Phụ lục 1
Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ
Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao định lợng nồng độ thuốc chống lao
trong huyết tơng bệnh nhân lao
Chủ nhiệm đề tài: TS BS Lê Thị Luyến
TS DS Nguyễn Thị Liên Hơng
Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Dợc Hà Nội

Chủ nhiệm đề tài: TS BS Lê Thị Luyến
TS DS Nguyễn Thị Liên Hơng
Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Dợc Hà Nội
Cấp quản lý: Bộ Y Tế
Thời gian thực hiện : từ tháng 12/2007 đến tháng 12/2010
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 460 triệu đồng Năm 2010
i

mục lục

Trang
Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt v
Báo cáo thống kê kết quả thực hiện đề tài KHCN cấp Bộ vi
Bản tự đánh giá tình hình thực hiện đề tài và những đóng góp mới
của đề tài KHCN cấp Bộ
xiv
Đặt vấn đề
1
Phần 1: Tổng quan
1.1. Phơng pháp định lợng RMP, INH, PZA trong huyết

2.2.1. Nguyên liệu, hoá chất, dung môi 20
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị 20
2.2.3. Dung dịch chuẩn 21
2.2.4. Dụng cụ lấy máu và vận chuyển mẫu 21
2.3. Phơng pháp nghiên cứu
21
2.3.1. Xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng RMP,
INH, PZA trong huyết tơng
21
2.3.1.1. Xây dựng phơng pháp định lợng 21
2.3.1.2. Thẩm định phơng pháp 22
2.3.2. Khảo sát nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tơng
bệnh nhân lao
25
2.3.2.1. Thiết kế nghiên cứu 25
2.3.2.2. Phơng pháp tiến hành 26
2.3.3. Phơng pháp thống kê, xử lý số liệu 28
Phần 3: Kết quả nghiên cứu
3.1. Xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng
29
3.1.1. Xây dựng phơng pháp định lợng 29
3.1.1.1. Phơng pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết
tơng
29
3.1.1.2. Chơng trình sắc ký 30
3.1.2. Thẩm định phơng pháp định lợng 32
3.1.2.1. Tính chọn lọc 32
3.1.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính 35
3.1.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lợng 36
3.1.2.4. Độ chính xác 37

trị
55
Phần 4: Bàn luận
4.1. Phơng pháp định lợng RMP-INH-PZA trong huyết
tơng
59
4.1.1. Phơng pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết tơng 59
4.1.2. Phơng pháp phân tích 60
4.1.3. Thẩm định phơng pháp phân tích 61
4.2. Nồng độ RMP, INH, PZA huyết tơng bệnh nhân ở thời
điểm 2h sau uống thuốc
63
iv

4.2.1. Nồng độ trung bình RMP, INH, PZA ở thời điểm 2h sau
uống thuốc
63
4.2.2. Phân bố tỷ lệ bệnh nhân theo phạm vi nồng độ điều trị 65
4.2.3. Các yếu tố liên quan đến nồng độ RMP, INH, PZA
huyết tơng
69
4.2.4. ảnh hởng của nồng độ thuốc tới đáp ứng 2 tháng đầu
điều trị
72
*Những ứng dụng bớc đầu và những hạn chế của nghiên cứu 75
Kết luận
77
Đề xuất
79


- Alanin aminotransferase
AST
- Aspartat transaminase
AUC
- Diện tích dới đờng cong nồng độ huyết tơng - thời gian
(Area Under the Curve of Plasma Concentration - Time)
CDC
- Trung tâm Kiểm soát và dự phòng bệnh tật Mỹ
(Center for Diseases Control and Prevention)
Cmax
- Nồng độ tối đa của thuốc trong huyết tơng
CTCLQG
- Chơng trình chống lao quốc gia
E, EMB
- Ethambutol
FDA
- Cơ quan quản lý Thực phẩm Dợc phẩm Mỹ (Food and Drug
Administration)
FDC
- Thuốc viên hỗn hợp cố định liều (Fixed Dose Combination)
H, INH
- Isoniazid
HPLC
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
R, RMP
- Rifampicin
S, SM
- Streptomycin
t

2. Chủ nhiệm đề tài:
1. Họ và tên: Lê Thị Luyến
Ngày, tháng, năm sinh: 22/2/1967 Nam/ Nữ: Nữ
Học hàm, học vị: Tiến sĩ Y học
Chức vụ: chuyên viên chính
Điện thoại: Tổ chức: 62732249 Nhà riêng: 37846918 Mobile:
0913597423
Fax: 6 2732243 E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Vụ Khoa học và Đào t
ạo, Bộ Y tế
Địa chỉ cơ quan: 138A Giảng Võ, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số 21 Lô 4A Trung yên 10, Q. Cầu Giấy, Hà Nội
2. Họ và tên: Nguyễn Thị Liên Hương
Ngày, tháng, năm sinh: 06/7/1974 Nam/ Nữ: Nữ
Học hàm/học vị: Tiến sỹ Dược học
Chức vụ : Trưởng bộ môn Dược lâm sàng ĐH Dược Hà Nội
Điện thoại: (CQ)/ 04.9330771 (NR)/ 04.8586359 Mobile: 0904308406
Fax: E-mail:
Địa chỉ cơ quan: Trường Đại học Dược Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số 8 Ngõ 72 Chính Kinh, Nhân Chính, Thanh Xuân, Hà
Nội

3. Tổ chức chủ trì đề tài:
Tr−êng §¹i häc D−îc Hµ Néi
§iÖn tho¹i: 04 8255437 Fax: 04 9332332
E-mail:
§Þa chØ: 13 Lª Th¸nh T«ng – Hµ Néi
vii

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
207.5 207.5
0
207.5 207.5
0
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
160.2 160.2
0
160.2 160.2
0
3 Thiết bị, máy móc
0 0
0
0 0
0

Cụng vn gia hn thi gian
thc hin ti
Gia hn thc hin
n thỏng 1/2011

4. T chc phi hp thc hin ti, d ỏn:
S
TT
Tờn t chc
ng ký
theo Thuyt
minh
Tờn t chc
ó tham gia
thc hin
Ni dung
tham gia ch yu
Ghi chỳ*
1
Đại học
Dợc Hà
Nội
Đại học
Dợc Hà
Nội
- Xây dựng phơng
pháp định lợng các
thuốc trong huyết
tơng.
- Triển khai định lợng

nghiên cứu
- Lấy mẫu máu định
lợng
- Thu thập các dữ liệu
lâm sàng, cận lâm
sàng
- Theo dõi bệnh nhân
nghiên cứu.
- Xét nghiệm vi khuẩn
lao ix

5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:
Số
TT
Tên cá nhân
đăng ký theo
Thuyết minh
Tên cá
nhân đã
tham gia
thực hiện
Nội dung tham gia
chính
Sản phẩm chủ
yếu đạt được
1 TS Lê Thị Luyến
2 TS Nguyễn Thị Liên Hương

10 BS Chu ThÞ Minh**
11 BS Ph¹m ThÞ Ph−¬ng Nam**
12
DS CK1 Bµnh §øc L©m***
Lựa chọn bệnh nhân
nghiên cứu
Lấy mẫu và vận chuyển
huyết tương
Theo dõi diễn biến điều
trị
Thu thập dữ liệu trên
lâm sàng
**Thực hiện luận văn
cao học
***Thực hiện luận văn
chuyên khoa 2
- Thu thập đủ số
bệnh nhân nghiên
cứu
- Lấy đủ số mẫu và
vận chuyển theo
đúng điề
u kiện quy
định
- Thu thập các dưc
liệu của bệnh nhân
trên lâm sàng theo
quy định
- 2 luận văn thạc sĩ
Y học

Thc t t
c
Ngi,
c quan
thc hin
1
Xây dựng đề cơng nghiên cứu
Thiết kế biểu mẫu Khảo sát
nồng độ thuốc và theo dõi bệnh
nhân
7/2007
12/2007
7/2007
12/2007
Lê Thị Luyến
Nguyễn Liên HơngTập huấn cho các nghiên cứu
viên

12/2007 12/2007
Lê Thị Luyến
Nguyễn Liên Hơng

2
Xây dựng và thẩm định quy
trình định lợng INH và PZA
trong huyết tơng


Nam
Hoàng Thị Phợng
Nguyễn Văn Hng

5
- Bảo quản mẫu huyết tơng
- Định lợng INH, PZA, RMP
huyết tơng
05/2008
07/2009
05/2008
05/2010
6
Nhập dữ liệu, xử lý dữ liệu,
phân tích

7/2009
5/2010 -
10/2010
Nguyễn Liên Hơng
Nguyễn T. Kiều Anh
Vũ Đình Hoà
Nguyễn Tứ Sơn
Lờ T. Luyn
Phan Qunh Lan
Nguyn Thỳy Võn
Trịnh Trung Hiu
7 Vit Bỏo cỏo tng kt
8/2009
10/2009

S
TT
Tờn sn phm

Theo k hoch Thc t
t c
Ghi chỳ

1
Phơng pháp định
lợng INH trong huyết
tơng

2
Phơng pháp định
lợng PZA trong
huyết tơng
Phơng pháp đơn
giản, dễ thực
hiện, khả thi tại
Việt Nam. Đợc
thẩm định đầy đủ
về tiêu chuẩn theo
quy định của
FDA
Phơng pháp đơn
giản, dễ thực
hiện, khả thi tại
Việt Nam. Đợc
thẩm định đầy đủ

lao
Số liệu chính xác,
khoa học, mô tả đợc
thực trạng nồng độ
RMP, INH và PZA
trong huyết tơng
Số liệu chính xác,
khoa học, mô tả
đợc thực trạng
nồng độ RMP, INH
và PZA trong huyết
tơng

2
Báo cáo phân
tích
Phân tích về mối liên
quan của nồng độ
thuốc với các yếu tố
và liều điều trị
Phân tích về mối liên
quan của nồng độ
thuốc với các yếu tố
và liều điều trị
01Bỏo cỏo
tng hp
3
Bài đăng báo từ
kết quả nghiên
cứu

3 BS Nội trú
0

4 DS CKII
0 01
2010

2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
1. Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại được các nhà khoa học trên
thế giới khuyến cáo sử dụng trong định lượng nồng độ thuốc chống lao trong
huyết tương tại hầu hết các phòng nghiên cứu về dược động học và sinh khả
dụng của thuốc. Phương pháp định lượng chúng tôi xây dựng được trên cơ
sở
tham khảo các nghiên cứu khác trên thế giới đã công bố và nghiên cứu áp
dụng có thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam.
2. Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời RMP và PZA trong
huyết tương bằng phương pháp HPLC: phương pháp chiết đơn giản, phương
pháp phân tích hiệu quả, dễ áp dụng, định lượng được đồng thời RMP và PZA
trong cùng một pha động. Phương pháp định l
ượng đã được thẩm định đầy đủ
về các tiêu chuẩn theo yêu cầu của FDA về phương pháp định lượng thuốc
trong dịch sinh học.
3. Xây dựng được và thẩm định phương pháp định lượng INH trong dịch sinh
học. Thẩm định đầy đủ các tiêu chuẩn theo quy định của FDA về phương
pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học. Phương pháp định lượng đơn
giản, dễ thự
c hiện tại Việt Nam.
4. Ứng dụng kỹ thuật định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng HPLC đã
xây dựng được để khảo sát nồng độ thuốc trong huyết tương 285 bệnh nhân

người chủ trì…)
I Báo cáo định kỳ
Lần 1 2008 Thực hiện đúng theo tiến độ
II Kiểm tra định kỳ Thực hiện đúng theo tiến độ
Lần 1 2008
III Nghiệm thu cơ sở 2010

Chủ nhiệm đề tài

TS Lê Thị Luyến TS Nguyễn T.Liên Hương
Thủ trưởng tổ chức chủ trì

xiv

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KHCN cấp Bộ 1. Tên đề tài:
Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân lao
2. Chủ nhiệm đề tài:
TS BS Lê Thị Luyến – TS DS Nguyễn Thị Liên Hương
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội
4. Thời gian thực hiện: 12/2007 – 12/2010
5. Tổng kinh phí thực hiện Đề tài: 460 triệu đồng
Trong đó, kinh phí từ NSNN: 460 triệu đồng

76,3%, INH 49,4%, PZA 18,1%). Ngoài ra có một số bệnh nhân có
nồng độ thuố
c trong huyết tương cao hơn phạm vi điều trị (INH 10,8%,
PZA 13,8%).
4. Phân tích về mối liên quan giữa nồng độ thuốc trong huyết tương với
một số yếu tố liên quan về tình trạng bệnh tật và liều điều trị:
Bằng phương pháp phân tích tương quan đơn biến và phân tích
tương quan đa biến đa cho thấy nồng độ các thuốc chống lao có tương
quan thuận với liều
điều trị. Ngoài ra, yếu tố tuổi tương quan thuận với
nồng độ RMP, thể lao có tương quan thuận với nồng độ INH, đặc biệt ở
nhóm bệnh nhân lao màng phổi có nồng độ INH cao hơn so với nhóm
bệnh nhân lao phổi. Bệnh nhân nữ có nồng độ PZA cao hơn so với
nhóm bệnh nhân nam.
xvi

6.3. Công bố các kết qủa nghiên cứu trên các tạp chí khoa học y dược và
Hội nghị quốc tế:
- Đăng tải 05 bài báo trên Tạp chí Y học thực hành, Y học Việt Nam,
Báo cáo toàn văn đăng tải trên Proceeding của Hội nghị Dược Đông
Dương lần thứ 6 (2009)
- Báo cáo và đăng tải tóm tắt kết quả nghiên cứu tại các Hội nghị quốc
tế:
- Hội thảo quốc tế
về tối ưu hóa trị liệu bệnh lao tại Ấn Độ tháng 11
năm 2009 (International Symposium on optimization of inhaled
tuberculosis therapies and implications for Host - Pathogen
Interaction, New Dehli, India 3 - 5 November 2009)
- Hội nghị toàn cầu về bệnh lao và bệnh phổi lần thứ 41 tại Berlin
(Đức) tháng 11 năm 2010 (41

giản, khả thi. Ứng dụng kỹ thuật định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng
HPLC đã xây dự
ng được để khảo sát nồng độ thuốc trong huyết tương 285
bệnh nhân lao đang điều trị tại Việt Nam.
7.2. Về phương pháp nghiên cứu: Ngoài những nghiên cứu về nồng độ RMP
huyết tương chúng tôi thực hiện năm 2005, đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt
Nam về nồng độ cả 3 thuốc chống lao thiết yếu RMP, INH, PZA trong huyết
tương bệnh nhân lao.
7.3. Những đóng góp mớ
i khác:
Đóng góp trong đào tạo: các bác sĩ chuyên ngành lao, dược sĩ chuyên
ngành dược lâm sàng có hiểu biết sâu hơn về ứng dụng dược động học trong
điều trị.
Các kết quả của nghiên cứu này cũng giúp ích cho các chuyên gia về
bệnh lao thấy được nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương thấp hơn phạm
vi điều trị, góp phần đưa ra bằng chứng về nguyên nhân gia tăng bệ
nh lao và
tình trạng kháng thuốc lao. Ngoài ra, phân tích về ảnh hưởng của những yếu
tố cá thể đến nồng độ thuốc trong huyết tương bệnh nhân, từ đó ứng dụng
việc tối ưu hoá điều trị dựa trên nồng độ thuốc, cũng như đưa ra những vấn đề
xviii

cần nghiên cứu sâu hơn nhằm tìm ra các giải pháp điều trị, kiểm soát bệnh lao
thành công. Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2010
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
Nghiên cứu năm 2005 tại Việt Nam về nồng độ RMP trong huyết tơng
đã đa ra phơng pháp định lợng RMP huyết tơng, các thông tin về đánh
giá chất lợng RMP trong viên hỗn hợp có định liều và thực trạng nồng độ
RMP trong huyết tơng bệnh nhân[5],[6]. Trong khi đó điều trị bệnh lao
thờng phối hợp nhiều thuốc, nhất là các thuốc uống nh
RMP, PZA, INH là 2
các thuốc chống lao thiết yếu, có mặt trong các phác đồ điều trị bệnh lao. Do
đó nghiên cứu về nồng độ thuốc chống lao trong huyết tơng bệnh nhân cần
có dữ liệu nồng độ cả RMP, PZA, INH.
Định lợng nồng độ thuốc trong huyết tơng đòi hỏi các phơng tiện kỹ
thuật và phơng pháp phân tích phù hợp. Có nhiều phơng pháp định lợng
thuốc chống lao trong huyết tơng, nhng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) là phơng pháp phổ biến hơn cả do có độ chính xác cao, khoảng
thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận đợc. Trong điều kiện Việt
Nam hiện nay, máy HPLC tơng đối phổ biến, trong khi đó việc định lợng
nồng độ các thuốc chống lao RMP đã đợc chúng tôi xây dựng trong các
nghiên cứu trớc đây. Cùng với RMP, INH v PZA l các thuốc chống lao
thiết yếu dùng đồng thời trong phác đồ điều trị bệnh lao, cho đến thời điểm
chúng tôi tiến hành nghiên cứu này, cha có phơng pháp định lợng nồng độ
INH, PZA trong huyết tơng phù hợp với điều kiện hiện nay tại Việt Nam.
Những vấn đề đợc đề cập trên đây chính là lý do chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao định lợng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tơng bệnh nhân lao.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng rifampicin, isoniazid,
pyrazinamid trong huyết tơng bằng HPLC.
2. Khảo sát nồng độ rifampicin, isoniazid, pyrazinamid trong huyết tơng

định lợng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tơng cho độ chính xác cao
hơn. 4
Định lợng thuốc chống lao trong huyết tơng bằng HPLC đợc Tổ
chức Y tế thế giới (WHO) và Hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế (IUATLD)
khuyến cáo sử dụng trong đánh giá sinh khả dụng của RMP, INH, PZA, EMB
trong chế phẩm thuốc chống lao hỗn hợp chứa RMP [75]. Ngoài ra, một số tác
giả trên thế giới [37],[40],[77]

đã xây dựng phơng pháp định lợng thuốc
chống lao trong huyết tơng và dịch sinh học khác nhằm nghiên cứu dợc
động học, sinh khả dụng và theo dõi điều trị.

Nhìn chung các phơng pháp
định lợng RMP, INH, PZA trong dịch sinh học đợc áp dụng gần đây hầu
hết là sử dụng phơng pháp HPLC vì đây là loại máy tơng đối phổ biến ở các
phòng nghiên cứu, phơng pháp có độ chính xác cao, khoảng thời gian phân
tích hợp lý và chi phí chấp nhận đợc.
1.1.1. Phơng pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết tơng
Để chiết hoạt chất từ huyết tơng phục vụ cho định lợng thuốc trong
huyết tơng bằng HPCL thờng sử dụng các phơng pháp sau:
- Phơng pháp chiết lỏng - lỏng: bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi.
Một số hỗn hợp dung môi đã đợc nghiên cứu để chiết RMP, INH, PZA
bao gồm dichloromethan - diethylether, tỉ lệ 2:3 (v/v) [77], diethylether:
diclomethane, tỉ lệ 2:1(v/v), acid tricloacetic 5% [72].
- Phơng pháp chiết lỏng - rắn: dùng cột chiết xuất pha rắn để chiết hoạt
chất. Mẫu đợc bơm vào cột chiết xuất pha rắn sau đó đợc rửa giải bằng
hệ dung môi thích hợp để tách hoạt chất. P.J. Smith, J. van Dyk, A.

Ct Pha ng Detector Thi
gian lu
(phỳt)
Cht
nh
lng
[64]
àBondapak C 18
(30 cm x 3,9 mm,
10 àm)
Methanol 0,05 M
ammonium formate
(65:35)
254 7
RMP
[26] Spherisorb C 8
(250 x 4,6 mm
I.D., 5 àm, )
Tiền cột: C8
Acetonitrile- 0,1% acid
trifluoroacetic (80:20)
270 3,9
RMP
[45]
Nova Pack C18
(250 mm x 4 mm,
4 àm)
Methanol- dung dịch
0,01 M Natri phosphat
pH 5,2 (65:35)