là cá thu 18,20 g%, thấp nhất là cá
chim trắng 13,94 g%.
Nhìn chung hàm lợng acid amin trong cá nớc mặn cao hơn trong cá
nớc ngọt. Nh vậy ăn cá là rất tốt cho cơ thể, không chỉ là một nguồn thực
phẩm cung cấp hàm lợng protein cao mà chất lợng của protit trong thịt cá là
rất tốt. Đặc biệt hàm lợng cholesterol trong cá là không đáng kể, mỡ cá giúp
ngăn ngừa đợc rất nhiều bệnh tật.
VI. khuyến nghị
Nhằm nâng cao chất lợng dinh dỡng của cuộc sống góp phần đảm bảo
sức khoẻ ngời tiêu dùng chúng tôi có một vài kiến nghị sau:
Tiếp tục phân tích xác định hàm lợng các acid amin trong các đối tợng
thực phẩm khác để cung cấp số liệu hoàn thiện Bảng thành phần Việt Nam.
Giúp tuyên truyền các loại thực phẩm chất lợng cho ngời tiêu dùng. Khoa Hoá - ATVSTP
TS. Hà Thị Anh Đào
Hà nội, ngày 26 tháng 12 năm 2005
Chủ nhiệm đề tài


amperometric detection method for the evaluation of biogenic in food
of vegetable or animal origin and in fermented foods, Journal of
Chromatography A, 798, p. 109-116
9. Tyson, Don (1999), Metabolism and Analysis acid amins, Interpretation
Guide.